基于PI3K/Akt/AS160/GLUT4通路探讨芪丹颗粒改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用机制

【目的】探讨芪丹颗粒对2型糖尿病(T2DM)大鼠模型胰岛素抵抗(IR)的治疗作用与机制。【方法】实验分5组:正常组、模型组、芪丹颗粒低剂量组、芪丹颗粒高剂量组及二甲双胍组。除正常组,其他各组采用高糖高脂饲料喂养结合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)法建立2型糖尿病大鼠模型。对应给药后,检查各组大鼠体质量,空腹血糖,血脂谱[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]及稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(HOMAIR),分别采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western Blot法对应检测肝脏组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、160 kDa的Akt底物(AS160)和葡萄糖转运体4(GLUT4)的mRNA、蛋白表达变化。【结果】芪丹颗粒干预后可降低2型糖尿病大鼠体质量、空腹血糖值,改善TC、TG、HDL-C、LDL-C水平,降低HOMA-IR值,上调肝脏组织PI3K、Akt、GLUT4的mRNA表达量,上调肝脏组织p-PI3K、Akt、p-Akt、p-AS160、GLUT4的蛋白表达量,差异均有统计学意义(P<0.05),且对指标的改善作用与二甲双胍相当(P>0.05)。【结论】芪丹颗粒可改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗,其机制与促进PI3K/Akt/AS160/GLUT4信号通路激活有关。

CHMP4C通过调控PI3K/AKT信号通路影响NSCLC细胞增殖与凋亡

目的:探究染色质修饰蛋白4C(CHMP4C)对非小细胞肺癌(NSCLC)进展及顺铂敏感性的影响及其机制。方法:通过免疫组化检测CHMP4C在NSCLC癌组织和癌旁组织中的表达情况。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CHMP4C在NSCLC细胞系中的表达水平。细胞计数试剂盒(CCK-8)和细胞克隆实验检测细胞活力及半数抑制浓度IC50;流式细胞术检测细胞周期和凋亡。Western blot分析细胞凋亡相关蛋白(caspase 3、Bad)及PI3K/AKT信号通路中关键蛋白的表达水平。另外,我们采用动物模型进一步验证CHMP4C对体内肿瘤生长的影响。结果:CHMP4C在NSCLC癌组织和细胞系中高表达,与肿瘤T分期显著相关(P<0.05)。敲低CHMP4C抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,并将细胞阻滞在S期(P<0.05)。敲低CHMP4C可抑制PI3K/AKT信号通路活化,然而激活PI3K/AKT信号通路逆转了CHMP4C敲低对NSCLC细胞的影响(P<0.05)。利用顺铂处理细胞后发现NSCLC细胞生长受抑制,且CHMP4C表达降低;敲低CHMP4C联合顺铂治疗明显诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖(P<0.05)。在动物实验中,CHMP4C敲低的肿瘤体积小于对照组,其ki67表达显著降低,而caspase 3表达升高(P<0.05)。结论:CHMP4C在NSCLC癌组织及细胞系中高表达,在体内及体外实验中敲低CHMP4C可抑制NSCLC细胞增殖,促进细胞凋亡,增强顺铂治疗的敏感性;CHMP4C可能通过PI3K/AKT信号通路参与NSCLC进展与顺铂耐药。

miR-361介导PI3K/Akt/Ca^(2+)通路对大鼠肥大细胞增殖情况及组胺与IL-4表达水平的影响

目的:探讨miR-361介导PI3K/AKt/Ca^(2+)通路对活化大鼠肥大细胞增殖情况及组胺与白细胞介素-4(IL-4)表达水平的影响。方法:将大鼠肥大细胞(RBL-2H3细胞)分为miR-361过表达组、miR-361抑制组、miR-361对照组和正常对照组,miR-361过表达组、miR-361抑制组、miR-361对照组细胞分别转染miR-361过表达、miR-361抑制及miR-361无义序列寡核苷酸片段,测定并比较各组细胞miR-361 mRNA、组胺、IL-4及PI3K/AKt/Ca^(2+)通路相关蛋白水平。结果:miR-361过表达组细胞miR-361 mRNA相对表达水平高于miR-361抑制组、miR-361对照组及正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CCK-8法检测结果显示,miR-361过表达组24、48、72 h细胞增值率均低于miR-361抑制组、miR-361对照组及正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ELISA法检测结果显示,miR-361过表达组细胞组胺和IL-4水平的表达水平低于miR-361抑制组、miR-361对照组及正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western印迹法检测结果显示,miR-361过表达组细胞p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K蛋白表达水平均高于miR-361抑制组、miR-361对照组及正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-361过表达可抑制大鼠肥大细胞的增殖,降低组胺与IL-4的表达水平,其作用机制可能与其能够提高PI3K/AKt/Ca^(2+)通路活性有关。

