miR-106a通过调控PI3K/PDK1/AKT蛋白通路调节胃癌细胞生物学行为的研究

目的探讨miR-106a对胃癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。方法选取AGS人胃癌细胞系,经培养后分为27个样本。所有样本随机分为miR-106a inhibitor、miR-mimic、miR-NC共计3组,分别给予miR-106a抑制剂、miR-106a模拟物及安慰剂干预。观察各组细胞存活率、细胞周期、细胞侵袭、迁移及caspase活性、Bax、Bcl-2、Casepase-3蛋白相对表达量、p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相对表达量。结果与miR-NC组比较,miR-106a inhibitor组AGS细胞活性降低[(分别为15.01±0.97)、(69.82±2.31)%](P<0.01);miR-106a mimics组AGS细胞G0/G1期细胞比例降低(P<0.05)(分别为17.33±1.04、58.24±0.82),G2/M和S期细胞比例升高(分别为50.11±1.12、35.64±1.07和31.56±0.92、9.24±0.25);miR-106a inhibitor组AGS细胞G0/G1期细胞比例升高(分别为78.43±1.12、58.24±0.82)(P<0.05),G2/M和S期细胞比例降低(分别为33.65±0.99、35.64±1.07和19.78±0.84、9.24±0.25)(P<0.01)。与miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞的迁移、侵袭能力增强,miR-106a inhibitor组AGS细胞的迁移、侵袭能力减弱(P<0.01);与miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9活性降低,miR-106a inhibitor组AGS细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9活性升高(P<0.05);miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞Bax(分别为0.69±0.07、1.48±0.15)、Casepase-3蛋白(分别为0.37±0.04、0.91±0.09)相对表达量降低,Bcl-2蛋白相对表达量升高(分别为1.53±0.12、0.94±0.09),miR-106a inhibitor组AGS细胞Bax(分别为2.07±0.21、1.48±0.15)、Casepase-3蛋白(分别为1.23±0.12、0.91±0.09)相对表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达量降低(P<0.05)(分别为0.65±0.07、0.94±0.09);与miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞p85β(分别为1.24±0.12、0.94±0.09)、p-PDK1(分别为2.13±0.23、1.01±0.10)、p-AKT蛋白(分别为1.14±0.11、0.72±0.06)相对表达量升高,miR-106a inhibitor组AGS细胞p85β(分别为0.69±0.07、0.94±0.09)、p-PDK1(分别为0.75±0.07、1.01±0.10)、p-AKT(分别为0.53±0.05、0.72±0.06)相对表达量降低(P<0.05)。结论miRNA-106a表达能通过调控宫颈癌细胞PI3K/PDK1/AKT蛋白通路调控其细胞生物学行为,包括降低癌细胞活力、迁移和侵袭,诱导癌细胞细胞周期停滞,抑制miRNA-106a表达可能是胃癌患者治疗的新靶点之一。

基于PI3K/Akt信号通路研究积雪草中微量皂苷(CA-1)的神经保护作用

利用6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)诱导分化型PC12细胞构建的帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)体外细胞模型,研究了从积雪草中提取的微量皂苷(Centella Asiatica Saponins-1,CA-1)的神经保护作用。通过高分辨二级质谱鉴定化学结构、分析了积雪草中常用皂苷和CA-1对PC12细胞存活率的影响,进一步通过半定量和实时定量聚合酶链式反应、蛋白印迹等技术检测PC12细胞中相关基因和蛋白表达。结果表明在该模型中100μmol/L CA-1、积雪草苷(Asiaticoside,AS)、羟基积雪草苷(Madecassoside,MA)分别将细胞存活率提高了28.63%、16.69%、17.54%,CA-1的神经保护作用强于AS和MA(p<0.05)。与模型组相比,CA-1剂量依赖性地提高了6-OHDA诱导PC12细胞的存活率且在CA-1浓度为25μmol/L与模型组有显著差异(p<0.05),降低了细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的水平,上调了Sod1、Cat、Bcl2基因表达。蛋白印迹法(Western Blot,WB)显示,CA-1提高了p85、PDK1、Akt的蛋白表达水平。在该研究中明确了CA-1的神经保护作用揭示了其作用可能通过PI3K/Akt信号通路。

PI3K/AKT/GSK-3β信号在脑缺血预处理中的作用及对海马细胞凋亡的影响

目的研究脑缺血预处理(CIPC)中PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调节变化及对海马细胞凋亡的影响。方法制作脑缺血、CIPC及LY294002干预模型。进行神经功能缺损评分;TTC染色计算脑梗死体积;TUNEL法检测海马细胞凋亡;Western blot检测p-PDK1、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β(ser9)、Mc-l1的蛋白表达,RT-PCR检测GSK-3β的转录。结果①与脑缺血组比较,CIPC组在神经功能缺损评分、脑梗死体积、细胞凋亡、GSK-3β蛋白表达及转录水平均降低(均P<0.05),但脑缺血组与LY294002组比较,上述各检测值差异均无统计学意义(均P>0.05);②与脑缺血组比较,CIPC组的p-PDK1、p-AKT、p-GSK-3β(ser9)、Mc-l1的蛋白表达均增高,LY294002组各蛋白表达较CIPC组均降低(均P<0.05),LY294002组与脑缺血组比较各蛋白表达差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论脑缺血预处理降低GSK-3β的转录和蛋白表达,增加p-PDK1、p-AKT、p-GSK-3β(ser9)、Mc-l1的表达,减少神经元凋亡。LY294002可抵消脑缺血预处理的保护作用。

