藏红花素通过PI3K/Akt/GSK-3β通路诱导人乳腺癌细胞凋亡的初步研究

目的:探讨藏红花素对人乳腺癌细胞凋亡的影响及相关调控机制。方法:以人正常乳腺MCF-10A细胞和人乳腺癌MCF-7细胞为受试细胞,分别以不同浓度藏红花素0(空白对照组)、200、400、800 mg/L和LY294002(PI3K特异性抑制剂)15 mg/L干预对数生长期MCF-10A细胞和MCF-7细胞48 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、克隆形成实验分别检测各组细胞增殖抑制率、细胞克隆能力,Annexin V-FITC染色法检测细胞凋亡水平,运用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶9(cysteine aspartic proteases-9,Caspase-9)、激活型半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶3(cleaved cysteine aspartate protease-3,Cleaved caspase-3)、B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(bcl-2 related X protein,Bax)蛋白表达。结果:与空白对照组比较,200、400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-10A细胞增殖抑制率、克隆数目、凋亡率,差异均无统计学意义(P>0.05);400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-7细胞增殖抑制率升高、克隆数目降低、凋亡率升高(P<0.01);p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、Bcl-2表达下调且Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax表达上调(P<0.01),磷酸化率p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β降低(P<0.01),Bax/Bcl-2表达比值升高(P<0.01)。与LY294002组比较,800 mg/L藏红花素组MCF-7细胞增殖抑制率升高、克隆数目降低、凋亡率升高(P<0.05或P<0.01);Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax表达上调(P<0.05或P<0.01),Bax/Bcl-2比值升高(P<0.01),其他指标两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:藏红花素具有诱导人乳腺癌细胞凋亡的作用,其机制可能与抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路有关。

痛泻要方合四逆散对糖尿病KK-Ay小鼠胰岛素抵抗及PI3K/AKT/GSK-3β通路的影响

[目的]观察痛泻要方合四逆散对KK-Ay小鼠胰岛素抵抗及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β(PI3K/AKT/GSK-3β)信号通路的影响。[方法]采用雄性6~8周龄KK-Ay小鼠建立糖尿病模型,随机分为模型组、中药低中高不同剂量组,另取同周龄C57 BL/6J小鼠作为正常组,干预4周后,检测小鼠空腹血糖,空腹胰岛素水平及胰岛功能情况,并通过实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(real time PCR),蛋白免疫印迹(Western Blot)等方法检测小鼠肝脏中PI3K、AKT、GSK-3β的基因及蛋白磷酸化水平表达情况。[结果]与正常组相比,模型组小鼠空腹血糖和胰岛素抵抗指数明显升高(P<0.05),而PI3K、AKT、GSK-3β的磷酸化蛋白水平及基因表达水平均明显降低(P<0.05);与模型组相比,中药高剂量组空腹血糖和胰岛素抵抗指数明显降低(P<0.05),而PI3K、AKT、GSK-3β的磷酸化蛋白水平及基因表达水平均明显升高(P<0.05)。[结论]痛泻药方合四逆散可能通过影响PI3K/AKT/GSK-3β信号通路改善KK-Ay小鼠的胰岛素抵抗。

