白术内酯Ⅰ调节PI3K/Akt/mTOR信号通路对肺脾气虚反复呼吸道感染模型大鼠肺损伤的影响

目的探讨白术内酯Ⅰ调节磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路对肺脾气虚反复呼吸道感染(RRTI)模型大鼠肺损伤的影响。方法将84只大鼠随机分为对照组、模型组、白术内酯Ⅰ低剂量组、白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组、胰岛素样生长因子1(IGF-1)组、白术内酯Ⅰ高剂量+IGF-1组,每组12只。除对照组外,其他组大鼠均采用疲劳结合饮食失节联合刨花加烟叶烟熏的方法构建肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠模型,模型复制成功后,进行给药处理,给药每天1次,持续6周。动物肺功能仪检测大鼠呼气峰流速(PEF)、1秒用力呼气容积(FEV_(1))、用力肺活量(FVC)的变化;检测大鼠肺湿干质量比值变化;HE染色检测各组大鼠肺组织病理变化;ELISA法检测大鼠肺组织中白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western Blot法检测大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠PEF、FEV_(1)、FVC降低(P<0.01),肺湿干质量比值升高(P<0.01);肺组织肺泡间隔变大,肺间质水肿且存在大量炎性细胞浸润;肺组织中IL-6、TNF-α、MDA水平升高(P<0.01),SOD活性降低(P<0.01);肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达升高(P<0.01)。与模型组比较,白术内酯Ⅰ低剂量组、白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠PEF、FEV_(1)、FVC升高,肺湿干质量比值降低(P<0.01);肺组织病理损伤减轻;肺组织中IL-6、TNF-α、MDA水平降低,SOD活性升高(P<0.01);肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达降低(P<0.01),IGF-1组对应指标变化趋势与上述相反(P<0.01)。与白术内酯Ⅰ高剂量组比较,白术内酯Ⅰ高剂量+IGF-1组大鼠PEF、FEV_(1)、FVC降低,肺湿干质量比值升高(P<0.01);肺组织病理损伤加剧;肺组织中IL-6、TNF-α、MDA水平升高,SOD活性降低(P<0.01);肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论白术内酯Ⅰ可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路改善肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤。

温阳解郁方通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对抑郁小鼠前额皮质自噬的影响

目的探讨温阳解郁方对抑郁小鼠前额皮质自噬水平的影响及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路的调控作用。方法仔鼠出生后随机分为空白对照组12只、模型组60只,模型组采用母婴分离联合慢性束缚应激制备抑郁小鼠模型,离乳后随机分为模型组,温阳解郁方低、中、高剂量(8.35、16.70、33.40 g·kg^(-1))组和氟西汀(2.6 mg·kg^(-1))组,于离乳第21天至束缚完成第111天给予药混饲料干预。采用糖水偏好、悬尾实验和旷场实验评价小鼠焦虑抑郁行为;免疫组化法检测小鼠前额皮质泛素结合蛋白(p62)的表达;免疫荧光组织化学法检测自噬效应蛋白(Beclin-1)、自噬微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白的表达;Western Blot和Real-time PCR法检测PI3K/Akt/m TOR信号通路及自噬相关指标的蛋白和m RNA表达水平。结果行为学实验中,与正常对照组比较,模型组小鼠糖水偏好度、中央区活动时间及中央穿越次数明显降低,悬尾不动时间明显升高(P<0.01);与模型组比较,温阳解郁方中、高剂量组和氟西汀组小鼠糖水偏好度、中央区活动时间及中央穿越次数明显增加,悬尾不动时间明显缩短(P<0.05,P<0.01)。免疫组化、免疫荧光、Western Blot和Real-time PCR实验中,与正常对照组比较,模型组小鼠PI3K/Akt/m TOR信号通路和p62的蛋白及m RNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01)、Beclin-1和LC3的蛋白及m RNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,温阳解郁方中、高剂量组和氟西汀组小鼠PI3K/Akt/m TOR信号通路和p62的蛋白及m RNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01),Beclin-1和LC3的蛋白及m RNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论温阳解郁方可能通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,降低前额皮质神经元和胶质细胞自噬水平,进而发挥抗抑郁疗效。

