水稻phyC突变体叶绿素合成及光合荧光特性的研究

光敏色素是植物的重要感光器之一,在光形态建成过程中起重要作用,同时也参与调控叶绿素的合成。江苏省农业科学院利用CRISPR/Cas9技术敲除了南粳46中的PHYC,发现突变体抽穗期提前,而且相较于南粳46,其千粒重增加,但对其光合特性没有过多阐述。本研究以南粳46phyC突变体(phyC)与南粳46野生型(WT)为材料,利用光合仪、荧光仪分别测定2种水稻材料的光合参数、叶绿素荧光参数;测定水稻叶片的叶绿素含量、叶绿素合成前体物质含量,并进一步分析2种水稻材料中叶绿素合成相关基因的表达情况,以期对突变体的光合生理性能进行初步探究。结果表明,和WT相比,突变体phyC的叶绿素含量在孕穗期、齐穗期明显增加,但在灌浆期却显著下降;突变体phyC叶片叶绿素合成代谢中间产物5-氨基乙酰丙酸(ALA)、胆色素原(PBG)、尿卟啉原Ⅲ(UrogenⅢ)、原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)、镁原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)、原脱植基叶绿素(Pchlide)的含量均显著高于WT;在光合参数方面,phyC的净光合速率在孕穗期、齐穗期高于WT,在灌浆期低于WT;phyC的单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)、耗散的光能(DIo/RC)、捕获的光能(TRo/RC)、PSⅠ端还原电子的效率(REo/RC)、综合性能指数(以吸收为基础)(PIabs)在孕穗期、齐穗期均高于WT,而在灌浆期均低于WT;此外,phyC的叶绿素合成与降解相关基因的表达水平在3个生育期都有所上调。这表明敲除PHYC可以使得叶绿素合成及降解基因的表达量提高,从而使得在孕穗期和齐穗期叶绿素含量提高,荧光参数提高,最终导致光合速率提高。在灌浆期,phyC叶绿素的生物合成可能是在原脱植基叶绿素到叶绿素a的合成过程中受到阻抑,该过程需要光的参与,可能是由于PHYC的敲除使得在这个时期phyC对光照的吸收与利用能力有所下降。

花粉管通道和农杆菌介导植酸酶基因phyC对桑树的遗传转化

植酸酶可以促进单胃动物利用饲料中的植酸磷。桑叶中的含磷量较高,培育转植酸酶基因的桑树品种有利于桑叶饲料的开发利用。构建含中性植酸酶基因phyC的植物表达载体pCAMBIA-2300-phyC,利用花粉管通道结合农杆菌介导的方法将phyC基因导入红果1号×育2号杂交桑种子,1 301粒杂交桑种子经卡那霉素抗性筛选和大田播种共获得154株桑苗,其中11株经PCR鉴定为阳性的phyC基因转化桑苗。该转基因方法具有操作简便、转化范围较广的特点,获得的转phyC基因桑树植株可作为饲料桑品种选育的素材。

Bacillus subtilis WHNB02植酸酶phyC基因的克隆及序列分析

采用PCR法获得产植酸酶芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)WHNB0 2株植酸酶的全长phyC基因 ,并将其克隆到pUC18-T载体。序列分析表明该基因全长 115 2bp ,编码一个 383个氨基酸的多肽 ,信号肽切割位点位于第 2 6个氨基酸残基之后。系统进化树表明 ,来源于 7株芽孢杆菌的植酸酶在遗传上分为两大类。将BacillussubtilisWHNB0 2植酸酶phyC基因序列及其氨基酸序列在GenBank中登录 ,登录号分别为AF2 2 0 0 75和AA0 4 3434.1。

植酸酶phyC基因表达载体的构建及其在E.coli中的表达

以phyC -PUC18-T为模板 ,扩增出枯草芽孢杆菌中性植酸酶phyC基因 ,克隆至T载体中 ,经酶切鉴定及序列测定后重组入谷胱甘肽S -转移酶融合表达载体pGEX - 4T - 1中 ,转化大肠杆菌JM10 9,重组质粒在宿主JM10 9中有较好的稳定性 ,在无选择压力条件下传代 4 5次基本保持稳定 ,0 1mMIPTG诱导后酶活测定结果表明 ,表达产物具有生物学活性。SDS -PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带 ,相对分子量 (Mr)为 6 9kD ,30℃诱导 3h后 ,表达的目的蛋白量占菌体总蛋白的 4 7 4 %。

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.

2个玉米光敏色素C基因的转录丰度对多种光质处理的响应

【目的】通过NCBI数据库获得2个玉米PHYC及相关数据,并进行相关生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析2个玉米PHYC在玉米各器官的转录丰度,以及其转录丰度对多种光质处理、黑暗到各种光质转换和光周期处理(长日照和短日照)的响应,为研究玉米PHYC在玉米幼苗去黄化与开花期的调控机制奠定基础。【方法】采用玉米B73自交系为研究材料,通过RT-PCR分别对Zm PHYC1和Zm PHYC2的全长ORF序列进行克隆;借助相关软件对其进行生物信息学分析,利用q RT-PCR分析这两个基因在玉米各器官中的转录丰度,及其转录丰度对各种光照处理的响应。【结果】Zm PHYC1和Zm PHYC2的全长ORF均为3 408 bp,编码1 135个氨基酸基序,分子量分别为126.14和126.07 k D。生物信息学分析表明,玉米phy C蛋白可以分为6个功能区段:节奏周期蛋白—Ah核转运接受蛋白—专一蛋白区段(Per-Arnt-Sim,PAS)、c GMP受激磷酸二酯酶区段(GAF)、色素区段(PHY)和PAS相关区段(PRD,包含2个PAS区段)、组氨酸激酶A区段和组氨酸激酶ATP酶区段,但是Zmphy C2在PRD区段仅有一个PAS区段。氨基酸水平的系统发育树分析表明,Zmphy C1和Zmphy C2与禾本科物种phy C有很高的一致性,且与甘蔗和高粱phy C的亲缘关系较近。q RT-PCR分析表明,Zm PHYC1和Zm PHYC2的表达在根和叶中的转录丰度均较高,同时对持续蓝光和白光响应强烈;在黑暗到各种光质转换处理中,这两个PHYC的表达模式相似。在黑暗转到远红光、红光、蓝光和白光的0.5 h,Zm PHYC1和Zm PHYC2的转录表达均急剧上升,随后迅速下降到自身起始黑暗时的水平以下,并上下波动。这两个基因对长日照和短日照的光周期处理也能积极响应,在长日照条件下,2个Zm PHYC出现了极其相似的表达模式,均在光照和黑暗阶段各出现1个峰值;在短日照条件下,这两个基因的表达模式差异较大,Zm PHYC1的峰值出现在进入黑暗后6 h,而Zm PHYC2的峰值出现在进入光照阶段2 h。【结论】玉米phy C蛋白可以分成6个功能区段,但是Zmphy C2在PRD区段仅具有一个PAS相关区段。2个玉米PHYC转录丰度具有组织特异性。在各种光质处理中,Zm PHYC1和Zm PHYC2的表达模式相近,可能二者存在功能冗余,在转录水平上前者的丰度高于后者,推测Zm PHYC1在玉米中起更重要的作用,并且可能二者在功能上存在分工。Zm PHYC1和Zm PHYC2对各种光质和光周期处理均有较强的响应,推测二者在调控玉米光形态建成和开花中具有重要作用。