miR-98-5p靶向HMGA2通过PI3K/Akt/GSK-3β通路调控骨再生的机制研究

目的研究miR-98-5p靶向高迁移率族蛋白A2(HMGA2)通过PI3K/Akt/GSK-3β通路调控骨再生的机制。方法构建细胞培养模型,根据成骨细胞诱导分化中细胞类别不同分为mBMMSCs组、hBMMSCs组及MC3T3-E1组,并根据对成骨细胞质粒不同转染方法分为正常组、A组(MC3T3-E1细胞诱导分化)、B组(MC3T3-E1细胞诱导分化后转染mimic control)、C组(MC3T3-E1细胞诱导分化后转染miR-98-5p mimic)及D组(MC3T3-E1细胞诱导分化后转染miR-98-5p mimic和HMGA2 plasmid)。检测各组碱性磷酸酶(ALP)、miR-98-5p、Runt相关转录因子2(RUNX2)和Osterix mRNA、HMGA2 mRNA表达水平及HMGA2、Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白相对表达水平。比较各组MC3T3-E1细胞增殖和凋亡情况。结果与0 d时比较,mBMMSCs组、hBMMSCs组、MC3T3-E1组7、14 d时ALP、RUNX2及Osterix mRNA水平均明显上升,miR-98-5p mRNA水平下降(P<0.05)。miR-98-5p minic组wt-HMGA2荧光素酶活性低于mimic control转染组(P<0.01)。C组HMGA2 mRNA及HMGA2蛋白表达水平显著低于于A组、B组和D组(P<0.01)。与正常组比较,A、B、C、D组MC3T3-E1细胞内ALP、RUNX2、Osterix mRNA水平均显著增高(P<0.01)。与A组和B组比较,C组和D组MC3T3-E1细胞内ALP、RUNX2、Osterix mRNA水平降低,但D组上述指标显著高于C组(P<0.01)。与A、B组比较,C、D组MC3T3-E1细胞增殖活性显著降低,凋亡率及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相对表达水平显著升高,且D组上述指标较变化C组更显著(P<0.01)。与A组、B组比较,C、D组MC3T3-E1细胞p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达水平升高,且C组高于D组(P<0.01)。与A组、B组比较,C、D组MC3T3-E1细胞PI3K、Akt、p-GSK-3β及GSK-3β蛋白相对表达水平降低,且C组低于D组(P<0.01)。结论miR-98-5p可促进成骨细胞增殖分化及抑制其凋亡,作用机制可能与靶向作用HMGA2进行结合激活PI3K/Akt/GSK-3β通路,上调ALP磷酸化等有关。

基于PI3K/Akt/GSK-3β通路探究葛根素减轻癫痫小鼠症状的机制

目的:基于PI3K/Akt/GSK-3β通路探究葛根素减轻癫痫小鼠症状的机制。方法:SD小鼠随机分为对照组、模型组、LY294002(PI3K/Akt通路抑制剂)组、葛根素组、葛根素+LY294002组,除对照组外,其余各组建立癫痫小鼠模型,每组12只,分组处理后,检测各组小鼠癫痫发作情况;Morris水迷宫实验检测小鼠认知功能;以试剂盒检测小鼠脑组织MDA、SOD水平;ELISA检测小鼠血清IL-6、TNF-α水平;Western blot检测脑组织PI3K/Akt/GSK-3β通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组小鼠癫痫发作次数增加、持续时间延长、平均逃避潜伏期延长、脑组织MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平明显升高(P<0.05),穿越原平台位置次数减少,脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β、SOD水平明显降低(P<0.05)。与模型组相比,葛根素组小鼠癫痫发作次数减少、持续时间缩短、平均逃避潜伏期缩短、脑组织MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平降低(P<0.05),穿越原平台位置次数增加、脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β、SOD水平升高(P<0.05);LY294002组小鼠癫痫发作次数增加、持续时间延长、平均逃避潜伏期延长、脑组织MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平升高(P<0.05),穿越原平台位置次数减少、脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β、SOD水平降低(P<0.05)。与LY294002组相比,葛根素+LY294002组小鼠癫痫发作次数减少、持续时间缩短、平均逃避潜伏期缩短、脑组织MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平降低(P<0.05),穿越原平台位置次数增加、脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β、SOD水平升高(P<0.05)。与葛根素组相比,葛根素+LY294002组小鼠癫痫发作次数增加、持续时间延长、平均逃避潜伏期延长、脑组织MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平升高(P<0.05),穿越原平台位置次数减少、脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β、SOD水平降低(P<0.05)。结论:葛根素可能通过激活PI3K/Akt/GSK-3β通路抑制氧化应激及炎症,减轻其癫痫症状,改善癫痫小鼠认知功能。

