瓜蒌皮水提物通过PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制缺血缺氧大鼠原代心肌细胞的凋亡

以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路、抑制心肌细胞凋亡为切入点,探究瓜蒌皮水提物(TP-W)保护心肌缺血的机制.分离大鼠心肌细胞,通过缺氧气体+无血清培养液培养制造缺血缺氧损伤模型,以模拟急性心肌缺血时的体内心肌细胞环境;同时添加PI3K特异性抑制剂(LY294002)和TP-W处理细胞,利用倒置相差显微镜观察细胞形态,噻唑兰法、末端标记法分别检测细胞存活率及凋亡率,免疫荧光联合免疫印迹方法定位、定量地检测细胞内PI3K、Akt及eNOS蛋白表达及磷酸化水平.结果显示:对上述缺血缺氧损伤的心肌细胞,TP-W可显著改善其生长状态、提高存活率、降低凋亡率;同时显著上调上述3种蛋白表达水平及磷酸化水平,但磷酸化水平均可被LY294002处理显著削弱.可见,激活PI3K/Akt/eNOS信号通路、抑制心肌细胞凋亡可能是TP-W抗心肌缺血的重要机制,也是中药“开胸除痹”的关键生物学内涵.

瓜蒌薤白半夏汤通过调整氧化应激激活PI3K/Akt/eNOS通路发挥对Ⅱ型糖尿病合并急性心肌缺血的保护作用

以调整氧化应激状态、激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路为切入点,探讨瓜蒌薤白半夏汤(GXBD)保护Ⅱ型糖尿病合并急性心肌缺血(T2DM-AMI)的作用机制.将36只大鼠随机分为对照组(Ctrl组)、模型组(T2DM-AMI组)、处理组(GXBD组),每组12只.对T2DM-AMI组、GXBD组联合使用灌服高脂乳剂、腹腔注射链脲佐菌素、冠脉结扎3种方法制造T2DM-AMI大鼠模型.四唑红染色检测心肌梗死率,苏木精-伊红染色检测其病理损伤情况;酶联免疫吸附法检测血浆氧化损伤成分氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、晚期糖基化终产物(AGEs)、黄嘌呤氧化酶(XO)、髓过氧化物酶(MPO),血浆抗氧化成分一氧化氮(NO)、硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的水平或活性,以及总活性氧(T-ROS)的水平和总抗氧化能力(T-AOC);蛋白免疫印迹法检测心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的表达及磷酸化水平,实时荧光定量PCR检测其中Pi3k、Akt和eNos基因的mRNA表达水平.结果显示T2DM-AMI大鼠心肌梗死严重,血浆中上述4种氧化损伤成分的水平或活性及T-ROS水平显著升高,3种抗氧化成分的水平或活性及T-AOC显著降低,心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的表达及磷酸化水平显著下调,相应基因的mRNA表达水平同样显著下降,而GXBD干预可显著逆转这些病理性变化.综上,GXBD可能通过提高抗氧化能力、清除自由基、纠正异常的氧化应激状态、激活心肌组织中PI3K/Akt/eNOS信号通路,发挥对T2DM-AMI的保护作用.