电针对代谢综合征大鼠糖脂代谢和IRS-1/PI3K/Akt/GLUT4信号通路的影响

【目的】探讨电针对代谢综合征(MS)大鼠糖脂代谢和胰岛素受体底物1(IRS-1)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)信号通路的影响。【方法】采用高脂高糖高盐饲料喂养方法构建代谢综合征大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、二甲双胍组和电针组,另设正常组。二甲双胍组大鼠给予盐酸二甲双胍片的生理盐水混悬液灌胃,电针组大鼠给予关元、中脘、足三里、丰隆穴电针治疗,正常组和模型组大鼠只固定,不针刺。连续干预21 d后,测量大鼠体质量、腹腔脂肪质量和血压,计算Lee’s指数和体脂比,检测空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、血脂、脂肪酸(FFA)、脂联素(APN),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);分别采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western Blot法检测肝脏组织IRS-1、PI3K、Akt、GLUT4的mRNA和蛋白表达;苏木素-伊红(HE)染色法观察肝脏和胸主动脉病理变化。【结果】与正常组比较,模型组大鼠体质量、Lee’s指数、腹腔脂肪质量、体脂比、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、FPG、FINS、HOMA-IR、总胆固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、FFA水平升高(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、APN水平降低(P<0.05),肝脏IRS-1、PI3K、Akt、GLUT4 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),HE染色结果显示肝脏脂肪变性和胸主动脉粥样硬化。与模型组比较,电针组和二甲双胍组大鼠体质量、Lee’s指数、腹腔脂肪质量、体脂比、SBP、DBP、FPG、FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、FFA水平降低(P<0.05),HDL-C、APN水平升高(P<0.05),肝脏IRS-1、PI3K、Akt、GLUT4 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05),HE染色结果显示肝脏脂肪变性和胸主动脉粥样硬化明显减轻。电针组和二甲双胍组上述指标改变差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】电针可以改善代谢综合征大鼠的糖脂代谢,其机制可能与上调IRS-1/PI3K/Akt/GLUT4通路蛋白表达有关。

基于IRS-1/PI3K/AKT/GLUT4通路探讨二苯乙烯类化合物改善胰岛素抵抗作用机制

[目的]探讨3种中药(虎杖、桑白皮、何首乌)来源的二苯乙烯类化合物改善胰岛素抵抗(IR)的作用机制。[方法]利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作用于3T3-L1脂肪细胞96 h建立IR细胞模型;采用噻唑蓝(MTT)法检测二苯乙烯类化合物白藜芦醇(RES)、虎杖苷(PD)、桑皮苷A(Mul A)、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡糖糖苷(THSG)对脂肪细胞生存率的影响;葡萄糖氧化酶法检测细胞培养基上清液中葡萄糖含量;采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测胰岛素受体底物-1(IRS-1)、磷酸化IRS-1(p-IRS-1)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、葡萄糖转运体4(GLUT4)的蛋白表达水平;采用实时定量荧光聚合酶链反应(RT-PCR)法检测GLUT4 mRNA表达水平。[结果]与空白对照组相比,模型组的葡萄糖消耗量显著下降,模型组的p-IRS-1(Ser307)蛋白表达显著增加,p-PI3K、p-AKT(Ser473)、GLUT4蛋白表达显著下降,模型组GLUT4 mRNA表达显著降低;与模型组相比,RES、Mul A、THSG组的葡萄糖消耗量显著增加,PD组的葡萄糖消耗量无明显变化,Mul A、THSG组均能显著逆转p-IRS-1(Ser307)、p-PI3K、p-AKT(Ser473)、GLUT4的蛋白表达,RES仅能够逆转p-IRS-1(Ser307)、GLUT4的蛋白表达;与模型组相比,THSG组GLUT4 mRNA表达显著增加。[结论]Mul A、THSG能够通过IRS-1/PI3K/AKT/GLUT4信号通路改善脂肪细胞IR,而RES则通过激活IRS-1和GLUT4,但不通过PI3K/AKT途径发挥改善脂肪细胞IR的作用。PD无降糖活性。