基于PI3K/AKT/GSK-3β通路探讨远志散调控阿尔兹海默病大鼠tau蛋白磷酸化的研究

目的观察远志散对Aβ1-40所致阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease,AD)模型大鼠海马CA1区tau蛋白磷酸化的影响及其作用机制研究。方法 SPF级SD大鼠60只,随机分为6组,每组10只,雌雄各半。除假手术组外,其余各组大鼠双侧海马各注射Aβ1-40 5μL造模,假手术组给予同等剂量生理盐水。多奈哌齐组、远志散组分别给予盐酸多奈哌齐(1.02 mg/kg)、远志散不同剂量(低、中、高剂量组分别为3、6、12 g/kg)灌胃。给药8周后,每组各取6只,雌雄各半,免疫组化法检测海马CA1区tau蛋白磷酸化位点表达,及PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠海马CA1区P-Tau(Ser199)/tau5、P-Tau (Thr231)/tau5比值升高(P<0.001),P-AKT/AKT、P-GSK-3β/GSK-3β比值降低(P<0.001);与模型组相比,远志散各组大鼠海马CA1区P-Tau(Ser199)/tau5、P-Tau (Thr231)/tau5比值降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001),P-AKT/AKT、P-GSK-3β/GSK-3β比值升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论远志散可抑制Aβ1-40致AD模型大鼠海马CA1区tau蛋白磷酸化表达,其作用机制与调节PI3K/AKT/GSK-3β信号通路有关。

PI3K/Akt/GSK-3β通路介导ABC转运蛋白调控人结肠癌HCT-15细胞多药耐药

目的:研究PI3K/Akt信号通路是否通过下游糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)途径调控ABC转运蛋白的表达参与人结肠癌HCT-15细胞的多药耐药。方法:选用人结肠癌HCT-15细胞为实验对象,分别采用GSK-3β抑制剂(HY-19807)和PI3K/Akt通路抑制剂(HY-13898)处理细胞。CCK-8法检测奥沙利铂对细胞的半数抑制浓度,计算抑制率及耐药指数。Western blot法检测细胞内Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK3β-Ser9及ABC转运蛋白(P-gp和MRP-2)的水平。RT-qPCR法检测各组细胞内ABC转运蛋白mRNA的表达变化。流式细胞术检测不同抑制剂对细胞周期的影响。结果:应用GSK-3β抑制剂HY-19807处理后的HCT-15细胞,其奥沙利铂半数抑制浓度较对照组明显上升,并出现p-GSK3β-Ser9、P-gp和MRP-2蛋白水平的上调(P<0.05),Akt及p-Akt的蛋白水平变化不明显(P>0.05);RT-qPCR结果同样为ABCB1和ABCC2的mRNA表达量升高(P<0.01);同时细胞周期检测结果显示HY-19807处理能够促进HCT-15细胞由G 1期向S期过渡,细胞增殖旺盛。而应用PI3K/Akt通路抑制剂HY-13898作用于HCT-15细胞后,其奥沙利铂半数抑制浓度较对照组下降,并出现p-GSK3β-Ser9、p-Akt、P-gp和MRP-2的蛋白水平下调(P<0.01);RT-qPCR检测结果同样为ABCB1和ABCC2的mRNA表达量降低(P<0.01);同时出现G 1期延长,细胞由G 1期向S期过渡受到抑制,细胞的增殖受到抑制。各实验组总GSK-3β蛋白表达一致。结论:PI3K/Akt信号通路通过调控GSK-3β的磷酸化水平,改变ABC转运蛋白的表达,参与结直肠癌细胞的增殖与多药耐药。

洗心汤对胰岛素抵抗的阿尔茨海默病小鼠PI3K/AKT/GSK-3β通路的影响

目的:探究洗心汤对胰岛素抵抗(IR)的阿尔茨海默病(AD)小鼠模型中PI3K/AKT/GSK-3β通路的影响,阐明其缓解AD中IR及AD症状的分子机制。方法:通过高脂喂养APP/PS1小鼠并腹腔注射低浓度链脲佐菌素(STZ)构建AD-IR小鼠模型,然后给予洗心汤灌胃治疗。Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力,血糖仪检测小鼠空腹血糖水平,ELISA检测小鼠空腹胰岛素水平,试剂盒检测ROS、MDA、GSH-Px、SOD,蛋白质印迹检测小鼠脑组织中相关蛋白的表达水平。结果:AD-IR组小鼠较对照组逃避潜伏期显著增加(P<0.05),目标平台象限滞留时间与穿越平台次数均显著减少(P<0.05),空腹血糖、血清空腹胰岛素、胰岛素抵抗值升高(P<0.05),脑组织中ROS和MDA升高(P<0.05),SOD和GSH-Px降低(P<0.05),GLUT4、p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、Bcl-2蛋白降低(P<0.01),IRS1pS307、IRS1pS612、IRS1pS636、Aβ42、p-Tau、Bax、cleaved caspase-3蛋白升高(P<0.01)。经洗心汤治疗后,上述指标均显著改善(P<0.05,P<0.01)。结论:洗心汤能够激活AD-IR小鼠PI3K/AKT/GSK-3β通路,缓解小鼠脑组织中的IR,减轻AD症状及其诱导的损伤。

