基于网络药理学和细胞验证从PI3K-Akt通路探讨半夏白术天麻汤干预甲基苯丙胺成瘾的作用机制

目的研究半夏白术天麻汤(Banxia Baizhu Tianma Decoction,BBTD)干预甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)成瘾的网络药理学机制。方法利用网络药理学分析BBTD干预MA成瘾的作用机制,进一步构建MA依赖SH-SY5Y细胞模型,观察BBTD对细胞模型及PI3K-Akt通路的影响。结果筛选得到BBTD活性成分88个及其靶点583个;KEGG表明BBTD干预MA成瘾可能与PI3K-Akt、cAMP等通路相关;分子对接显示关键活性物质与PI3K-Akt通路核心靶点均有较好的结合活性。细胞实验显示,MA依赖模型细胞突触变短、细胞边界模糊,呈现典型的细胞损伤形态,且胞内cAMP高表达(P<0.01)、5-HT低表达(P<0.05);BBTD干预可对抗上述形态学、cAMP及5-HT变化,提示其对MA依赖模型细胞有一定治疗作用。Western blot显示,MA造模可以升高p-PI3K/PI3K(P<0.05)和p-Akt/Akt(P<0.01)的比值,BBTD干预可以降低其比值。结论BBTD中天麻素等活性成分对MA成瘾有一定治疗作用,其机制可能与调控PI3K-Akt信号通路有关。

cGAMP通过激活PI3K-AKT通路减轻小鼠脑缺血恢复期的损伤

目的 研究cGAMP对小鼠脑缺血恢复期的影响及初步作用机制。方法 采用线栓法制备小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,通过行为学评分和组织病理染色观察cGAMP 对MCAO小鼠恢复期的影响。激光散斑仪器观察cGAMP对MCAO小鼠恢复期的脑血流量的影响,使用苏木精-伊红染色(HE)和尼氏染色(NISSL)观察cGAMP对MCAO小鼠大脑皮层神经元的影响,使用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测小鼠大脑皮层中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和精氨酸酶1(Arg-1)的表达,使用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠大脑皮层中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的表达。结果 行为学观察结果显示,与模型组相比,缺血期的MCAO小鼠经 cGAMP 处理后,行为学评分降低,在提尾测试、平衡木试验和前肢抓地力牵引测试中,其运动功能均显著恢复。HE、NISSL染色中,cGAMP可减轻脑缺血恢复期小鼠神经元损伤。PCR结果表明cGAMP处理可以降低脑缺血恢复期小鼠脑组织TNF-α的表达,升高Arg-1的表达。在Western blot结果中,cGAMP处理能够显著促进PI3K、AKT的磷酸化(P<0.05)。结论 cGAMP 能明显改善脑缺血恢复期小鼠运动功能,可能是通过激活PI3K-AKT通路减轻小鼠脑缺血恢复期的神经元损伤发挥治疗作用。