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨蚕沙提取物对糖尿病胃轻瘫大鼠Cajal间质细胞的影响

目的:基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路探讨蚕沙提取物对糖尿病胃轻瘫(DGP)大鼠的治疗作用机制。方法:将105只大鼠随机选取15只作为空白组,制备DGP大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、蚕沙提取物高、中、低剂量组(3.2、1.6、0.8 g·kg^(-1))及莫沙必利组(1.5 mg·kg^(-1)),每组12只,灌胃4周。检测大鼠胃排空率、随机血糖,苏木素-伊红(HE)染色观察胃窦部形态变化,免疫组化分析c-Kit表达,原位末端标记法(TUNEL)染色观察Cajal间质细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PI3K、磷酸化(p)-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR的蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组胃排空率显著降低(P<0.01),胃窦部腺体结构破坏,c-Kit表达显著减少(P<0.01),Cajal间质细胞(ICC)凋亡增加;与模型组比较,蚕沙提取物高、中、低剂量组及莫沙必利组胃排空率均显著升高(P<0.01),胃窦腺体结构逐渐紧密,ICC凋亡减少,其中蚕沙提取物高剂量组c-Kit表达明显升高(P<0.05)。经Western blot检测,与空白组比较,模型组p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K及p-mTOR/mTOR蛋白表达均升高(P<0.01);与模型组比较,蚕沙提取物高剂量组p-Akt/Akt蛋白表达降低(P<0.01),蚕沙提取物中、低剂量组及莫沙必利组p-PI3K/PI3K蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),蚕沙提取物低剂量组p-mTOR/mTOR蛋白表达降低(P<0.05)。在随机血糖方面,与空白组比较,模型组随机血糖显著升高(P<0.01);与模型组比较,蚕沙提取物高、中剂量组随机血糖明显降低(P<0.05);与莫沙必利组比较,蚕沙提取物高剂量组p-Akt/Akt蛋白表达降低(P<0.05),蚕沙提取物高、中、低剂量组p-PI3K/PI3K蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:蚕沙提取物可提高DGP大鼠胃排空率、减轻ICC的凋亡,同时降低随机血糖,其中蚕沙提取物高剂量组抑制ICC凋亡疗效显著,其作用机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

淫羊藿苷经PI3K/Akt/mTOR通路调控激素对骨微血内皮细胞自噬的影响

目的:探讨淫羊藿苷(ICA)介导磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路对激素性骨微血管内皮细胞(BMECs)自噬的影响。方法:从人工全髋关节置换术中获得的股骨头分离培养BMECs,并通过免疫荧光染色法鉴定细胞种类。实验细胞分为空白组、激素组(100 mg·L^(-1)氢化可的松)、ICA组(100 mg·L^(-1)氢化可的松+6.7×10^(-3)mg·L^(-1)ICA)及雷帕霉素组(100 mg·L^(-1)氢化可的松+6.7×10^(-3)mg·L^(-1)ICA+1 mg·L^(-1)雷帕霉素),使用100 mg·L^(-1)的氢化可的松诱导BMECs自噬,运用荧光染色观察不同时间节点下BMECs自噬出现的峰值,蛋白免疫印迹法(Western blot)分析各组自噬及PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白表达,以电镜观察各组细胞自噬小体及自噬溶酶体的产生。结果:100 mg·L^(-1)氢化可的松可诱导BMECs自噬并在5 h左右出现自噬峰值,但随着干预时间的进一步增加,自噬峰值下降。与空白组比较,激素组细胞膜破坏,细胞器排列紊乱,可见大量自噬小体及自噬溶酶体;与激素组比较,ICA组细胞膜较为完整,细胞器排列较为稀疏,自噬小体数量及自噬溶酶体数量低于激素组;与ICA组比较,雷帕霉素组细胞膜破坏,细胞器排列紊乱,有较多自噬小体及自噬溶酶体。与空白组比较,激素组自噬相关蛋白4B(Atg4B)、人微管相关蛋白/轻链3B(LC3B)、p62表达显著提高(P<0.01);与激素组比较,ICA组LC3B、Atg4B、p62、自噬效应蛋白-1(Beclin-1)表达显著下降(P<0.01);与ICA组比较,雷帕霉素组Atg4B、p62表达显著升高(P<0.01);与空白组比较,激素组磷酸化(p)-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR表达显著降低(P<0.01);与激素组比较,ICA组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR显著提高(P<0.01);与ICA组比较,雷帕霉素组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR表达显著降低(P<0.01);与空白组比较,激素组泛素化水平显著降低(P<0.01);与激素组比较,ICA组泛素化表达显著提高(P<0.01);与ICA组比较,雷帕霉素组泛素化水平显著下降(P<0.01)。结论:激素所诱导的BMECs自噬具有时间依赖性,ICA对激素诱导的BMECs的自噬具有抑制作用,且该作用可能与调控PI3K/Akt/m TOR通路有关。