基于SMAD4/PI3K/AKT/GSK-3β通路研究叶酸预防砷诱导胎鼠先天性心脏病的分子机制

目的探索SMAD4/PI3K/AKT/GSK-3β通路在叶酸预防砷诱导胎鼠先天性心脏病中的可能作用机制。方法选取30只Sprague-Dawley大鼠随机分为:对照组、砷暴露组和叶酸+砷干预组。收集胎鼠心脏,H-E染色观察胎鼠心脏病理改变。TUNEL试剂和ki67免疫组织化学染色检测胎鼠心肌细胞凋亡/增殖状态。RT-PCR及WB测定胎鼠心脏组织中Smad4、Gata4、Nkx2.5及PI3K/AKT/GSK-3β通路的表达水平。CO-IP探索SMAD4和NKX2.5的相互作用关系。结果砷暴露组胎鼠先天性心脏病的发病率为13.3%,对照组和叶酸+砷干预组均为0%。砷暴露组的凋亡心肌细胞较对照组和叶酸+砷干预组显著增加,而增殖心肌细胞明显减少(P<0.05)。砷暴露组胎鼠心脏组织中Smad4、Gata4、Nkx2.5mRNA和蛋白水平相较于对照组和叶酸+砷干预组明显下调(P<0.05)。SMAD4和NKX2.5存在相互作用。砷暴露组胎鼠心脏组织的总PI3K、总AKT、总GSK-3β的蛋白表达水平相较于对照组和叶酸+砷干预组均无显著性差异(P>0.05),但p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β的蛋白表达水平比对照组和叶酸+砷干预组均显著性下调(P<0.05)。结论围孕期补充叶酸可缓解母鼠砷暴露引起的胎鼠心肌细胞增殖减少,凋亡增加,逆转砷暴露引起的Smad4的表达下调,修复砷导致的PI3K/AKT/GSK-3β通路损伤,减少砷诱导先天性心脏病的发生。

中药复方金思维含药血清调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路对拟阿尔茨海默病细胞模型tau蛋白磷酸化的影响

目的探讨中药复方金思维含药血清对拟阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)细胞模型tau蛋白磷酸化的影响及作用机制。方法采用Aβ25-35诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)建立拟AD细胞模型,CCK-8法筛选金思维含药血清、PI3K/AKT/GSK-3β通路抑制剂LY294002最佳作用浓度。将SH-SY5Y细胞分为正常组、模型组、金思维低剂量组、金思维中剂量组、金思维高剂量组以及LY294002组。蛋白免疫印迹法检测金思维含药血清对SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化以及PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白的影响。结果20μmol/L Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24 h可建立最佳拟AD细胞模型。相对于正常组,模型组P-AKT显著降低(P<0.05),P-tau显著升高(P<0.01)。相对于模型组,金思维低剂量含药血清组PI3K的表达量显著升高(P<0.05),高剂量含药血清组GSK-3β的表达量显著降低(P<0.05),中剂量和高剂量含药血清组P-tau的表达量显著降低(P<0.01、P<0.001)。加入通路抑制剂LY294002后,P-PI3K、PI3K、P-AKT、AKT、GSK-3β、P-tau蛋白的表达量较模型组差异无统计学意义(P>0.05)。结论金思维含药血清可降低拟AD细胞模型tau蛋白磷酸化水平,其机制可能与PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活有关。