加味温胆汤调控INSR/PI3K/Akt/GLUT4信号通路抗雄性幼鼠营养性肥胖机制研究

目的通过观察加味温胆汤对雄性营养性肥胖幼鼠INSR/PI3K/Akt/GLUT4信号通路相关指标含量及mRNA表达的影响,探讨该方抗雄性幼鼠营养性肥胖的机制。方法 60只SD雄性幼鼠按体质量随机分为正常对照组、模型对照组、加味温胆汤高、中、低剂量组(8.6、4.3、2.15 g·kg^(-1));采用"高脂乳剂+拌油饲料"喂养复制幼鼠营养性肥胖模型,灌胃给药,连续5周,分离血清和骨骼肌组织,采用酶联免疫法(ELisa)检测血清甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、胰岛素(INS)及骨骼肌INS、胰岛素受体(INSR)、葡萄糖转运体4(GLUT4)含量,采用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测骨骼肌胰岛素受体底物2(IRS2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B2(Akt2)和GLUT4 mRNA表达水平。结果与模型对照组比较,加味温胆汤高剂量组可显著降低幼鼠Lee’s指数、血清TG水平,升高血清HDL-C、骨骼肌GLUT4含量,上调骨骼肌IRS2 mRNA表达水平;加味温胆汤中剂量组可降低幼鼠血清LDL-C水平,升高骨骼肌组织INSR、GLUT4含量,上调骨骼肌IRS2、PI3K、Akt2和GLUT4 mRNA表达;加味温胆汤低剂量组可升高骨骼肌INSR水平,并上调骨骼肌PI3K mRNA的表达水平。以上结果均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论加味温胆汤抗雄性幼鼠营养性肥胖的机制与上调幼鼠骨骼肌INSR及IRS2 mRNA表达水平,激活胰岛素受体后PI3K/Akt/GLUT4信号通路,调节脂肪、葡萄糖等代谢有关,其中高、中剂量组作用突出。

PI3K/Akt和AMPK信号通路在运动诱导的啮齿动物骨骼肌内GLUT4转位和表达中的作用

骨骼肌在葡萄糖稳态中扮演重要作用,葡萄糖转运体4(glucose transporter4,GLUT4)作为骨骼肌内最主要的葡萄糖转运蛋白,其转位和表达的变化与胰岛素抵抗的发生密切相关。本文综述了近年来关于啮齿动物骨骼肌内GLUT4转位和表达的运动激活以及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路介导运动改善骨骼肌葡萄糖摄取的研究进展,旨在为全面了解和明确运动影响啮齿动物骨骼肌内GLUT4转位和表达的机制。