ISLR通过活化PI3K-AKT通路促进上皮-间质转化影响骨肉瘤细胞恶性进展研究

目的 研究含免疫球蛋白超家族亮氨酸丰富重复蛋白(immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein,ISLR)参与骨肉瘤细胞恶性进展的作用及其潜在调节机制。方法 通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测骨肉瘤组织和细胞中ISLR mRNA水平。通过转染ISLR短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列或阴性对照shRNA(negative-control shRNA,NC shRNA)序列至U2OS细胞,后用磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3 kinase,PI3K)激活剂740 Y-P处理细胞。通过CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞活力、侵袭能力和细胞凋亡率。蛋白印迹实验(Western blot)检测ISLR蛋白、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白[上皮钙黏蛋白(epitheia-cadherin,E-cadherin)、神经钙黏蛋白(nerve-cadherin,N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin),Snail]、PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白[半胱天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)]和肿瘤增殖标志物Ki67蛋白表达。采用慢病毒转染的U2OS细胞注射裸鼠构建异种移植瘤模型,监测肿瘤生长情况。结果 与癌旁组织(1.01±0.02)相比,骨肉瘤组织(5.14±1.63)中ISLR mRNA水平显著上调,差异具有统计学意义(t=-14.332,P<0.001)。与正常人成骨细胞hFOB1.19(1.01±0.01)相比,骨肉瘤细胞MG63(3.05±0.57),U2OS(4.55±0.79),HOS(2.46±0.41),Saos-2(2.62±0.44)和143B(3.62±0.51)中ISLR mRNA相对表达均显著升高,差异具有统计学意义(t=4.883,8.473,3.471,3.854,6.247,均P<0.05)。与对照组和NC shRNA组比较沉默ISLR明显抑制了U2OS细胞增殖(t=6.593,6.835)及侵袭(t=8.621,8.448),促进细胞凋亡(t=25.505,25.574),差异具有统计学意义(均P<0.05)。沉默ISLR明显促进U2OS细胞中Caspase-3活性(t=13.489,13.366)及Bax蛋白(t=8.628,8.524)表达,抑制Bcl-2蛋白(t=10.948,10.775)表达,差异具有统计学意义(均P<0.05)。沉默ISLR显著促进EMT相关蛋白E-cadherin(t=15.168,15.087)表达,抑制N-cadherin(t=10.220,10.058),Vimentin(t=8.303,8.164)和Snail(t=9.211,9.384)蛋白表达,降低PI3K/AKT通路关键蛋白PI3K和AKT磷酸化水平(t=17.441,14.452),差异具有统计学意义(均P<0.05)。740 Y-P处理可逆转ISLR沉默对U2OS细胞的影响。裸鼠体内实验显示敲低ISLR显著抑制了肿瘤生长。结论 ISLR可能通过激活PI3K/AKT通路促进骨肉瘤EMT及细胞增殖、侵袭,抑制细胞凋亡,从而促进骨肉瘤进展。

仙鹤草素通过抑制PI3K-AKT通路促进NRF2介导的胃癌细胞铁死亡

目的:观察仙鹤草素抑制人胃癌HGC-27、MKN-45的作用机制。方法:将胃癌HGC-27、MKN-45细胞分为对照组、不同剂量仙鹤草素组、卡培他滨(阳性对照)组及仙鹤草素+NRF2激活剂(Bardoxolone)组。采用CCK-8法检测HGC-27、MKN-45细胞活力,划痕实验观察细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)水平,western blotting法检测PI3K-AKT通路相关蛋白及抗铁死亡分子NRF2、Histone H3、HO-1、SLC7A11、GPX4表达。结果:与对照组相比,不同剂量仙鹤草素对HGC-27、MKN-45细胞活性均有显著的抑制作用(P<0.05),且随着时间延长和仙鹤草素剂量增加,抑制作用增强。与对照组比较,仙鹤草素低、高剂量组和阳性对照组HGC-27、MKN-45细胞迁移能力减弱,ROS和MDA水平升高,GSH/GSSG、P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT比值降低,总NRF2(Total-NRF2)、细胞核内NRF2(Nuclear-NRF2)、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(均P<0.05)。仙鹤草素+Bardoxolone组Total-NRF2、GPX4蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:仙鹤草素可促进胃癌HGC-27、MKN-45细胞铁死亡,其作用机制可能与抑制PI3K-AKT-NRF2信号通路的激活有关。