益智仁-乌药药对调控PI3K/Akt/mTOR通路介导细胞自噬保护肾小球足细胞的作用机制研究

目的研究益智仁-乌药药对通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进足细胞自噬治疗糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)的作用。方法60只造模成功的C57BL/KSJ-db/db(以下简称db/db)小鼠随机分为模型组、二甲双胍组、缬沙坦组、益智仁-乌药药对(低、中、高剂量)组,每组10只;另取10只C57BL/KSJ-db/m(以下简称db/m)小鼠为正常组,正常组和模型组给予生理盐水,治疗组小鼠分别给予相应药物,给药8周后检测小鼠肾脏病理学改变,足细胞自噬体数量、结构及相关蛋白表达。结果与模型组相比,益智仁-乌药药对组可显著减轻糖尿病肾病小鼠肾小球基底膜增厚情况,增加足细胞自噬体数量,显著升高自噬相关蛋白表达(P<0.05),降低PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达(P<0.05)。其中益智仁-乌药药对高剂量组各指标改善优于益智仁-乌药低、中剂量组。结论益智仁-乌药药对通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活,提高足细胞自噬水平,减轻足细胞损伤,发挥治疗糖尿病肾病的作用。

自拟平衡针灸通过调控PI3K-AKT信号通路及血清GABA水平对老年失眠的治疗作用

目的探讨自拟平衡针灸通过调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路及血清氨基丁酸(GABA)水平对老年失眠的治疗作用。方法以老年失眠患者120例作为研究对象,按照随机分组原则分为研究组及对照组,各60例。两组均采取阿普唑仑进行治疗,研究组在此基础上联合采取自拟平衡针灸进行治疗,两组均治疗4 w。比较两组治疗效果、临床改善指标、PI3K-AKT信号通路及GABA、多导睡眠监测仪指标、睡眠质量之间的差异。结果研究组治疗总有效率显著高于对照组(P<0.05)。治疗后,两组睡眠潜伏期、睡眠总时间及觉醒次数均显著改善,且研究组睡眠潜伏期、觉醒次数显著低于对照组(P<0.05),睡眠总时间显著高于对照组(P<0.05)。两组PI3K、AKT及GABA均显著改善,且研究组PI3K、AKT显著低于对照组,GABA显著高于对照组(P<0.05)。两组总睡眠时间(TST)、睡眠效率(SE),第一(TS1)、二(TS2)、三(TS3)及四期(TS4)睡眠、快速眼动睡眠时间(REM)、觉醒期时间(WASO)、睡眠潜伏期时间(SL)均显著改善,且研究组以上指标改善均显著优于对照组(P<0.05)。两组日间功能障碍、睡眠质量、睡眠时间、睡眠障碍及入睡时间均显著改善,且研究组日间功能障碍、睡眠质量、睡眠时间、睡眠障碍及入睡时间显著优于对照组(P<0.05)。结论自拟平衡针灸通过调控PI3K-AKT信号通路及血清GABA水平,有效降低局部炎性反应,优化神经系统的递质传递,有效改善患者的治疗效果。

达沙替尼基于PI3K/AKT信号通路调节乳腺癌细胞生物学行为

目的:基于PI3K/AKT信号通路探讨达沙替尼(dasatinib,DAS)对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响。方法:分别使用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法、Transwell法、流式细胞术和Western blotting法检测DAS不同浓度(0、2、6、10μmol/L)作用下MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移、细胞凋亡以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达情况。同时设置对照组(溶媒对照)、DAS组(DAS 10μmol/L)、PI3K抑制剂组(LY29400220μmol/L)、联合组(DAS 10μmol/L+LY29400220μmol/L),比较各组细胞增殖、侵袭和迁移、细胞凋亡以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达情况。结果:随着DAS作用浓度的升高,MCF-7细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高(P<0.05),侵袭细胞数、迁移细胞数和PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低(P<0.05)。与对照组相比,DAS组、PI3K抑制剂组、联合组MCF-7细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高(P<0.05),PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低。与PI3K抑制剂组、DAS组相比,联合组MCF-7细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高,PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低(P<0.05)。结论:DAS能抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移能力,诱导细胞凋亡,其机制可能与调控PI3K/AKT信号通路有关。