盐酸小檗胺通过调控自噬和PI3K/Akt/mTOR信号通路改善索拉非尼耐药的机制

目的:研究盐酸小檗胺改善肝癌细胞对索拉非尼耐药的作用及相关机制。方法:以1.25μmol·L^(-1)索拉非尼为起始浓度采用药物浓度递增法筛选索拉非尼耐药细胞株SMMC-7721/S,SMMC-7721和SMMC-7721/S分别设置0、2.5、5、10、15、20μmol·L^(-1)索拉菲尼给药组,采用细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK-8)实验检测半抑制浓度(IC50)、计算耐药指数(RI);采用蛋白免疫印迹法(Western blot)比较SMMC-7721和SMMC-7721/S细胞自噬和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路相关蛋白表达差异。设置5μmol·L^(-1)盐酸小檗胺与2.5、5、10μmol·L^(-1)索拉非尼单独和联合组,进行CCK-8实验检测各组对肝癌细胞SMMC-7721/S细胞生长的影响;分别设置5μmol·L^(-1)小檗胺与5μmol·L^(-1)索拉非尼单独和联合组,进行平板克隆形成实验检测各组对SMMC-7721和SMMC-7721/S细胞增殖的影响;分别设置5μmol·L^(-1)盐酸小檗胺、0.1μmol·L^(-1)自噬抑制剂巴氟洛霉素(Baf)组,进行免疫荧光实验检测溶酶体酸化标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)及LysoTracker探针检测SMMC-7721细胞溶酶体酸化情况;设置盐酸小檗胺5μmol·L^(-1)、Baf 0.1μmol·L^(-1)设置0、2.5、5、10μmol·L^(-1)盐酸小檗胺组及0.1μmol·L^(-1)Baf组,进行Western blot实验比较各组对SMMC-7721细胞自噬和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。结果:CCK-8实验表明索拉非尼对SMMC-7721/S细胞24 h的IC50为9.56 mol·L^(-1)(P<0.01),对SMMC-7721细胞24 h的IC50为7.99 mol·L^(-1),耐药指数RI为1.20(P<0.01),为轻度耐药;Western blot实验表明,对比SMMC-7721细胞,SMMC-7721/S细胞内磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3Ⅱ)表达增加,螯合体1(p62)蛋白表达显著减少(P<0.01),化蛋白激酶B(Akt)蛋白表达水平差异无统计学意义。CCK-8实验和平板克隆形成实验表明盐酸小檗胺与索拉非尼联合使用具有协同作用(Q>1.15),盐酸小檗胺能够改善肝癌细胞对索拉非尼的部分耐药性。免疫荧光检测LC3结果显示,盐酸小檗胺和自噬抑制剂Baf显著增加了SMMC-7721中自噬小体LC3的数量,LysoTracker探针检测结果显示,盐酸小檗胺显著抑制SMMC-7721细胞溶酶体酸性程度(P<0.01),表明细胞自噬水平被抑制。Western blot实验显示,在SMMC-7721细胞中,盐酸小檗胺能够进一步增强索拉非尼下调p-mTOR、p-Akt蛋白表达水平的作用,对Akt蛋白无明显改变;在SMMC-7721/S细胞中,盐酸小檗胺能够抑制索拉非尼诱导的p-mTOR蛋白表达相对于野生株的增加,共同降低p-Akt蛋白,对Akt总蛋白无明显影响。结论:盐酸小檗胺能够改善肝癌细胞对索拉非尼的耐药性,机制可能与其抑制细胞自噬和PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