益景汤经PI3K/AKT/eNOS信号通路拮抗高糖诱导的视网膜血管内皮细胞损伤

目的探讨益景汤对高糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞损伤的拮抗作用及机制。方法将大鼠视网膜微血管内皮细胞随机分为5组:对照组(CG)、高糖组(HG)、低浓度益景汤组(LYG)、中浓度益景汤组(MYG)、高浓度益景汤组(HYG)。细胞生长至80%~90%时,往高糖组及益景汤组培养基中加入33 mmol/L葡萄糖培养3 d造高糖内皮细胞损伤模型,第4天按分组加入相应正常糖培养基及各浓度益景汤培养24 h。使用CCK-8试剂盒检测内皮细胞活性,Transwell法观察内皮细胞迁移,荧光聚合酶链式反应(PCR)检测细胞间紧密连接蛋白ZO-1及内皮细胞磷脂酰肌醇三羟基激酶(PI3K)、苏氨酸蛋白激酶(AKT)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的信使RNA(mRNA)表达。结果高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞活性降低,与对照组比较,差异有统计学意义(均P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞活性均高于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞迁移增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞迁移均低于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞间连接蛋白ZO-1及内皮细胞PI3K、AKT、eNOS的mRNA表达量均降低,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞间连接蛋白ZO-1及内皮细胞PI3K、AKT、eNOS的mRNA表达量均高于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论益景汤能经PI3K/AKT/eNOS信号通路抑制高糖诱导视网膜微血管内皮细胞迁移,提高细胞活性,减轻细胞损伤。

基于VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路探讨木犀草素干预A型流感病毒的作用机制

目的探讨木犀草素对A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染的小鼠肺上皮细胞损伤模型的作用机制。方法将小鼠肺上皮MLE-12细胞分为正常组、模型组、奥司他韦组、高剂量组和低剂量组,除正常组外,其余4组均使用IAV感染,正常组加入等量病毒稀释液;2 h后弃病毒工作液,正常组和模型组加入病毒维持液,药物组加入用病毒维持液稀释的药物工作液,干预8 h后收集细胞。使用CCK-8检测细胞增殖情况;ELISA实验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达;免疫荧光检测细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达情况;RT-qPCR技术检测细胞内VEGF、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA表达情况;Western blot法检测细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS蛋白表达情况。结果CCK-8结果显示,不同浓度的木犀草素均能降低IAV感染所致的细胞损伤(P<0.01),其EC50值为7.204μmol/L,因此,将后续实验中的木犀草素药物浓度定为5μmol/L和2.5μmol/L。与正常组相比,模型组细胞上清液中TNF-α和IL-6升高(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度增强(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达升高(P<0.01);与模型组相比,高剂量组和低剂量组细胞上清液中TNF-α和IL-6降低(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度减弱(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达降低(P<0.01)。结论木犀草素能抑制炎性细胞因子的分泌,缓解IAV感染所致的细胞损伤,其过程可能与VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。

“调神畅志”法针刺对帕金森伴便秘模型大鼠结肠组织PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响

目的:探讨“调神畅志”针法对帕金森(PD)伴便秘大鼠结肠组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/AKT/eNOS)信号通路关键标志物(PI3K、AKT、p-Akt及eNOS)的影响,并探究此针法治疗的机制。方法:采用颈背部皮下注射鱼藤酮的方法制造PD伴便秘大鼠模型,并用APO诱导检测。40只造模成功大鼠随机分为模型组、西药组、常规针刺组与调神畅志组,每组10只,另空白组、假手术组各10只,共计60只,予相应干预4周。采用Western blot法检测各组大鼠远端结肠组织中PI3K、AKT、p-Akt蛋白表达和eNOS含量。结果:与空白组相比,模型组大鼠远端结肠组织中PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达显著降低,eNOS含量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,西药组、常规针刺组和调神畅志组远端结肠组织PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达均明显升高,eNOS含量均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与常规针刺组比较,调神畅志组PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达明显较高,eNOS含量显著较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:针刺能够改善PD伴便秘大鼠模型便秘症状,且调神畅志针刺优于常规针刺,PI3K/AKT/eNOS信号通路的激活是调神畅志针法的治疗机制之一,其作用机制是通过上调大鼠远端结肠组织中PI3K/AKT/eNOS信号通路中PI3K、AKT、p-Akt的蛋白表达和降低eNOS含量来实现的。