重楼皂苷Ⅰ预防给药对心肌缺血再灌注损伤大鼠调节PI3K/AKT信号通路的作用研究

目的 从磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路探讨重楼皂苷I预防给药对心肌缺血再灌注损伤(MI/IR)大鼠的干预机制。方法 将购买的72只SPF级SD大鼠按照随机数字法分为假手术组、模型组、阿司匹林组、重楼皂苷I低、中和高剂量组,每组12只。分组后即给予相应药物干预2周,2周后构建MI/IR模型。模型构建成功24 h后先采用动物彩色多普勒超声仪检测心脏功能,后处死大鼠收集相关组织采用HE染色观察心肌病理学、TTC法检测心肌梗死面积,试剂盒检测心功能指标[乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)和谷草转氨酶(AST),抗氧化指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)],TUNNEL染色检测心肌细胞凋亡特点,Western blot检测心肌PI3K、AKT、B细胞淋巴瘤/因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)蛋白表达。结果 假手术组心肌纤维排列整齐、无水肿,模型组有心肌纤维断裂,重楼皂苷I低、中、高剂量组和阿司匹林组明显改善心肌纤维断裂情况。与假手术组相比,模型组大鼠心肌梗死面积、LVEDP、LDH、CK-MB、AST和MDA明显升高(P<0.05),LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、SOD和GSH明显降低(P<0.05);相较于模型组,阿司匹林组和重楼皂苷I低、中、高剂量组干预后,心肌梗死面积、LVEDP、LDH、CK-MB、AST和MDA明显降低(P<0.05),LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、SOD和GSH则明显升高(P<0.05)。Tunnel染色可见,假手术组几乎没有心肌细胞凋亡,而模型组呈现出明显的大量的细胞凋亡;与模型组相比,阿司匹林组和重楼皂苷I低、中、高剂量组凋亡情况明显好转。此外,与假手术组相比,模型组大鼠心肌PI3K、AKT和Bcl-2蛋白表达均明显降低,Bax明显升高(均P<0.05);相较于模型组,重楼皂苷I低、中、高剂量组以及阿司匹林组PI3K、AKT和Bcl-2蛋白表达均明显升高,Bax蛋白表达明显降低(均P<0.05)。结论 重楼皂苷I对心肌缺血再灌注损伤有一定的预防作用,其作用机理可能与其能够调节PI3K/AKT信号通路有关。

(Pyr1)Apelin-13对布比卡因诱导停搏乳鼠心肌细胞PI3K/Akt通路的干预

目的:探讨Apelin/APJ系统在逆转布比卡因心肌毒性中的作用及机制。方法:提取乳鼠心肌细胞进行原代培养,随机分为4组:空白培养基组(DMSO组)、布比卡因1 mmol/L(Bup组)、(Pyr1)Apelin-132μmol/L组(Apl组)和布比卡因1 mmol/L+(Pyr1)Apelin-132μmol/L组(BAp组)。记录各组细胞基础自主搏动次数后,按照相应分组给药处理6 h。处理完毕后时间记为T0,记录T0至T12不同时间的细胞搏动次数;电镜下观察T12时心肌细胞线粒体形态;比色法检测T12时细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)含量;ELISA检测T12时心肌细胞中Apelin-13浓度;Western blot检测T12时心肌细胞中APJ、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白的表达。结果:T0时Bup组全部心肌细胞停止搏动。与DMSO组比较,Bup组细胞搏动次数显著减少(P<0.05),线粒体肿胀空泡化,培养液LDH含量明显上升(P<0.05),心肌细胞中Apelin-13、APJ、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均下调(P<0.05)。与Bup组比较,BAp组细胞搏动次数显著增加(P<0.05),线粒体结构明显改善,培养液LDH含量明显下降(P<0.05),心肌细胞中Apelin-13,APJ、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均上调(P<0.05)。结论:(Pyr1)Apelin-13可逆转布比卡因诱导的心肌细胞停搏,机制也许与激活PI3K/Akt蛋白磷酸化有关。

基于PI3K/Akt通路研究蛇伤胶囊调节血小板活化功能治疗竹叶青蛇伤凝血障碍机制

目的基于PI3K/Akt通路研究蛇伤胶囊调节血小板活化功能治疗竹叶青蛇伤凝血障碍机制。方法24只新西兰大白兔被随机分为正常对照组、模型组、蛇伤胶囊组,每组8只雌雄各半,根据前期研究方法模型组和蛇伤胶囊组以兔耳缘静脉注射0.75 mg/kg竹叶青蛇毒液,建立竹叶青蛇伤兔模型,正常对照组注射等量生理盐水。注射后6 h后予正常对照组和模型组以10 ml/(kg·d)生理盐水灌胃,蛇伤胶囊组予10 ml/(kg·d)蛇伤胶囊所配药液灌胃。以上3组连续灌胃1周后兔耳缘静脉采血5 ml,血小板分离提取后Western blot检测各组血小板细胞PTEN、PI3K、Akt蛋白表达,qPCR检测各组血小板活化指标CD62P mRNA表达。结果与正常对照组相比,模型组血小板细胞PTEN蛋白表达增加(P<0.01),PI3K、Akt蛋白及CD62P mRNA表达减少(P<0.01);与模型组相比,蛇伤胶囊组血小板细胞PTEN蛋白表达减少(P<0.01),PI3K、Akt蛋白及CD62P mRNA表达增加(P<0.01)。结论蛇伤胶囊可通过上调PI3K/Akt通路,改善竹叶青蛇伤导致的血小板活化功能受抑制,从而治疗竹叶青蛇伤凝血障碍。

