PHF10融合蛋白表达、抗体制备及其在胃癌中的表达的检测

目的:制备PHF10多克隆抗体,并检测胃癌细胞系和胃黏膜永生化细胞株GES-1中PHF10表达谱。方法:在大肠杆菌BL21中表达GST标签标记的PHF10融合蛋白,以纯化的PHF10重组融合蛋白为抗原制备兔PHF10多抗血清。进一步利用亲和纯化方法制备PHF10多克隆抗体;为确定PHF10抗体的特异性,通过Western blot检测瞬时表达的Flag-PHF10融合蛋白,同时以抗Flag单克隆抗体(mAb)作为对照;利用制备的抗体通过Western blot检测PHF10在GES-1和各种胃癌细胞系中的表达。结果:与PHF10特异性结合的抗体能够通过免疫法获得;利用制备的抗体检测到PHF10在各胃癌细胞系与GES-1之间表达差异有统计学意义。结论:获得了特异性抗PHF10抗体,用该抗体可以检测到胃癌细胞系中PHF10的表达,可能是一个新的肿瘤靶标。

PHF10磷酸化多克隆抗体的制备与其在胃癌细胞PHF10磷酸化水平检测中的应用

目的 制备PHD指蛋白 10（PHF10）磷酸化多克隆抗体并用于PHF10蛋白的研究,探讨其在胃癌发生发展中的作用与机制.方法 结构预测后应用固相法合成磷酸化多肽.应用磷酸化多肽免疫家兔得到多克隆抗体,并利用Dotblot方法进行此抗体特异性效价的鉴定,结果显示PHF10最低阳性检测浓度为7.8μg/L.利用PHF10磷酸化多抗对8株胃癌细胞和胃黏膜永生化细胞PHF10蛋白磷酸化水平进行检测,胃癌细胞株PH F10磷酸化水平明显高于胃黏膜永生化细胞GES-1.结果 制备出的PHF10蛋白磷酸化多克隆抗体效价较高,可用于磷酸化PHF10蛋白的鉴定.结论 此多克隆抗体可用于PHF10蛋白的研究.

miR-593-5p调控肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的机制

目的探讨微小RNA-593-5p(miR-593-5p)对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及作用机制。方法采用qPCR检测正常肝细胞HL7702和肝癌细胞系Hep3B、HepG2、SMMC-7721、Huh7中miR-593-5p和PHF10 mRNA表达。在SMMC-7721细胞中转染miR-593-5p,MTT法检测细胞增殖,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达。starBase软件结合双荧光素酶报告实验分析miR-593-5p和PHF10靶向关系。miR-593-5p和pcDNA-PHF10共转染,观察PHF10过表达对miR-593-5p过表达诱导的SMMC-7721细胞增殖、迁移、侵袭及PI3K/Akt信号通路的影响。结果miR-593-5p在肝癌细胞系Hep3B、HepG2、SMMC-7721、Huh7中表达下调(P<0.05),PHF10 mRNA表达上调(P<0.05)。miR-593-5p过表达明显降低SMMC-7721细胞24 h、48 h、72 h的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及CyclinD1、Vimentin、p-PI3K和p-Akt蛋白表达量(P<0.05),显著提高p21、E-cadherin蛋白水平(P<0.05),对PI3K和Akt蛋白表达无明显影响。miR-593-5p靶向调控PHF10表达。PHF10过表达逆转miR-593-5p过表达对肝癌SMMC-7721细胞增殖、迁移、侵袭、PI3K/Akt信号通路激活的抑制作用。结论miR-593-5p过表达通过靶向PHF10表达及抑制PI3K/Akt信号通路激活而抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭。

LINC00242与胰腺癌发生发展及预后的相关性分析

目的使用集成数据分析方法识别胰腺癌中的关键eRNA,并探讨其在胰腺癌预后及发生发展中的作用。方法首先使用PreSTIGE预测组织特异性增强子RNA的调控基因,构建eRNA-靶标对。用探索癌症lncRNA功能的交互式开放平台TANRIC研究来自癌症和肿瘤基因图谱(The cancer genome atlas,TCGA)的胰腺癌转录组数据和临床数据。结果确定了147个关键eRNA,其中与胰腺癌整体存活率最相关的eRNA是LINC00242(Kaplan-Meier对数秩检验,P<0.001),PHF10是其调控靶标(Spearman相关系数r>0.4,P<0.001)。另外1846个基因在胰腺癌中也与LINC00242有显著相关性(r>0.4,P<0.001),LINC00242主要通过突触信号转导等生物学过程及PI3K-Akt、MAPK等信号通路影响胰腺癌的发生发展(校正后的P<0.05)。结论LINC00242可能是胰腺癌中关键的预后相关eRNA,对临床结局具有积极影响,可预测胰腺癌的预后并作为其潜在的治疗靶标。