基于PI3K/Akt/eNOS信号通路探究孙氏助孕方治疗肾虚血瘀薄型子宫内膜大鼠的作用机制

目的:观察孙氏助孕方治基于磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮一氧化氮合成酶(eNOS)信号通路的研究机制。方法:选取广州市固堡生物科技有限公司提供的40只3个月月龄斯泼累格•多雷(SD)农场雌性大鼠进行研究,将所有大鼠按随机数表法分为正常组、模型组、对照组和观察组,每组各10只。观察组大鼠每天饮食自由摄入,其他组大鼠均予以造模,模型组未应用药物;对照组给予戊酸雌二醇疗法;观察组给予孙氏助孕方治疗。治疗后采集两组大鼠子宫内膜组织后,使用实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测PI3K、Akt、eNOS的mRNA基因表达水平及蛋白表达情况。对比两组大鼠子宫内膜厚度以及PI3K、Akt以及eNOS的mRNA基因表达水平及蛋白图像,分析孙氏助孕方对肾虚血瘀薄型子宫内膜的PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响。结果:与对照组比较,观察组大鼠的子宫内膜厚度差异不明显,差异无统计学意义(t=0.74,P>0.05);与模型组比较,观察组的大鼠子宫内膜厚度增高明显,差异有统计学意义(t=22.61,P<0.05);与正常组比较,观察组大鼠子宫内膜厚度稍低,差异无统计学意义(t=0.43,P>0.05);观察组大鼠的P13K、Akt、eNOS的mRNA基因表达水平、蛋白表达显著高于空白组,差异有统计学意义(t=10.10、21.71、18.13,P<0.05);而观察组大鼠的P13K、Akt、eNOS的mRNA基因表达水平、蛋白表达与对照组相比,差异无统计学意义(t=0.38、0.52、0.51,P>0.05);与对照组相比,模型组大鼠P13K、Akt、eNOS的mRNA基因表达、蛋白表达水平明显下降,差异有统计学意义(t=10.56,29.36,30.56,P<0.05)。结论:中药经验方“孙氏助孕方”可从血管生成的信号通路方面改善子宫内膜厚度的作用机制。

PI3K/Akt/eNOS信号通路在葛根素抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞组织因子表达中的作用

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信号通路在葛根素(puerarin)抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管内皮细胞组织因子(tissue factor,TF)表达中的作用。方法:实时荧光定量PCR检测TF的mRNA表达,Western blot检测TF和Akt的蛋白表达,硝酸盐还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。结果:与对照组相比,ox-LDL孵育内皮细胞后,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化水平降低,细胞内NO产生减少;而葛根素预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF mRNA和蛋白表达下降,Akt蛋白磷酸化升高,细胞内NO产生增多;PI3K抑制剂LY294002和葛根素共同预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化降低,细胞内NO产生减少;eNOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和葛根素共同预孵育内皮细胞,也明显阻断葛根素对ox-LDL诱导的内皮细胞TF mRNA和蛋白表达、细胞Akt蛋白磷酸化和细胞内NO产生的作用。结论:葛根素可通过上调PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞TF mRNA和蛋白表达。

枸杞多糖通过调控PI3K/Akt/eNOS信号通路对去卵巢大鼠心肌产生抗氧化作用

目的:观察枸杞多糖对去卵巢大鼠心肌PI3K/Akt/e NOS信号通路的影响。方法:将30只SD雌性大鼠随机分为假手术组、去卵巢组、补佳乐组、枸杞多糖高剂量组及枸杞多糖低剂量组,ELISA法比较各组血清雌激素、LDH及CK水平,检测心肌H_2S含量及氧化应激损伤相关指标,HE染色观察各组心肌的形态变化,Western blot法检测各组大鼠心肌e NOS蛋白及PI3K/Akt通路蛋白的表达。结果:与假手术组相比,去卵巢组大鼠血清雌二醇水平降低,心肌H_2S含量和GSH-Px活性下降,心肌e NOS蛋白及PI3K/Akt通路蛋白的表达均有所降低,心肌ROS活性和MDA含量升高(P<0.05),心肌细胞排列紊乱,细胞间隙增大,血清LDH和CK活性均增多;与去卵巢组比较,枸杞多糖高剂量组大鼠血清雌二醇含量增加(P<0.05),心肌H_2S含量、GSH-Px活性、e NOS蛋白及Akt磷酸化水平均提高,心肌ROS活性和MDA含量下降(P<0.05),血清LDH和CK活性均降低,并且改善大鼠心肌形态的变化。结论:枸杞多糖可以通过调控PI3K/Akt/e NOS通路改善去卵巢大鼠心脏变化防治绝经后心血管病变。