葛根芩连汤通过IRS-1/PI3K/AKT通路对胃肠湿热型2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响

目的探究葛根芩连汤通过胰岛素受体底物-1(IRS-1)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路对胃肠湿热型2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响。方法将40只SD大鼠随机分为正常组(2 mL生理盐水灌胃)、造模组(2 mL生理盐水灌胃)、二甲双胍组(4.17 mg/100 g二甲双胍灌胃)和葛根芩连汤组(1 g/100 g葛根芩连汤灌胃),每组10只。采用高脂高糖饲料加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建2型糖尿病大鼠模型,随后喂食油脂、42°白酒及蜂蜜水构建胃肠湿热型2型糖尿病大鼠模型。测量各组大鼠不同时间节点体质量,血糖仪测定空腹血糖(FBG);ELISA检测空腹胰岛素(FINS)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平变化、计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);HE染色检测肝组织病理学变化;检测肝组织过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量变化。Western blot检测肝组织IRS-1、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白变化。结果与正常组比较,造模组大鼠体质量、FBG、FINS及HOMA-IR、GSH-Px、CAT、SOD、IRS-1、p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT水平均明显下降(P<0.05)、TG、TC、IL-6、TNF-α及MDA含量均显著升高(P<0.05),可见局灶性肝实质损失。与造模组比较,二甲双胍组及葛根芩连汤组大鼠体质量、FBG、FINS及HOMA-IR、GSH-Px、CAT、SOD、IRS-1、p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT水平均明显升高(P<0.05)、TG、TC、IL-6、TNF-α及MDA含量均显著降低(P<0.05),显示正常的肝实质。结论葛根芩连汤可明显改善胃肠湿热型2型糖尿病糖脂紊乱,可能是通过IRS-1/PI3K/AKT通路发挥作用。

黄芪影响缺氧微环境中骨髓间充质干细胞增殖活性的PI3K-AKT信号通路分析

基于PI3K/AKT信号通路研究黄芪对缺氧环境中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的细胞活性的影响。分别以黄芪冻干粉溶液低、中、高剂量(100、200和300μg·mL^(-1))干预低氧浓度(10%)环境中成骨分化培养的BMSCs,通过高内涵实时成像系统观察BMSCs动态增殖情况及分化代数;进行无标记示踪模拟细胞运动轨迹,分析各组细胞运动速度、位移距离和路程的情况;通过激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位,通过免疫荧光和RT-PCR检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白和基因表达水平的变化。结果显示:与对照组相比,10%低氧浓度条件下BMSCs增殖减慢、分化代数减少,运动速度减慢,位移距离和路程减少,线粒体膜电位活性降低,p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PI3K和AKT基因表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与低氧组相比,黄芪冻干粉溶液干预后,能显著维持缺氧环境中BMSCs增殖和分化活性,运动活力升高,线粒体膜电位活性提高,p-JAK2、p-STAT3蛋白和PI3K、AKT基因表达升高,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。黄芪可能通过激活PI3K/AKT信号通路维持缺氧条件下BMSCs的增殖活性。

Yes相关蛋白(YAP)通过激活PI3K/AKT通路促进皮肤鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移