紫苏叶多糖对糖尿病模型小鼠胰腺组织氧化应激及PI3K/AKT/GLUT4信号通路的影响

目的:研究紫苏叶多糖对糖尿病(DM)模型小鼠胰腺组织氧化应激及磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/苏氨酸蛋白激酶(AKT)/葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)信号通路的影响。方法:取60只小鼠,采用腹腔注射链脲佐菌素(60 mg/kg)的方法复制糖尿病模型。将造模成功的40只小鼠随机分为模型组、二甲双胍组(阳性对照,200 mg/kg)和紫苏叶多糖高、低剂量组(400、200 mg/kg),每组10只;另取10只健康小鼠作为正常组(生理盐水)。每天灌胃给药1次,连续给药28 d。实验期间,观察小鼠一般状况和体质量变化;进行口服葡萄糖耐量(OGTT)实验[测定灌胃40%葡萄糖溶液0、30、60、120 min后的空腹血糖(FBG)水平]。末次给药后,测定小鼠血糖相关指标[FBG、空腹胰岛素(FINS)和胰岛素敏感指数(ISI)、胰岛素抵抗指数(IRI)]、血脂相关指标[血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)]和氧化应激相关指标[胰腺组织中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性]的变化,并测定小鼠胰腺组织中PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)和GLUT4蛋白表达水平。结果:实验期间,与正常组比较,模型组小鼠行动迟缓,饲料消耗量和饮水量增多,体质量显著增加(P<0.05);给予葡萄糖0、30、60、120 min后,小鼠的FBG水平均显著升高(P<0.05);末次给药后,血清中FINS、HDL-C含量和ISI以及胰腺组织中SOD、CAT、GSH-Px活性和PI3K、p-AKT、GLUT4蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),而血清中FBG、LDL-C、TC、TG含量和IRI以及胰腺组织中MDA含量均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各给药组小鼠一般情况和OGTT情况均有好转;血清中FINS、HDL-C含量和ISI以及胰腺组织中SOD、CAT、GSH-Px活性和PI3K、p-AKT、GLUT4蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),而血清中FBG、LDL-C、TC、TG含量和IRI以及胰腺组织中MDA含量均显著降低(P<0.05)。结论:紫苏叶多糖具有抗糖尿病作用,该作用可能与降低氧化应激水平和促进PI3K/AKT/GLUT4信号通路的活化有关。

三硝基苯磺酸/乙醇灌肠液诱导大鼠溃疡性结肠炎TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达及电针的干预作用

目的探讨三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠液诱导大鼠溃疡性结肠炎TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达及电针的干预作用。方法雄性Wistar大鼠240只,随机分为正常对照组、模型组、电针组、TLR4单克隆抗体(TLR4mAb)组、LY294002组和TLR4mAb-LY294002联合治疗(T&L)组。以TNBS/乙醇溶液灌肠诱导大鼠溃疡性结肠炎模型,电针组造模同时给予电针足三里穴治疗,TLR4mAb组给予TLR4mAb腹腔注射,LY294002组则予LY294002注射液腹腔注射,T&L组则同时给与上述TLR4mAb和LY294002腹腔注射,共4周,每日行疾病活动指数(DAI)评分。造模4周后处死大鼠取结肠组织标本,评价结肠黏膜损伤指数(CMDI)和组织学损伤指数(TDI);免疫印迹法测定结肠黏膜磷酸化AKT(P-AKT)和活化NF-κB含量;RT-PCR法检测结肠组织中TLR4mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达。结果与正常对照组比较,模型组结肠组织TLR4mRNA、PI3K mRNA、P-AKT、活化NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达和DAI、CMDI及TDI均显著升高(P<0.01);与模型组比较,TLR4mAb组TLR4mRNA表达显著下降(P<0.01),LY294002组PI3K mRNA、P-AKT表达显著下降(P<0.01),而在电针组和T&L组TLR4mRNA、PI3K mRNA及P-AKT表达均明显降低(P<0.01);与上述变化相对应,与模型组相比,各治疗组活化NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达和DAI、CMDI及TDI均明显降低(P<0.05或P<0.01),电针组和T&L组上述6指标优于TLR4mAb组和LY294002组,活化NF-κB与TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达呈正相关(r1=0.579,P<0.05;r2=0.561,P<0.05)。结论电针足三里穴能显著降低实验性溃疡性结肠炎大鼠的NF-κB活性及TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达,从而减轻结肠组织损害程度,这与其阻断TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路有密切关系。