益气健脾通便方对慢传输型便秘大鼠PI3K/Akt/eNOS信号途径作用机制研究

目的:观察益气健脾通便方对慢传输型便秘大鼠磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信号通路的影响,探讨其治疗慢传输型便秘的作用机制。方法:共纳入60只SPF级8周龄wister大鼠,将50只大鼠运用“复方地芬诺酯灌胃法”造成慢传输型便秘模型后,随机分成模型组、莫沙必利组、益气健脾通便方低、中、高剂量组,每组各10只,其余10只大鼠设成正常对照组。各组大鼠连续给药4周,以大鼠一般情况、首粒黑便排出时间、粪便含水率、结肠组织一氧化氮(NO)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量、磷酸化蛋白激酶B(P—Akt)阳性细胞面积及蛋白水平表达为观察指标。结果:益气健脾通便方各组均能明显提高大鼠粪便含水率(P<0.05),缩短首粒黑便排出时间(P<0.05),减少结肠组织NO及eNOS含量(P<0.05),提高结肠组织P—Akt阳性细胞面积及蛋白表达量(P<0.05),从而改善模型大鼠便秘症状,以中、高剂量疗效最为显著。结论:益气健脾通便方对慢传输型便秘大鼠具有治疗作用,其作用机制可能与其调控PI3K/Akt/eNOS信号途径有关。

基于PI3K/AKT/eNOS信号通路探讨健脾利湿化瘀方抑制前列腺癌血管生成的实验研究

[目的]在健脾利湿化瘀方临床疗效和前期实验的基础上,继续探讨健脾利湿化瘀方及其拆方在抑制人前列腺癌PC-3细胞荷瘤小鼠血管生成方面的作用,及其对PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响。[方法]选取6~8周雄性裸鼠36只建立人前列腺癌荷瘤小鼠模型,随机分为空白对照组、西药组、全方组、君药组、臣药组和佐药组。实验各组干预14 d后处死取血称瘤质量,计算抑瘤率;使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中血管内皮生长因子(VEGF)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS);免疫组化法观察各组瘤组织中VEGF、ANG1的表达;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测肿瘤组织中磷脂酰肌3-羟激酶(PI3K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)、eNOS蛋白表达水平。[结果]各给药组瘤体积、瘤质量均低于空白对照组(P<0.01),西药组、全方组、君药组、臣药组、佐药组的抑瘤率分别为53.95%、41.05%、19.21%、27.37%、31.32%,拆方组间比较,佐药组抑瘤效果较好,但无统计学差异(P>0.05);ELISA检测显示:各组VEGF、eNOS含量均低于空白对照组,其中西药组、全方组显著降低(P<0.05或P<0.01);Western Blot结果显示:各组PI3K、eNOS的蛋白表达均显著降低(P<0.05或P<0.01),AKT蛋白表达无显著变化(P>0.05),p-AKT呈降低趋势(P<0.05),其中西药组、全方组、佐药组呈显著下降(P<0.01)。[结论]尽管与西药对比抑瘤作用较弱,但中药健脾利湿化瘀方对前列腺癌在血管生成方面具有确切的抑制作用,尤其是具有化瘀消癥散结作用的佐药组,可能与姜黄、王不留行中某些有效成分能够下调PI3K、eNOS蛋白,影响AKT磷酸化,阻断PI3K/AKT/eNOS信号通路相关。

红景天苷通过激活AMPK/PI3K/Akt/eNOS途径减轻ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化