牛病毒性腹泻的诊断与防控

牛病毒性腹泻,又称牛病毒性腹泻-粘膜病,是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起牛的一种临床上呈多类型表现的传染病。急性感染牛表现高热、流涎、腹泻、消化道粘膜病、白细胞减少、反刍停止、生产性能下降;孕牛主要表现流产、产死胎或畸形胎。母牛怀孕早期感染BVDV可以通过胎盘感染胎儿,引起新生犊牛呈现免疫耐受与持续性感染(PI)。持续性,感染动物为BVDV抗体阴性,但可以长期带毒与排毒,是导致本病流行最重要的传染源。有关本病的诊断,应遵循综合性诊断原则,包括流行病学与临床诊断、病理学诊断以及实验室诊断。其中,实验室诊断方法又包括病毒分离、中和试验、琼脂扩散实验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验(IFA)、免疫组化试验、RT-PCR、Real-timePCR等多种检测技术。有关本病的防控,主要采取强化饲养管理、检测与淘汰PI动物、疫苗免疫接种等综合性防控措。

五味温通除痹胶囊促进佐剂性关节炎大鼠滑膜组织细胞自噬活性及机制

目的观察五味温通除痹胶囊对佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜组织中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素白蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路关键基因表达的影响,探讨其防治类风湿性关节炎的可能机制。方法SD大鼠,随机分为正常组、模型组、(0.80、1.60、3.20)g/kg五味温通除痹胶囊治疗组、40mg/kg雷公藤多甙片治疗组,每组10只。除正常组外,采用Freund完全佐剂诱导AA大鼠模型。致炎后第12天灌胃给药,每天1次,连续12d。实验结束后,取非致炎侧踝关节,HE染色观察病理组织学改变,实时定量荧光PCR测定滑膜组织中PI3K、AKT、mTOR、p70s6、beclin1mRNA的水平,免疫荧光组织化学染色和Westernblot法检测滑膜组织中PI3K、AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)、mTOR、p-mTOR、p70s6、p-p70s6、beclin1蛋白的表达。结果与模型组相比,(1.60、3.20)g/kg五味温通除痹胶囊治疗组不仅可减轻AA大鼠踝关节病理组织学损伤程度,还可降低PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70s6、p-p70s6的水平,提高beclin1的水平。结论五味温通除痹胶囊可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,上调AA大鼠滑膜细胞自噬活性,减轻关节软骨损伤。

黄芪甲苷通过PI3K/Akt/mTOR通路诱导鼻咽癌细胞自噬和凋亡

目的:探讨黄芪甲苷对鼻咽癌细胞自噬与凋亡的影响及潜在分子机制。方法:在体外实验中,通过单丹磺酰戊二胺(MDC)染色和透射电镜观察黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对鼻咽癌细胞自噬的影响。在体内实验中,建立裸鼠移植瘤模型后采用免疫荧光法(IF)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组别中自噬和凋亡情况的变化及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路关键蛋白的表达变化。结果:与空白组比较,不同浓度AS-Ⅳ(5、10、20μmol·L^(-1))作用于5-8F细胞后,各AS-Ⅳ组的自噬荧光强度均明显增强,其中,干预24 h,各AS-Ⅳ组的自噬荧光表达最强,10μmol·L^(-1)AS-Ⅳ组的荧光表达最明显;与空白组比较,透射电镜下自噬激活剂雷帕霉素(RAPA)诱导5-8F细胞内出现较多自噬体;3-甲基腺嘌呤(3-MA)作为自噬抑制剂,透射电镜下并未观察到5-8F细胞内有自噬体的形成;AS-Ⅳ10μmol·L^(-1)组细胞内结构和细胞膜完整、清楚,可见自噬体形成;与空白组比较,AS-Ⅳ各组的肿瘤体积明显受到抑制(P<0.05,P<0.01),微管相关蛋白l轻链3Ⅱ/微管相关蛋白l轻链3Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)和活化的胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)荧光信号明显增强(P<0.05,P<0.01),自噬相关蛋白酵母ATG6同源物(Beclin-1)、LC3Ⅱ/Ⅰ和凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、活化的多腺苷二磷酸多聚酶(cleaved PARP)的表达量均明显升高(P<0.05,P<0.01),而自噬相关蛋白泛素结合蛋白(p62)的表达明显下调(P<0.05,P<0.01);磷酸化(p)-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:黄芪甲苷可诱导鼻咽癌细胞发生自噬和凋亡,其机制可能是通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路。