子宫颈病变组织中HPV16感染与TLR4介导的PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的关系

目的探讨子宫颈病变中Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)介导的PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达与人乳头状瘤病毒(human papillomavirus HPV)16感染的关系。方法采用免疫组化SP法检测152例慢性子宫颈炎、子宫颈上皮内瘤变(cervical intra-epithilial neoplasia,CIN)以及子宫颈鳞状细胞癌组织中TLR4、PI3K、AKT、NF-κB蛋白的表达;抽提石蜡组织总DNA,用PCR法检测组织中HPV 16的感染情况。结果在慢性子宫颈炎、CIN和子宫颈鳞状细胞癌组织中TLR4、PI3K、AKT和NF-κB蛋白阳性率分别为32.0%、59.4%、77.8%,28.0%、56.3%、73.0%,24.0%、56.3%、79.4%,8.0%、48.4%、81.0%,并且随着子宫颈病变的加重表达增强(P<0.05);HPV 16在3组子宫颈病变组织中的感染率分别为8.0%、48.4%和81.0%(P<0.05)。TLR4、PI3K、NF-κB蛋白及HPV 16均与子宫颈癌分化程度有关(P<0.05);PI3K和AKT与临床分期密切相关,NF-κB与淋巴结转移有关(P<0.05);在CIN和子宫颈鳞状细胞癌组织中TLR4分别与HPV 16(r=0.303,P=0.015;r=0.633,P=0.000)和PI3K(r=0.254,P=0.045;r=0.386,P=0.003)密切相关;在子宫颈鳞状细胞癌组织中PI3K与AKT密切相关(r=0.298,P=0.018)。结论 HPV 16感染上调TLR4在CIN中的表达,TLR4介导的PI3K/AKT信号通路共同作用对子宫颈上皮从炎症→CIN→子宫颈癌过程中发挥重要作用,HPV 16的感染可能是影响通路分子表达改变的前提条件。

小檗碱对HepG2胰岛素抵抗细胞PI3K/AKT1/GLUT1信号通路的调控作用

目的 :探讨小檗碱对Hep G2胰岛素抵抗细胞PI3K/AKT1/GLUT1信号通路的调控作用。方法 :MTT法检测小檗碱不同浓度对细胞生长的抑制率;建立胰岛素抵抗细胞模型,实验分为5组,分别为空白组、模型组、二甲双胍组、小檗碱高剂量组、小檗碱低剂量组,给予相应的药物后,Western Blot检测葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、蛋白激酶B1(AKT1)的表达。结果:与空白组比较,模型组细胞培养基中的葡萄糖含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明胰岛素抵抗细胞模型建立成功。与空白组比较,模型组PI3K蛋白、GLUT1蛋白表达显著降低,AKT1蛋白表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,二甲双胍组、小檗碱高剂量组、小檗碱低剂量组PI3K蛋白、GLUT1蛋白表达显著升高,AKT1蛋白表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:小檗碱具有改善细胞胰岛素抵抗的作用,其分子机制可能通过调控PI3K/AKT1/GLUT1信号通路中转录因子蛋白的表达,从而改善细胞胰岛素抵抗状态。

CXCR4靶向PI3K-Akt信号通路抑制小细胞肺癌血管生成

目的探讨在小细胞肺癌(SCLC)中CXC趋化因子受体4(CXCR4)靶向PI3K/Akt信号通路对血管内皮生长因子(VEGF)表达及肿瘤血管生成的影响。方法采用免疫蛋白印迹法检测PI3K激动剂/抑制剂(YS-49/LY294002)和CXCR4激动剂/拮抗剂(NUCC-390/AMD3100)对PI3K/Akt信号通路及VEGF表达的影响。随后经体外小管形成实验检测NUCC-390/AMD3100对HUVEC小管形成的影响;最后在SCLC细胞系NCI-H446荷瘤小鼠中验证NUCC-390/AMD3100对肿瘤生长速度的影响,并经CD31免疫组织化学染色检测肿瘤内血管生成情况。结果与对照组比较,YS-49组p-Akt及VEGF表达水平显著性升高,LY294002组p-Akt及VEGF表达水平显著降低(P<0.05)。与对照组比较,NUCC-390组小管形成长度显著性增加,荷瘤小鼠肿瘤体积显著性增大,瘤组织内CD31阳性面积显著性增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,NUCC-390组p-Akt和VEGF的表达增高,AMD3100组p-Akt和VEGF表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,AMD3100组小管形成长度显著性降低,荷瘤小鼠肿瘤体积显著性缩小,肿瘤内CD31阳性面积显著性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在SCLC中CXCR4可通过调节PI3K/Akt信号通路调控VEGF表达,进而抑制肿瘤的血管生成和生长。