基于PI3K-Akt通路探讨补阳还五汤改善阿司匹林致消化道溃疡的机制

目的探讨补阳还五汤对阿司匹林致消化道溃疡的保护作用及其可能的作用机制。方法将75只大鼠随机分为空白对照组、胃溃疡模型组、补阳还五汤组、血府逐瘀汤组和双抗组,每组15只。除空白组大鼠灌胃等体积生理盐水,其余各组大鼠均灌胃阿司匹林水溶液300 mg/kg,并于灌胃6 h后各给药组分别灌胃相应药物,模型组灌胃等体积生理盐水,每日1次,连续14 d。检测各组大鼠凝血四项功能;运用酶联免疫吸附法(ELISA)和实时荧光定量聚合酶链式反应法(RT-PCR)分别测定各组大鼠血浆中血小板活化因子(PAF)、表皮生长因子(EGF)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3k)、蛋白激酶B(Akt)表达水平及相关mRNA的表达。结果与模型组比较,血府逐瘀汤组与正常组凝血酶时间(TT)时间明显延长(P<0.05);与正常组比较,血府逐瘀汤组和双抗组大鼠血清PAF水平明显提高,各给药组大鼠血清EGF水平明显降低(P<0.05);与模型组相比较,补阳还五汤组、血府逐瘀汤组、双抗组大鼠胃组织PI3k、Akt、PAF mRNA表达水平明显降低,EGF mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。结论补阳还五汤联合阿司匹林具有强有力的抗凝作用,且能够抑制细胞因子PAF基因的表达以及胃组织中PI3k-Akt mRNA激活,提高细胞因子EGF的表达,对胃黏膜起到保护作用。

防己黄芪汤对CIA大鼠关节PI3K-Akt通路的调控作用研究

目的:研究防己黄芪汤(FHD)治疗胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的药理学机制及其对PI3K-Akt信号通路的调控作用。方法:60只雌性Wistar大鼠随机分为健康对照组(Control)、CIA组、不同剂量FHD[2.2、4.4、8.8 g(/kg·d)]干预组。除对照组外,其余各组采用牛Ⅱ型胶原构建CIA模型,不同剂量FHD干预,持续给药6周。HE染色检测大鼠关节和脾脏病理变化,ELISA检测血清TNF-α、IL-1、IL-6表达,网络药理学分析FHD治疗类风湿关节炎(RA)的核心信号通路,Western blot检测核心通路蛋白表达。结果:与Control组相比,CIA组大鼠关节炎症细胞浸润和骨质破坏明显,脾脏内白髓增生显著,血清TNF-α、IL-1、IL-6表达显著升高(P<0.05,P<0.01);与CIA组相比,不同剂量FHD组大鼠关节炎症及骨破坏显著改善,脾脏白髓增生减轻,低、中剂量FHD组大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6表达显著降低(P<0.05,P<0.01),高剂量FHD组TNF-α和IL-1表达差异无统计学意义(P>0.05);网络药理学分析显示FHD治疗RA的核心通路为PI3K-Akt通路;CIA组大鼠关节p-PI3K、p-Akt表达较Control组显著升高(P<0.01),不同剂量FHD组p-PI3K、p-Akt表达较CIA组显著降低(P<0.01),各组大鼠PI3K、Akt蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建CIA大鼠模型;FHD对CIA大鼠具有良好治疗作用,其安全用药剂量为2.2~4.4 g(/kg·d);FHD可能通过抑制PI3K-Akt通路激活和炎症因子生成发挥RA治疗作用。

参附注射液通过调控PI3K-AKT通路对LPS诱导的小鼠肺上皮细胞自噬与凋亡的影响

目的:研究参附注射液对脂多糖(LPS)诱导的小鼠肺上皮细胞MLE-12的保护作用,并进一步探究其对自噬和凋亡的作用及潜在的分子机制。方法:采用LPS处理小鼠肺上皮细胞MLE-12建立脓毒症急性肺损伤(ALI)细胞模型,分为空白对照组、模型组及参附注射液低、中、高浓度组。CCK-8法检测LPS和参附注射液对MLE-12细胞活力的影响;酶联免疫吸附试验检测细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量;试剂盒检测细胞内ROS水平;蛋白免疫印迹法检测肺上皮细胞标记蛋白E-cadherin、Occludin、ZO-1,自噬相关蛋白LC3B、Beclin1,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及PI3K-AKT信号通路相关蛋白的表达;细胞免疫荧光检测细胞内LC3B蛋白表达;流式细胞术检测参附注射液对LPS诱导下MLE-12细胞凋亡的影响。结果:与模型组比较,参附注射液各组MLE-12细胞活力显著升高,TNF-α、IL-1β、IL-6分泌及细胞内ROS生成显著降低,E-cadherin、Occludin、ZO-1、Beclin1蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ水平显著升高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平显著降低,MLE-12细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。结论:参附注射液可抑制LPS诱导的炎症因子分泌,减轻氧化应激,改善肺上皮细胞功能,增加细胞保护性自噬,抑制细胞凋亡,其机制可能与调控PI3K-AKT信号通路有关。