温胆汤通过调控PI3K/Akt/mTOR通路介导的脂肪细胞自噬对肥胖痰湿证炎症状态的影响

目的:观察温胆汤对肥胖痰湿证大鼠脂肪细胞炎症因子、自噬活性标志物及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路关键分子蛋白表达的影响,探讨肥胖痰湿证炎症状态形成的物质基础及温胆汤的干预机制。方法:将126只SD大鼠随机分成2组,即空白组16只和造模组110只,空白组喂养基础饲料,造模组喂养高脂饲料建立肥胖痰湿证动物模型,共8周。造模成功后,视体质量情况,按顺序淘汰体质量过轻者,遴选出48只肥胖大鼠,随机分为模型组、奥利司他组(32.40 mg·kg^(-1))、雷帕霉素组(2 mg·kg^(-1))、温胆汤低、中、高剂量组(4.45、8.90、17.80 g·kg^(-1)),每组8只;另在空白组大鼠中随机选取8只设为正常组,各用药组按剂量(以生药量计算)给予灌胃,模型和正常组给予等体积蒸馏水灌胃,每天1次,共6周。检测或计算大鼠体质量、Lee’s指数、脂体比和肥胖率,采用免疫组化二步法检测脂肪细胞自噬活性标志物动物自噬启动蛋白1(ULK1)、自噬效应蛋白1(Beclin1)、人自噬相关蛋白5(Atg5)、p62、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅰ/Ⅱ表达水平;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测脂肪细胞炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-13和转化生长因子(TGF)-β的表达;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脂肪细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路关键分子classⅠ-PI3K、磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)、Akt、mTORC1、ULK1、结节性硬化症(TSC)1、TSC2的表达。结果:与空白组比较,造模组体质量和Lee’s指数显著升高(P<0.01),肥胖率>20%,有形体肥胖、活动度下降,食欲下降,皮毛无光泽、蓬松,便溏,对外界反应能力下降,饮水量减少等痰湿证表现,与正常组比较,模型组体质量、Lee’s指数、脂体比、脂肪细胞自噬活性标志物蛋白表达、促炎和抗炎细胞因子水平均明显升高(P<0.05,P<0.01),脂肪细胞classⅠ-PI3K、PIP3、Akt、mTORC1、TSC1、TSC2蛋白表达显著下降(P<0.01),但ULK1表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各用药组体质量、脂体比、脂肪细胞自噬活性标志物蛋白表达、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、IL-4、IL-13水平明显降低(P<0.05,P<0.01),且雷帕霉素组、温胆汤中、高剂量组IL-10、TGF-β水平显著降低(P<0.01),奥利司他组TGF-β的表达显著降低(P<0.01),信号通路关键分子蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),但ULK1显著降低(P<0.01)。与雷帕霉素组比较,温胆汤各剂量组脂肪细胞所有自噬活性标志物蛋白表达显著升高(P<0.01),温胆汤低剂量组炎性因子(除TNF-α外)含量明显升高(P<0.05,P<0.01),信号通路关键分子蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),温胆汤中剂量组炎性因子(除IL-16、MCP-1、IL-10外)含量明显升高(P<0.05,P<0.01),温胆汤中、高剂量组信号通路各关键分子蛋白除PI3K外表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。与奥利司他组比较,温胆汤低、中剂量组脂肪细胞自噬活性标志物蛋白表达显著升高(P<0.01),温胆汤低剂量组IL-6、IL-4、TGF-β含量显著升高(P<0.01),所有信号通路关键分子蛋白表达显著降低(P<0.01),温胆汤中剂量组IL-4含量显著升高(P<0.01),信号通路关键分子蛋白除PI3K外表达均明显降低(P<0.05,P<0.01),温胆汤高剂量组体质量、自噬活性标志物ULK1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),信号通路关键分子PIP3、mTORC1、TSC1蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),而自噬活性标志物Beclin1、Atg5蛋白、炎性因子TNF-α、IL-13含量明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:肥胖痰湿证炎症状态的形成与PI3K/Akt/mTOR通路介导的脂肪细胞自噬密切关联,且温胆汤可有效干预肥胖痰湿证大鼠的慢性炎症状态,其作用机制可能与调控该信号通路进而改善脂肪细胞自噬有关。