目的探究红景天苷对ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响及所涉及的相关分子机制。方法将ApoE(-/-)小鼠分为正常饮食组(ND组),高脂肪饮食组(HFD组),AMPK激活剂组(AC组),低(L-SAL组)、高(H-SAL组)剂量红景天苷组。应用苏丹Ⅳ染色、HE染色和Masson染色行ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化病变分析;应用主动脉内皮依赖性舒张功能实验检测Apo E(-/-)小鼠主动脉血管内皮舒张功能;应用免疫组织化学分析主动脉p-AMPK、p-PI3K、p-Akt、p-e NOS蛋白表达情况;应用蛋白免疫印迹分析ApoE(-/-)小鼠AMPK、PI3K、Akt、eNOS蛋白磷酸化水平。结果与ND组小鼠相比,HFD组病变区面积、斑块面积均显著增加,而胶原含量显著降低(P<0.05)。与HFD组相比,L-SAL组和H-SAL组病变区面积、斑块面积均显著降低(P<0.05),胶原含量显著增加(P<0.05),且H-SAL组与L-SAL组差异有统计学意义(P<0.05)。与ND组相比,HFD组内皮依赖性舒张功能显著降低(P<0.05)。与HFD组相比,L-SAL组和H-SAL组内皮依赖性舒张功能均显著增加(P<0.05)。与ND组相比,HFD组p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)MOD值均显著降低(P<0.05)。与HFD组相比,AC组、L-SAL组和H-SAL组p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)MOD值均显著增加(P<0.05)。与ND组相比,HFD组p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)蛋白表达显著降低(P<0.05)。与HFD组相比,L-SAL组和H-SAL组p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)蛋白表达显著增加(P<0.05)。H-SAL组与AC组各项指标相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论红景天苷能够通过激活AMPK/PI3K/Akt/e NOS信号级联,改善与e NOS活化相关的血管内皮功能,从而减轻Apo E(-/-)小鼠动脉粥样硬化病变。

柚皮苷调控PI3K/Akt/eNOS通路控制2型糖尿病大鼠脑血管内皮氧化损伤的作用探讨

目的探讨柚皮苷对2型糖尿病大鼠脑血管内皮氧化损伤的治疗效果,以及柚皮苷对3-磷酸肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/内皮型一氧化氮(eNOS)信号通路的调控作用。方法 2019年3月15日至2020年5月20日,将SD大鼠(南京医科大学实验动物中心)按随机字母表法分为4组,对照组大鼠给予标准饲料,其他组给予高糖高脂饲料。通过腹腔注射60 mg/kg的链脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病模型,柚皮苷组大鼠灌胃100 mg/kg的柚皮苷溶液,柚皮苷+LY294002组大鼠在灌胃100mg/kg的柚皮苷溶液的基础上腹腔注射100 mg/kg的PI3K抑制剂LY294002。治疗8周后,分别检测各组大鼠空腹血糖、一氧化氮(NO)、血脂代谢指标[总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]、脑组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。苏木精-伊红(HE)染色评价脑组织病理改变。蛋白质印迹法(Western blotting)检测脑组织中PI3K/Akt/eNOS通路的活化情况。结果柚皮苷组的空腹血糖(13.46±1.09)mmol/L、TC(1.65±0.13)mmol/L、TG(2.89±0.23)mmol/L、LDL-C(1.59±0.13)mmol/L、MDA(55.17±4.24)U/mgprot水平均低于模型组[空腹血糖(25.32±2.04)mmol/L、TC(2.81±0.23)mmol/L、TG(4.36±0.35)mmol/L、LDL-C(2.97±0.24)mmol/L、MDA(9.37±0.72)nmol/mgprot],而HDL-C(1.08±0.08)mmol/L、血清NO(28.76±2.21)μmol/L、SOD(55.17±4.24)U/mgprot水平均高于模型组[HDL-C(0.65±0.05)mmol/L、血清NO(19.11±1.47)μmol/L、SOD(41.22±3.17)U/mgprot](P<0.05)。柚皮苷组的PI3K蛋白表达水平(0.81±0.06)及Akt(0.91±0.07)和eNOS(0.97±0.07)的磷酸化水平均高于模型组[PI3K蛋白表达水平(0.31±0.02)、(0.21±0.02)和eNOS(0.18±0.01)](P<0.05)。此外,LY294002处理可显著减弱柚皮苷对上述指标的影响(P<0.05)。结论柚皮苷对2型糖尿病大鼠的脑保护作用主要由PI3K/AKT/eNOS信号通路介导。