Exendin-4通过PI3K/Akt信号通路促进脂肪干细胞旁分泌细胞因子

目的探讨Exendin-4促进脂肪来源干细胞(ADSCs)旁分泌细胞因子的机制。方法混合酶消化法提取和培养SD大鼠腹股沟处的脂肪干细胞,使用流式细胞学检测有或无Exendin-4处理后的第4代ADSCs表面标记物,MTT法绘制0、1、5、10、20 nm/L不同浓度Exendin-4下的ADSCs生长曲线;qPCR法检测不同浓度Exendin-4处理12 h后bFGF、VEGF、HGF、IGF-1的表达变化。Western blotting和qPCR检测Exendin-4对于Akt通路的作用。同时添加通路阻断剂LY-294002,使用ELISA检测Akt通路阻断后Exendin-4对于旁分泌蛋白的影响。结果分离培养的ADSCs高表达CD29、CD90、CD105,低表达CD34、CD45,并且能够多向分化为脂肪细胞、骨细胞,符合间充质干细胞的表型特点。Exendin-4处理后,不仅不会改变ADSCs的表型,还能以浓度依赖方式促进ADSCs在体外增殖(P<0.05)。不同浓度Exendin-4处理ADSCs 12 h后,旁分泌蛋白bFGF、VEGF、HGF、IGF-1的表达量逐渐提高,其中10 nm/L Ex-4处理12 h可能为最佳处理浓度(P<0.05)。Western blotting和qPCR提示Exendin-4能够显著提高胞内Akt的磷酸化水平,而给予LY-294002后,磷酸化Akt表达减弱,同时ADSCs培养液上清中bFGF、VEGF、HGF、IGF-1的含量也明显降低(P<0.05)。结论短暂Exendin-4处理不会改变ADSCs表型,但能加强细胞的增殖能力,且以剂量依赖方式促进干细胞旁分泌细胞因子bFGF、VEGF、HGF、IGF-1。10 nm/L可能为Exendin-4最适促旁分泌浓度,其扩大干细胞旁分泌的机制部分是通过激活PI3K/Akt信号通路来介导。

PRDM4通过PI3K/AKT信号通路抑制宫颈癌细胞的侵袭和转移

目的研究PR-domain蛋白转录因子家族成员PRDM4在宫颈癌发生发展中的作用和临床意义。方法采用免疫组化法检测30例正常宫颈组织和30例宫颈癌组织中PRDM4的表达。在宫颈癌细胞系Si Ha和He La中外源性过表达和干扰PRDM4,采用Transwell小室实验检测其对宫颈癌细胞Si Ha和He La侵袭转移能力的影响。采用转录本测序结合基因富集方法分析PRDM4过表达Si Ha细胞和对照细胞的差异信号通路和基因表达,并通过real-time PCR进行验证。PI3K/AKT激动剂胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)处理PRDM4过表达的Si Ha和He La细胞后,检测细胞的侵袭转移能力。结果 PRDM4在宫颈癌组织中的表达显著低于正常宫颈组织,并且与宫颈癌患者的临床分期和淋巴结转移呈负相关(P<0.05);外源性的过表达/干扰PRDM4能够显著抑制宫颈癌细胞Si Ha和增强He La的体外侵袭和转移能力。转录本测序结合基因富集结果显示PRDM4过表达Si Ha细胞中PI3K/AKT信号通路及下游基因的表达受到抑制。利用PI3K/AKT激动剂显著促进了PRDM4过表达所导致的细胞侵袭和转移抑制作用。结论 PRDM4在宫颈癌中的表达下调,与患者的临床分期及预后相关,机制研究显示PRDM4通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制宫颈癌细胞的侵袭转移能力。