中药单体调控PI3K/Akt/mTOR信号通路治疗骨肉瘤的研究进展

骨肉瘤是临床上常见的一种原发性骨恶性肿瘤,具有肿瘤异质性高,预后差,易发生病变局部侵袭和远处转移及病死率高的特点。新辅助化疗联合保肢术为目前治疗骨肉瘤的主要治疗手段,虽然通过此种治疗方法有效地降低了骨肉瘤患者的致残率和致死率,但随着化疗技术的应用,长时间化疗药物的使用使得骨肉瘤细胞对其产生耐药作用,降低了肿瘤细胞对药物的敏感度,使得此治疗方式具有了一定的局限性。近年来,随着中医药抗肿瘤的发展和进步,中医药以其治疗效果明显,不良反应少等优势受到了广泛的关注。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路作为经典的癌症信号通路,在骨肉瘤细胞中被异常激活,通过影响肿瘤细胞的周期、抑制肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的自噬及促进肿瘤新生血管的生成,影响骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和转移等活动。临床研究发现,中药单体可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白的活性,对骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、自噬及新生血管的生成等方面产生作用,发挥抑制骨肉瘤组织和细胞发展的作用,并且能高效的逆转肿瘤细胞对抗癌药物的多药耐药。该文将从中医对骨肉瘤的认识和经验积累,及中药单体调控PI3K/Akt/mTOR信号通路在治疗骨肉瘤疾病的研究进展作一综述,以期为中医药治疗骨肉瘤疾病的应用提供参考。

基于PI3K/Akt/mTOR通路探讨助卵汤对大鼠早发性卵巢功能不全的保护作用机制

目的:观察助卵汤对环磷酰胺诱导的早发性卵巢功能不全模型大鼠卵巢储备功能的影响,并基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路探讨助卵汤对大鼠早发性卵巢功能不全的保护机制。方法:60只雌性SD大鼠随机分为正常组10只,模型组50只,模型组采用环磷酰胺(第1天50 mg·kg^(-1)负荷剂量+第2~15天8 mg·kg^(-1)小剂量维持)腹腔注射进行造模,造模成功后随机分为模型组、阳性药物补佳乐组(0.1 mg·kg^(-1)·d^(-1))、助卵汤低、中、高剂量组(14、28、56 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只,模型组与正常组予以等体积蒸馏水灌胃,每日1次,连续给药21 d。检测各组大鼠动情周期、体质量,计算卵巢脏器指数与子宫脏器指数,苏木素-伊红(HE)染色检测卵巢组织病理情况及卵巢切面各级卵泡计数,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清抗苗勒激素(AMH)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、抑制素-B(INH-B)激素含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠卵巢组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达,免疫组化检测大鼠卵巢组织微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,体质量及卵巢脏器指数与子宫脏器指数减少,原始卵泡数量减少,次级卵泡和闭锁卵泡数量增多,FSH升高(P<0.01),LH升高(P<0.05),AMH水平下降(P<0.05),卵巢组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达量均降低(P<0.01),LC3B蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组比较,补佳乐和助卵汤各剂量组上述指标均改善,AMH含量升高(P<0.05),FSH降低(P<0.05),LC3B蛋白表达量显著降低(P<0.01),PI3K、Akt、mTOR蛋白表达量均有升高趋势,且补佳乐组和助卵汤低、中剂量组升高差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:助卵汤可能通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制卵巢颗粒细胞过度自噬的发生,从而逆转造模对大鼠卵巢储备功能的影响。

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨左归丸对^(60)Co-γ射线损伤大鼠卵泡凋亡调控作用