一贯煎对干燥综合征模型大鼠及颌下腺PI3K/Akt/eNOS通路的影响

目的:探讨一贯煎对干燥综合征模型大鼠及颌下腺PI3K/Akt/eNOS通路的影响。方法:制备干燥综合征大鼠模型,随机分为模型组、硫酸羟氯喹(40 mg/kg)组及一贯煎低(7.1 g/kg)、中(14.2 g/kg)、高(28.4 g/kg)剂量组,每组12只,另取12只设为正常对照组。检测各组大鼠唾液流率、饮水量;以血液黏度测试仪测定各组大鼠血液流变学指标;HE染色检测各组大鼠颌下腺组织病理形态变化;以酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒检测各组大鼠血清IL-6、IL-17、IgG、NO水平;免疫印迹实验检测各组大鼠颌下腺组织中PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠唾液流率、大鼠血清NO水平及大鼠颌下腺组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS水平显著降低(P<0.05),饮水量、组织病理评分、全血高切及低切黏度、血浆黏度、大鼠血清IL-6、IL-17、IgG水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,一贯煎各剂量组及硫酸羟氯喹组大鼠唾液流率、大鼠血清NO水平及大鼠颌下腺组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS水平显著升高,饮水量、组织病理学评分、全血高切及低切黏度、血浆黏度及血清IL-6、IL-17、IgG水平显著降低(P<0.05)。一贯煎高剂量组与硫酸羟氯喹组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:一贯煎可缓解干燥综合征模型大鼠颌下腺损伤,修复腺体分泌功能,改善其临床症状,可能是通过激活PI3K/Akt/eNOS通路实现的。

缬沙坦通过PI3K/Akt/eNOS通路保护2型糖尿病大鼠主动脉内皮细胞免受氧化损伤的研究

目的观察缬沙坦对2型糖尿病模型大鼠主动脉内皮细胞氧化损伤的保护作用,并探讨其分子机制。方法采用小剂量链脲佐菌素(STZ,35 mg/kg)加高脂高糖饮食诱导2型糖尿病动物模型。将30只SD大鼠分为3组:正常对照组、糖尿病模型组和缬沙坦治疗组,缬沙坦治疗组灌胃给予缬沙坦24 mg/(kg·d),糖尿病模型组则给予等体积生理盐水,连续治疗8周。HE染色检测胸主动脉形态变化,采用DCFH-DA荧光探针检测活性氧(ROS)的生成,采用黄嘌呤氧化酶法检测主动脉组织超氧化物歧化酶(SOD)的活性,Western blot检测主动脉组织Akt、p-Akt、e NOS和p-e NOS的蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,糖尿病模型组ROS含量显著上升,SOD活性显著下降(P<0.05)。与糖尿病模型组比较,缬沙坦治疗组ROS水平明显降低,SOD活性明显升高,pAkt和p-e NOS的表达明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),而对Akt和e NOS的表达量无影响(P>0.05)。结论缬沙坦能够保护糖尿病大鼠主动脉内皮细胞免受氧化损伤,其机制可能与激活PI3K/Akt/e NOS通路有关。