miR-19通过靶向PTEN调节PI3K-Akt通路促进子宫内膜癌KLE细胞的侵袭和迁移

目的:分析miR-19对PTEN及PI3K-Akt通路的调节作用,揭示miR-19和PTEN对子宫内膜癌KLE细胞侵袭、迁移的影响及其机制。方法:收集2017年5月至2020年8月河北医科大学第一医院收治的74例子宫内膜癌患者经手术切除(术前未接受放化疗等治疗)且病理确诊为子宫内膜癌的肿瘤组织及对应癌旁组织,采用qPCR和WB法检测PTEN在子宫内膜癌组织中的表达水平以及转染miR-19模拟物或抑制物对KLE细胞中PTEN表达的影响。通过TargetScan及双荧光素酶报告基因实验预测并验证PTEN是否为miR-19的靶基因,将KLE细胞随机分为对照(NC)组、miR-19模拟物组和miR-19+PTEN组,分别转染阴性对照片段(miR-NC)、miR-19模拟物或共转染miR-19模拟物+PTEN过表达载体,采用Transwell和细胞划痕实验检测miR-19和PTEN对KLE细胞迁移和侵袭能力的影响,WB法检测对PI3K-Akt通路相关蛋白表达的影响。结果:子宫内膜癌组织中PTEN的mRNA和蛋白表达水平均明显低于癌旁组织(均P<0.01)。miR-19能与PTEN mRNA的3’-UTR特异性结合,上调miR-19的表达能抑制PTEN的mRNA和蛋白的表达,下调miR-19的表达则出现相反的结果(均P<0.01)。与miR-NC组相比,miR-19模拟物组的迁移、侵袭细胞数以及划痕愈合率均显著升高(均P<0.01),而miR-19+PTEN组的细胞迁移和侵袭能力以及划痕愈合率较miR-19摸拟物组则明显降低(均P<0.01);与miR-NC组相比,miR-19模拟物组中PTEN蛋白的表达明显降低,而p-Akt 308和p-Akt 473蛋白的表达明显升高,Akt蛋白的表达无明显变化(均P<0.01);而在miR-19+PTEN组中,p-Akt 308和p-Akt 473蛋白的表达均明显低于miR-19模拟物组(均P<0.01)。结论:miR-19可能通过抑制PTEN的表达从而活化PI3K-Akt通路,进而促进子宫内膜癌KLE细胞的迁移和侵袭。