目的以磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路为靶点,探讨左归丸对^(60)Co-γ射线早衰大鼠的保护作用。方法采用^(60)Co-γ射线一次性照射(6.0 Gy,LD_(40))性成熟雌性SD大鼠60只,随机分成模型组、补佳乐组(0.18 g·kg^(-1)·d^(-1))、补佳乐(0.09 g·kg^(-1)·d^(-1))+左归丸高剂量(23.625 g·kg^(-1)·d^(-1))组、左归丸高剂量(23.625 g·kg^(-1)·d^(-1))组、左归丸中剂量(9.45 g·kg^(-1)·d^(-1))组和左归丸低剂量(4.725 g·kg^(-1)·d^(-1))组,每日1次,治疗21 d,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清[卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和雌二醇(E_(2))],苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢的组织形态变化,原位末端标记法(TUNEL)检测颗粒细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织磷酸化(p)-PI3K、p-Akt、p-mTOR和B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达结果。结果与正常组比较,模型组大鼠血清FSH显著上升(P<0.01),E2明显下降(P<0.05),卵巢早期卵泡和黄体数量减少(P<0.01);颗粒细胞凋亡率显著增加(P<0.01);卵巢组织p-PI3K、p-Akt、p-mTOR和Bcl-2蛋白表达明显下降,Bax蛋白表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,各给药组干预后卵巢内早期卵泡数量增加,颗粒细胞凋亡率降低,p-PI3K、p-Akt、p-mTOR和Bcl-2蛋白表达有增加趋势,Bax蛋白表达有下降趋势,尤以补佳乐+左归丸高剂量组差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论左归丸对辐射损伤卵巢的保护作用机制可能是通过活化卵巢组织PI3K/Akt/mTOR蛋白表达,增加Bcl-2蛋白量和抑制Bax蛋白表达。

桦木酸通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导人结肠癌细胞SW620凋亡及自噬

目的:研究桦木酸对人结肠癌细胞SW620凋亡和自噬的影响及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在其中的调控作用。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性,确定最佳给药时间及给药浓度,用于后续实验;设置空白组、桦木酸低、中、高浓度组。采用苏木素-伊红(HE)染色观察桦木酸对SW620细胞形态的影响。采用Annexin-V/碘化丙啶(PI)双染法检测SW620细胞凋亡率。分别采用Hoechst33258染色及细胞自噬染色(MDC)观察细胞凋亡和自噬体发生情况。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)、活化的胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3),微管相关蛋白Ⅰ轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬关键分子酵母Atg6同系物-1(Beclin-1)、p62、磷酸化(p)-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达。结果:桦木酸以浓度、时间依赖性的方式抑制SW620、HT29、HCT116细胞的活性;与桦木酸给药24 h比较,W620、HT29、HCT116细胞给药48 h细胞活性明显降低(P<0.05,P<0.01),给药48 h的半数抑制浓度(IC50)显著降低(P<0.01),其中SW620细胞给药48 h的IC;最小。HE染色、Hoechst33258染色显示,桦木酸组可见浓度依赖性细胞凋亡;MDC染色可见细胞自噬体数量增加。与空白组比较,桦木酸低、中、高浓度组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。与空白组比较,桦木酸低、中、高浓度组Bax、Caspase-9、cleaved Caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),桦木酸中、高浓度组Beclin-1蛋白表达显著升高(P<0.01);桦木酸低、中、高浓度组p62、p-Akt、p-PI3K、p-mTOR蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:桦木酸对SW620细胞活性有明显的抑制作用,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路从而诱导人结肠癌细胞SW620的凋亡及自噬有关。

PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信号通路在胃癌细胞中的相互作用机制

目的探讨磷脂酰肌醇3–激酶/蛋白激酶B/哺乳动物靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)两条信号通路对胃癌细胞功能的影响及相互作用机制。方法使用PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂AZD8055、MEK抑制剂AZD6244单独或联合作用于胃癌MGC-803细胞。应用CCK8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;蛋白印迹法(Western blot)检测通路关键蛋白的表达。结果联合使用LY294002(25μmol/L)与AZD6244(125μmol/L)、AZD8055(0.1μmol/L)与AZD6244(125μmol/L)能够显著抑制胃癌MGC-803细胞的增殖活性,且联用组比单独作用组具有更强的抑制效果(P<0.05);联用组诱导细胞凋亡数量和阻滞于G0/G1期的MGC-803细胞数量增多,高于单独作用组(P<0.05)。与LY294002、AZD8055和AZD6244单独作用相比,LY294002与AZD6244、AZD8055与AZD6244联用组MGC803细胞p-AKT、p-P70S6K和p-ERK1/2蛋白表达明显受到抑制(P<0.05)。结论PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK两条信号通路在胃癌MGC-803细胞的生长中具有协同调控作用,对于两条信号通路的多靶点抑制能够更加明显的抑制癌细胞生长。

补肾健脾方对再生障碍性贫血患者细胞自噬的影响

目的:探索补肾健脾方改善再生障碍性贫血(AA)患者细胞自噬水平,以及对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路的影响。方法:收集2020年9月至2021年8月期间就诊于西苑医院的AA患者30例及304医院预备行外周血造血干细胞移植的健康供者6例,分为AA组和对照组。AA组予以3个月的补肾健脾方联合环孢素A(CsA)、雄激素治疗,收集AA组(治疗前后)骨髓及对照组外周血的单个核细胞,采用透射电子显微镜检测自噬小体、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、mTOR、Akt、PI3K mRNA水平及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、mTOR、磷酸化(p)-mTOR、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白水平。结果:AA组实际完成29例,总有效率为51.72%(15/29)。(1)与对照组比较,AA患者治疗前外周血中白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、中性粒细胞绝对计数(ANC)均显著降低(P<0.01),自噬小体偏少,LC3 mRNA水平显著降低(P<0.01),mTOR、Akt和PI3KαmRNA水平显著升高(P<0.01),LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白水平均显著降低(P<0.01),Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白水平均显著升高(P<0.01);(2)与本组治疗前比较,AA患者治疗后,血红蛋白(HGB)和血小板计数(PLT)水平均明显升高(P<0.05),自噬小体增多,LC3 mRNA水平显著升高(P<0.01),mTOR、Akt和PI3KαmRNA水平均显著降低(P<0.01),LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白水平显著增高(P<0.01),Akt、p-PI3K蛋白水平显著降低(P<0.01),p-Akt、PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白水平明显降低(P<0.05)。结论:AA患者细胞自噬水平降低,补肾健脾方能有效改善AA患者低水平细胞自噬状态,降低PI3K/Akt/mTOR信号通路的表达。

异甘草素对人肾透明细胞癌786-O细胞抗癌作用及分子机制

目的:研究异甘草素(isoliquiritigenin,ISL)对人肾透明细胞癌786-O细胞的抗癌作用,并探讨其可能存在的分子机制。方法:通过噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)比色法检测ISL(0,10,25,50,75,100μmol·L^(-1))对786-O细胞增殖的作用;细胞划痕和Transwell实验检测ISL对786-O细胞迁移、侵袭能力的影响;吖啶橙染色,Ad-GFP-LC3转染实验观察细胞自噬状态;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白的表达,并分析磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路变化,探讨其可能的作用机制。结果:MTT比色法结果显示,与空白组比较,ISL能够明显抑制786-O细胞的增殖,且呈时间-剂量依赖性(P<0.05);划痕和Transwell实验结果表明,与空白组比较,ISL能够抑制785-O细胞的迁移和侵袭(P<0.05);吖啶橙染色和Ad-GFP-LC3转染实验表明ISL能够诱导786-O细胞发生自噬。此外,与空白组比较,ISL能够诱导细胞内自噬标志物-Ⅱ(LC3-Ⅱ),自噬相关蛋白Beclin1,Atg5蛋白表达(P<0.05),并显著下调p62蛋白表达(P<0.05),当加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)可逆转上述现象(P<0.05);同时ISL能够抑制Akt,m TOR的磷酸化水平(P<0.05),加入抑制剂LY294002和雷帕霉素(rapamycin,Rap),LC3-Ⅱ,Beclin1,Atg5蛋白表达明显上调(P<0.05),p62蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论:ISL能够抑制肾透明细胞癌786-O细胞的增殖、迁移和侵袭,并通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导细胞发生自噬。