PI3K/Akt/eNOS信号通路与胚胎植入和妊娠维持

子宫内膜容受性是影响人类辅助生殖技术的重要因素。PI3K/Akt/eNOS信号通路通过动员内皮祖细胞、产生一氧化氮等方式促进血管生成。血管生成为胚胎滋养细胞侵入螺旋小动脉、扩张螺旋动脉、形成毛细血管网提供基础,实现血管重铸,对提高子宫内膜容受性,增加胚胎植入部位血流,以及胚胎植入后妊娠的维持,都起着非常重要的作用。本文对PI3K/Akt/eNOS信号通路对胚胎植入和妊娠维持的作用进行综述,以期为改善子宫内膜容受性、提高ART成功率的临床及相关研究提供新的思路。

ErbB2基因沉默介导PI3K/Akt/eNOS信号通路对卵巢癌细胞生物学特性影响

目的探讨ErbB2基因沉默介导PI3K/Akt/eNOS信号通路对卵巢癌细胞生物学特性的影响及机制。方法选取对数生长期人卵巢癌细胞株HO8910细胞分为5组:空白对照组(不转染任何序列)、阴性对照组(转染空载体质粒)、siErbB2组(转染siRNA序列)、wortmannin组(转染PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制剂wortmannin)、siErbB2+IGF-1组(转染siRNA序列+PI3K/Akt/eNOS信号通路激动剂IGF-1)。采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平,同时检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的变化。结果与空白对照组比较,siErbB2组和wortmannin组卵巢癌细胞中Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著下降,而Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达量则显著增加(F=3.58~8.69,P均<0.05),细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力均显著下降(F=8.84~15.67,P均<0.05),细胞凋亡率上升(F=9.46,P<0.05);siErbB2组ErbB2表达明显下降(P<0.05)。与siErbB2组相比,siErbB2+IGF-1组ErbB2、Akt、PI3K、eNO S和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著下降(P均<0.05),Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达量显著增加(P均<0.05),细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力均明显下降(P均<0.05),细胞凋亡率上升(P<0.05)。结论ErbB2基因沉默可抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路,从而抑制卵巢癌细胞增殖,促进细胞凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信号通路激活可逆转ErbB2基因沉默作用,促进卵巢癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。

外源性硫化氢通过PI3K/Akt/eNOS通路改善过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞衰老

【目的】本研究拟探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)通路对硫化氢(H2S)改善内皮细胞衰老的作用。【方法】建立60μmol/L过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)衰老模型;衰老模型的评估及不同浓度硫氢化钠(NaHS)预处理对衰老的作用均通过检测纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的表达水平和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率来研究评估。同时通过Western blot法检测各组内皮细胞中蛋白激酶B(Akt)蛋白、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表达,通过硝酸盐还原酶法检测一氧化氮(NO)含量。【结果】与对照组相比,HUVEC经60μmol/L H_(2)O_(2)预处理后,能显著提高细胞SA-β-gal阳性率和PAI-1的表达。而NaHS的预处理可以显著减少PAI-1的表达和细胞SA-β-gal阳性率,但可增加p-Akt蛋白、eNOS蛋白的表达及增加NO含量。【结论】NaHS可以改善H2O2诱导的内皮细胞衰老,其机制与PI3K/Akt/eNOS通路有关。