大鼠高位脊髓损伤早期心肌组织PI3K/AKT/GLUT4信号通路的变化

目的 观察磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)信号通路在大鼠高位脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)早期心肌中的变化。方法 清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠30只,8~10周龄,体质量250~300 g,随机分成五组(每组n=6):假手术组(Sham组)、高位SCI 4 h组(SCI 1组)、高位SCI 12 h组(SCI 2组)、高位SCI24 h组(SCI 3组)和高位SCI48 h组(SCI 4组);改良的Allens打击法建立高位SCI大鼠模型,Sham组仅暴露颈7脊髓后缝合,建模成功后注意观察和记录各组动物术后表现,在相应时点用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法评估大鼠下肢运动功能,选取相同部位的心肌组织进行下一步检测;透射电子显微镜观察各组心肌细胞的超微结构;免疫印迹法检测心肌组织PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)和心肌细胞膜GLUT4含量。结果 Sham组大鼠术后四肢灵活,活动等行为与术前基本一致,BBB评分为21分。高位SCI各组大鼠术中颈7打击处变灰暗,术后双下肢弛缓性瘫痪,活动和进食明显减少,无自主排尿排便;BBB评分均接近0,与Sham组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.05)。透射电子显微镜结果显示,Sham组大鼠心肌细胞结构完整;高位SCI各组大鼠心肌细胞存在不同程度的肌丝溶解、肌浆网扩张、细胞间隙增宽、溶酶体增多和线粒体结构破坏等变化。免疫印迹法结果显示,与Sham组比较,SCI 1组、SCI 2组和SCI 3组心肌组织PI3K、p-AKT和心肌细胞膜GLUT4蛋白含量均降低(PI3K:0.726±0.163 vs.0.324±0.199、0.381±0.274、0.453±0.217;p-AKT:0.613±0.256 vs.0.150±0.037、0.335±0.058、0.410±0.082;GLUT4:0.446±0.227 vs.0.264±0.105、0.248±0.098、0.205±0.099;均P<0.05),而SCI 4组各目标蛋白含量与Sham组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 大鼠高位SCI早期心肌细胞GLUT4减少可能与PI3K/AKT/GLUT4信号通路上游表达异常有关。

Toll样受体4通过PI3K/Akt信号通路调节骨髓间充质干细胞凋亡

目的研究Toll样受体4(TLR4)对骨髓间充质干细胞(MSCs)凋亡的影响及其可能的机制。方法本实验运用脂多糖(LPS)作用于的大鼠MSCs,应用流式细胞术鉴定MSCs;实验分成4组:对照组、LPS组、TLR4阻断剂+LPS组、LY294002+LPS组,缺氧处理6h后,用Western blot法检测TLR4、p-Akt、Akt、Bax、Bcl2、Caspase-3蛋白的表达变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果与对照组比较,LPS作用后TLR4的表达明显上调(P<0.01),p-Akt表达增加,Bax表达降低,Bcl-2的表达上升,Caspase-3表达减少,且MSCs的凋亡率也减少(P<0.05);TLR4阻断剂处理后p-Akt较LPS组减少,Bax表达上调,Bcl-2的表达下降,Caspase-3表达增加,MSCs的凋亡率也增加(P<0.01),LY294002预处理后p-Akt表达较LPS组明显降低,Bax表达显著上调,Bcl-2的表达下降,Caspase-3表达明显增加,且MSCs的凋亡率也增加(P<0.01)。结论 TLR4对MSCs的凋亡具有抑制作用,其作用机制可能与激活IP3K/Akt信号通路,继而抑制Caspase-3活性有关。

厄贝沙坦对高血压合并2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路的影响

目的探讨厄贝沙坦对高血压合并2型糖尿病(T2DM)大鼠胰岛素抵抗的影响及其作用。方法自发性高血压大鼠(SHR)采用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)建立T2DM模型,随机分为模型组、厄贝沙坦低、高剂量组。以正常大鼠作为对照组。厄贝沙坦低、高剂量组每日分别按30、60 mg/kg剂量灌服厄贝沙坦,对照组和模型组灌服等量生理盐水。测量大鼠收缩压(SBP)、空腹血糖(FBG)、胰岛素抵抗模型评估指数(HOMA-IR)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇(-3)激酶p85亚基(PI3Kp85)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白(p-AKT)及葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达。结果与对照组相比,模型组SBP、FBG、FINS和HOMA-IR升高(P<0.05),IRS-1、PI3Kp85、p-AKT和GLUT4降低(P<0.05);与模型组相比,厄贝沙坦低、高剂量上述指标均发生逆转(P<0.05)。结论厄贝沙坦可通过IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路改善高血压合并T2DM大鼠胰岛素抵抗。

PI3K/AKT信号通路的抑制促进B7-H4分子的核转移

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路对负性共刺激分子B7-H4细胞定位的调控作用。方法体外培养稳定转染B7-H4/HEK293细胞,采用PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002和/或出核转运抑制剂来普霉素B(LMB)处理细胞之后,免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜检测B7-H4蛋白在B7-H4/HEK293细胞中亚细胞定位的变化;Western blot法检测B7-H4蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核表达水平的变化。结果激光共聚焦显微镜观察结果显示,PI3K抑制剂LY294002作用于B7-H4稳定转染的B7-H4/HEK293细胞后,与空白对照组相比,B7-H4发生核转移,加入出核转运抑制剂LMB后,核转移的程度显著增加;Western blot法结果显示,LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活性24 h后,B7-H4在细胞膜和细胞质中的定位均显著降低(P<0.05),而细胞核中B7-H4的定位显著增加(P<0.05)。结论 PI3K/AKT信号通路可抑制B7-H4的核转移。