目的探讨Yes相关蛋白(YAP)在皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中表达及与cSCC侵袭和迁移中的作用。方法通过免疫组织化学染色法检测cSCC、鲍温病(BD)、癌旁正常皮肤组织中YAP的表达水平,并分析与临床病理参数之间的关系;利用慢病毒转染构建YAP基因敲低的A431稳定细胞株,利用四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽检测A431细胞微丝分布和数量,Transwell TM实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测A431细胞的迁移能力;免疫荧光细胞化学染色法观察敲低YAP后上皮间质转化(EMT)相关标志物上皮钙黏素(E-cadherin)、锌指转录因子Snail的表达;Western blot法检测E-cadherin、Snail、β-catenin、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)、核糖体蛋白S6(S6)、磷酸化S6(p-S6)、4E结合蛋白1(4EBP1)、磷酸化的4EBP1(p-4EBP1)的表达。结果YAP在cSCC和BD中表达显著高于癌旁正常皮肤组织;cSCC中YAP高表达与肿瘤大小、分化程度、侵袭程度密切相关,与患者的性别、年龄、发病部位、形态类型、是否神经脉管侵犯不相关;敲低A431细胞中YAP后,肿瘤细胞的侵袭、迁移能力降低,细胞微丝变细、伪足变少;E-cadherin表达增加,Snail和β-catenin蛋白表达降低,p-AKT、p-S6及p-4EBP1蛋白表达降低。结论YAP在cSCC中高表达,YAP激活PI3K/AKT信号通路促进cSCC的侵袭、迁移及EMT过程。

基于PI3K/Akt/p53信号通路探讨白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物诱导急性髓系白血病细胞凋亡的作用

目的通过评估白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物(EAEHDW)对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/p53信号通路传导调节作用,探讨其抑制急性髓系白血病M2型(AML-M2)细胞株Kasumi-1增殖及诱导凋亡的机制。方法利用乙酸乙酯从白花蛇舌草中萃取制备得到EAEHDW,高效液相色谱串联质谱装置检测样品纯度。设置空白组,将浓度分别为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的EAEHDW加入对数生长期的Kasumi-1细胞株,采用MTT法检测不同浓度EAEHDW作用不同时间后Kasumi-1细胞存活率,采用Annexin V/PI流式细胞术检测不同浓度EAEHDW作用24 h后Kasumi-1细胞凋亡情况,采用Western blot法检测不同浓度EAEHDW(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL)作用24 h后Kasumi-1细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族蛋白及PI3K/Akt/p53信号传导通路蛋白表达情况。结果不同浓度的EAEHDW干预后,细胞存活率较空白组明显降低,细胞凋亡率较空白组明显升高,且细胞存活率随着作用时间的延长和药物浓度的增加而下降越明显,细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高越明显,差异均有统计学意义(P均<0.05);不同浓度的EAEHDW作用于Kasumi-1细胞后,细胞中多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、细胞色素C(Cyto-C)、p53蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、鼠双微染色体2(MDM2)、磷酸化MDM2(p-MDM2)蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论EAEHDW可明显抑制髓系白血病Kasumi-1细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与影响Caspase家族蛋白表达和抑制PI3K/Akt/p53信号通路导致p53激活有关。

益髓破血方对脑出血小鼠肠道菌群和PI3K/Akt信号通路调节的作用机制研究

目的:探讨益髓破血方对脑出血小鼠PI3K/Akt信号通路的调节及肠道菌群的影响。方法:SPF级C57BL/6J小鼠150只,随机分为假手术组、模型组和中药组,每组48只,模型组与中药组自体血注入法复制脑出血小鼠模型,假手术组只插入微量注射针数分钟不注血。灌胃干预后于1、3、7 d取材,观察小鼠神经功能评分,干湿重法观察脑含水量,HE染色观察脑组织病理学变化,ELISA法检测TNF-α、IL-4、IL-18含量,Western blot法检测PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平,16s rDNA基因测序观察各组小鼠肠道菌群多样性、种属变化。结果:与模型组比较,中药组3 d、7 d神经功能评分与脑含水量降低(P<0.05),变性神经元减少(P<0.05),TNF-α、IL-18浓度降低(P<0.05),IL-4浓度升高(P<0.05),p-PI3K、p-Akt表达量下降,7 d较3 d更为显著(P<0.05)。模型组小鼠菌群多样性降低,瘤胃球菌科等相对丰度增加,益髓破血方可丰富菌群多样性,使乳酸杆菌属等相对丰度增加。结论:益髓破血方通过增加肠道有益菌,降低致病菌,丰富菌群多样性,以及调控PI3K/Akt通路改善脑出血继发性损伤。