基于PI3K/Akt/eNOS信号通路探讨丹酚酸B对AngⅡ诱导的内皮细胞一氧化氮合成的影响

目的基于PI3K/Akt/eNOS信号通路探讨丹酚酸B(SalB)对AngⅡ诱导的内皮细胞中一氧化氮(NO)合成的影响。方法采用MTT法筛选出对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)无毒性的SalB浓度。将细胞分为对照组、低剂量SalB组、中剂量SalB组和高剂量SalB组,分别加入0、25、50、100μmol/L的SalB干预12 h,采用NO检测试剂盒测定不同浓度SalB对HUVEC细胞NO合成的影响。将细胞分为对照组、AngⅡ组和干预组(AngⅡ+低剂量SalB组、AngⅡ+中剂量SalB组和AngⅡ+高剂量SalB组),干预组分别加入25、50、100μmol/L的SalB干预12 h,AngⅡ组和干预组加入1μmol/L的AngⅡ干预。采用NO检测试剂盒测定5组HUVEC细胞中NO含量,Westernblot法检测5组HUVEC细胞中PI3K、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达。结果25、50、100μmol/L浓度的SalB对HUVEC细胞无毒性,故选为后续实验的干预浓度。与对照组比较,低、中、高剂量SalB组HUVEC细胞中的NO含量明显提高(P<0.05)。与对照组比较,AngⅡ组HUVEC细胞中的NO含量明显降低(P<0.05),PI3K蛋白表达和p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS比值均明显下降(P<0.05);与AngⅡ组比较,AngⅡ+低剂量SalB组、AngⅡ+中剂量SalB组和AngⅡ+高剂量SalB组HUVEC细胞中的NO含量明显提高(P<0.05),PI3K蛋白表达和p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS比值均明显提高(P<0.05);与AngⅡ+低剂量SalB组比较,AngⅡ+中剂量SalB组和AngⅡ+高剂量SalB组HUVEC细胞中p-Akt/Akt比值明显提高(P<0.05)。结论SalB通过上调PI3K/Akt/eNOS信号通路,促进AngⅡ诱导的HUVEC细胞中NO的合成。

1-磷酸鞘氨醇受体2介导PI3K/AKT/eNOS通路抑制甲型流感病毒诱导的病毒性肺炎

目的:探讨1-磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)对甲型流感病毒诱导的病毒性肺炎的作用及机制。方法:采用甲型流感病毒鼠肺适应株FM1滴鼻感染野生C57BL/6小鼠和S1pr2^(-/-)小鼠,建立甲型流感病毒性肺炎动物模型。病毒感染4和6 d时观察比较对照组(模型组的野生小鼠)、JTE-013(S1PR2高效拮抗剂)处理的小鼠及S1pr2^(-/-)小鼠肺组织的病理改变,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白浓度、细胞总数及细胞因子[白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)]的表达,Western blot法检测小鼠肺组织的AKT和e NOS的磷酸化水平。结果:与模型对照组的野生鼠比较,JTE处理组和S1pr2^(-/-)组甲型流感病毒性肺炎更加严重;BALF中的蛋白浓度,总细胞数及炎性细胞因子表达显著增加;且PI3K下游靶点AKT和e NOS磷酸化显著增高(P<0.01)。结论:S1PR2通过介导PI3K/AKT/e NOS信号转导通路,调节NO生成,抑制血管通透性和炎性细胞因子释放,从而减轻甲型流感病毒诱导的病毒性肺炎。

立普妥对高糖诱导的HUVEC凋亡及PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响

目的探讨立普妥对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的凋亡及对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/内皮型一氧化氮(e NOS)信号通路的影响。方法实验分为正常组,模型组(33.3 mol/L葡萄糖),立普妥组(33.3 mol/L葡萄糖+0.1,1,10μmol/L);MTT法检测各组HUVEC活力;倒置显微镜拍照检测各组HUVEC形态;Annexin V-FITC/PI流式双染法检测各组HUVEC凋亡;Gries法检测各组HUVEC上清NO含量;Western blot分析PI3K/AKT激活状况及e NOS的表达情况。结果与正常组比较,高糖组中HUVEC皱缩,变圆变亮,细胞活力降低,细胞早期凋亡和晚期凋亡率显著提高,NO含量及e NOS、PI3K表达量及AKT磷酸化程度降低,差异均具有显著性(P<0.05);与模型组比较,1,10μmol/L立普妥组中HUVEC形态恢复,细胞活力上升,PI3K表达量提高,差异均具有显著性(P<0.05);0.1,1,10μmol/L立普妥组HUVEC凋亡程度下降,NO含量、e NOS表达量提高,AKT磷酸化水平上升,差异均具有显著性(P<0.05)。结论立普妥可抵抗高糖诱导的HUVEC凋亡,是通过激活PI3K/AKT/e NOS信号通路实现的。