GTPBP4基因沉默介导EGFR/PI3K/AKT信号通路对顺铂诱导的胃癌细胞凋亡的调控机制

目的:探讨GTP结合蛋白4(GTPBP4)基因介导EGFR/PI3K/AKT信号通路对顺铂诱导的胃癌细胞凋亡的调控机制。方法:选取人胃癌细胞株MGC-803、NCI-N87、SGC-7901、MKN-45及人胃黏膜上皮细胞株GES-1,筛选癌细胞中GTPBP4表达最高的细胞株并分为6组:Blank组(胃癌细胞不做处理)、阴性对照组(转染含有无关序列的重组质粒)、GTPBP4 shRNA组(转染含有GTPBP4 shRNA的重组质粒)、GTPBP4过表达组(转染含有GTPBP4片段的重组质粒)、EGFR/PI3K/AKT inhibitor组(EGFR/PI3K/AKT通路抑制剂处理细胞)、Combined treatment组(EGFR/PI3K/AKT通路抑制剂联合GTPBP4 shRNA处理细胞),分别给予顺铂处理。qRT-PCR和Western blot检测EGFR/PI3K/AKT信号通路和凋亡相关基因的mRNA和蛋白表达水平。MTT法检测各组细胞的增殖活力。Transwell检测各组细胞侵袭情况。流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果:与人胃黏膜上皮细胞相比,胃癌细胞株中GTPBP4表达显著上调(P<0.05)。给予顺铂处理后,胃癌细胞GTPBP4表达下调。与Blank组相比,GTPBP4 shRNA组及EGFR/PI3K/AKT inhibitor组Bax表达上调,Bcl-2、EGFR、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT表达均下调,细胞增殖、侵袭能力降低,凋亡率上升(P<0.05),且Combined treatment组各指标变化趋势更为明显(P<0.05)。GTPBP4过表达组与GTPBP4 shRNA组、EGFR/PI3K/AKT inhibitor组及Combined treatment组变化呈相反趋势(P<0.05)。Blank组和NC组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:GTPBP4基因沉默可抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路激活,抑制胃癌细胞的增殖、侵袭能力,促进顺铂诱导的胃癌细胞凋亡。

连草泻痢胶囊对溃疡性结肠炎小鼠模型肠黏膜炎症因子及TLR4/PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:观察连草泻痢胶囊对溃疡性结肠炎(UC)小鼠模型肠道黏膜炎症因子及TLR4/PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。方法:40只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、连草泻痢组和美沙拉嗪组,每组10只。除空白组外,余下3组小鼠采用3%葡聚糖硫酸钠诱导诱导急性UC小鼠模型,造模期间各组给予相应的药物及生理盐水灌胃治疗。实验结束后通过HE染色观察各组小鼠结肠组织病理形态的改变,ELISA法检测血清及结肠组织中炎症因子(TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β、IL⁃8、IL⁃17和INF⁃γ)的含量,Western blot法检测TLR4/PI3K/Akt/mTOR信号通路中相关蛋白的表达水平。结果:与模型组相比,连草泻痢胶囊能明显增加UC小鼠结肠长度和降低结肠组织病理学评分,差异具有统计学意义(P<0.01)。此外,与模型组相比,连草泻痢组血清及结肠组织中炎性因子TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β、IL⁃8、IL⁃17和INF⁃γ的含量均明显减少,TLR4、PI3K、p⁃Akt和p⁃mTOR蛋白的表达明显下调,差异均具有统计学意义(P<0.01);而连草泻痢胶囊及美沙拉嗪对结肠组织中Akt和mTOR蛋白的表达水平无明显影响,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:连草泻痢胶囊通过抑制TLR4/PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化,降低炎症因子的分泌,改善UC肠道黏膜损伤和炎症反应。