基于PI3K/PDK1/Akt信号通路研究丹参-红花药对对寒凝血瘀型心肌缺血大鼠的保护作用及机制

目的 研究丹参-红花药对对异丙肾上腺素(isoprenaline hydrochloride,ISO)诱导的心肌缺血大鼠的保护作用及其机制。方法 大鼠随机分为对照组、模型组、复方丹参滴丸(73 mg/kg)组和丹参-红花低、中、高剂量(4、8、16 g/kg)组,给予相应药物干预7 d。于第6天开始ig药物1 h后,大鼠于0℃的冰浴中寒冷刺激4 min,sc ISO(85 mg/kg),连续2 d。采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法测定各组大鼠心肌梗死面积;采用TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况;采用苏木素-伊红(HE)染色法观察各组大鼠心肌组织病理变化;采用ELISA法检测各组大鼠血浆中肌酸激酶同工酶(creatine kinase,CK)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、CK-肌红蛋白(myoglobin,MB)活性及心肌肌钙蛋白-Ⅰ(cardiac troponin-Ⅰ,CTn-Ⅰ)、CTn-T、C反应蛋白(C-reaction protein,CRP)、MB、N末端利钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)和B型脑利钠肽(B-brainnatriureticpeptides,BNP)水平;采用Westernblotting检测各组大鼠心肌组织中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K,p-PI3K)、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1,PDK1)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、p-Akt、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)、p-eNOS、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)、p-NF-κB p65、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,Caspase-3)和Caspase-9蛋白表达。结果 丹参-红花药对显著抑制ISO诱导的心肌缺血模型大鼠的心肌梗死面积(P<0.01);改善心肌组织病理变化;显著抑制心肌细胞的凋亡(P<0.05、0.01);显著降低血浆中心肌酶活性以及心肌蛋白水平(P<0.05、0.01);显著上调心肌组织中Bcl-2、PDK1、p-eNOS、p-PI3K和pAkt蛋白表达水平(P<0.05、0.01),降低Bax、Cyt C、剪切型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、cleaved Caspase-9和p-NF-κB p65蛋白表达水平(P<0.05、0.01)。结论 丹参-红花药对能够通过调控PI3K/PDK1/Akt信号通路,从而发挥对ISO诱导的心肌缺血的保护作用。

基于PI3K/PDK1/AKT信号通路探究电针对荨麻疹大鼠皮肤肥大细胞脱颗粒的影响

目的:研究电针预处理血海、曲池穴对荨麻疹大鼠模型PI3K/PDK1/AKT通路相关蛋白表达的影响。方法:32只健康SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组、西药组,每组8只。电针组采用电针双侧血海、曲池穴,电流1 mA、疏密波、频率2 Hz,留针20 min,1次/d;西药组采用氯雷他定稀释液(1 mg/kg)灌胃,1次/d;空白组、模型组给予同等剂量的0.9%氯化钠溶液(1 mg/kg)灌胃,1次/d。另取3只健康SD大鼠,采用鸡卵白蛋白与免疫佐剂(卡介苗)联合注射法制备同种异体大鼠抗卵白蛋白血清。除空白组外,其余组均建立荨麻疹大鼠模型。直尺测量大鼠皮肤蓝斑直径,甲苯胺蓝染色法检测皮肤肥大细胞脱颗粒形态及数目,HE染色观察皮肤病理变化,ELISA法检测血清白细胞介素-4(IL-4)表达,免疫组织化学法检测皮下组织IgE、组胺以及皮肤组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK1)、蛋白激酶B(AKT)表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠皮肤蓝斑直径、皮肤组织炎症细胞浸润、肥大细胞脱颗粒率、皮下组织IgE和组胺,以及皮肤肥大细胞PI3K、PDK1、AKT和血清IL-4显著增多(P<0.01);与模型组比较,电针组、西药组大鼠以上指标显著减少(P<0.05,P<0.01)。结论:电针预处理血海穴、曲池穴可减小荨麻疹动物模型蓝斑直径,改善皮肤炎症反应,减少肥大细胞脱颗粒,且该效应与调控IgE介导的PI3K/PDK1/AKT信号通路激活和组胺、IL-4表达有关。

肝脏再生和保护的分子机制研究进展

肝脏再生是大多数肝损伤恢复所必需的一个过程。再生通过包括肝脏细胞和肝外器官在内的复杂的相互作用网络来实现。肝脏体积的恢复依赖于肝细胞增殖,该过程包括启动相、增殖相及终止相。肝细胞主要通过TNF-α和IL-6等细胞因子由库普弗细胞启动,随后在细胞因子及生长因子的刺激诱导下发生增殖和细胞生长。肝脏再生过程中,IL-6/STAT3和PI3K-PDK1-Akt通路发挥关键性作用。IL-6/STAT3通路通过cyclinD1/p21调节肝细胞增殖,通过上调FLIP、Bcl-2、Bcl-xL、Ref1、MnSOD防止细胞死亡。PI3K-PDK1-Akt通过mTOR等下游分子调节细胞大小,并具有生存、抗凋亡、抗氧化特性。虽然肝脏再生的分子机制已被广泛研究,但仍需进一步阐明以用于肝脏疾病的治疗。