自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用

目的探讨自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用。方法选用雄性SD大鼠(220 g^260 g)35只,随机分为5组:假手术组(S组)、心肌缺血再灌注损伤组(I/R组)、舒芬太尼后处理组(SP组)、舒芬太尼后处理+PI3K-Akt通路的抑制剂Wortmannin组(SP+W组)、Wortmannin组(W组)。I/R组、SP组、SP+W组以及W组采用结扎冠脉左前降支(LAD)30 min、再灌注120 min的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型。S组在冠脉左前降支(LAD)下穿线但不结扎。于再灌注前5 min,I/R组由股静脉给予生理盐水1 m L,SP组给予舒芬太尼(1μg/kg),SP+W组给予舒芬太尼(1μg/kg)及Wortmannin(15μg/kg),W组给予Wortmannin(15μg/kg)。再灌注120 min时腹主动脉取血,检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)的浓度;处死大鼠后,取心尖组织,Western blot法检测Akt、磷酸化的Akt(p-Akt)、LC3-Ⅱ的表达;电镜下观察自噬体的生成情况。结果与S组比较,I/R组、SP组、SP+W组及W组CK-MB含量、LC3-Ⅱ表达增加,p-Akt/Akt升高,差异有统计学意义(P<0.05),自噬体数量增多;与I/R组比较,SP组CK-MB含量、LC3-Ⅱ表达减少,p-Akt/Akt升高,差异有统计学意义(P<0.05),自噬体数量减少;与SP组比较,SP+W组、W组CK-MB含量、LC3-Ⅱ表达增加,p-Akt/Akt降低,差异有统计学意义(P<0.05),自噬体数量增多。结论舒芬太尼后处理可能通过抑制自噬水平而在心肌缺血再灌注损伤中起到保护作用,其中PI3K-Akt通路可能是主要通路之一。

运动氧化应激与PI3K-Akt通路研究进展

运动可诱导氧化应激,PI3K-Akt通路是机体抵抗氧化应激的通路之一。笔者综述了运动、氧化应激及PI3K-Akt通路的最新研究进展,以期为某些疾病的防治及运动疲劳的发生机制等相关问题的研究提供参考依据。

补阳还五汤激活PI3K-AKT通路促进氧糖剥夺再灌注损伤的脑微血管内皮细胞血管生成

目的:探讨补阳还五汤促进氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤的大鼠脑微血管内皮细胞(RBMEC)血管生成的机制。方法:RBMEC经补阳还五汤含药血清孵育24 h后,构建OGD/R细胞损伤模型。将细胞随机分为正常对照组、模型对照组、补阳还五汤组(给予补阳还五汤含药血清)和LY294002组[给予补阳还五汤含药血清前使用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002预处理1 h]。采用CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell迁移实验、管腔形成实验分别检测细胞增殖、迁移和形成管腔能力。蛋白质印迹法检测PI3K、蛋白激酶B(AKT)、低氧诱导因子(HIF)-1α及血管内皮生长因子(VEGF)等蛋白的表达。结果:与模型对照组比较,补阳还五汤组RBMEC存活率、迁移能力及管腔形成能力显著增强(均P<0.01),磷酸化PI3K、磷酸化AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达增加(均P<0.05),而LY294002可阻断上述效应。结论:补阳还五汤含药血清可促进OGD/R损伤的RBMEC血管生成,其机制可能与其激活PI3K-AKT信号通路上调HIF-1α和VEGF表达有关。

基于调控PI3K-AKT通路探讨艾灸关元穴治疗甲状腺功能减退的作用机制

目的研究艾灸关元穴对丙硫氧嘧啶(PTU)诱导的甲状腺功能减退(甲减)大鼠的作用,并探讨其潜在的作用机制。方法将72只Wistar大鼠按照随机数表法分为空白组、模型组和艾灸组,每组24只。模型组和艾灸组大鼠给予PTU灌胃,建立大鼠甲减模型。4周后检测各组大鼠甲状腺功能指标[游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)]水平,造模成功后艾灸组大鼠每隔天在关元穴灸30 min。分别于治疗第4、8、12周腹主动脉取血,检测血清中FT3、FT4及TSH水平。取治疗第12周大鼠血清,观察其对原代大鼠滤泡上皮细胞增殖的影响。RT-PCR检测艾灸对大鼠甲状腺组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、PI3K p110、AKT1 mRNA表达的影响。结果与模型组比较,艾灸组大鼠FT3、FT4水平均明显升高(P<0.01),TSH水平明显下降(P<0.01)。艾灸组大鼠血清能明显减少大鼠原代甲状腺滤泡细胞的凋亡(P<0.05);艾灸关元穴能明显促进Bcl-2 mRNA的表达(P<0.05),抑制Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达(P<0.05),促进PI3K p110和AKT1 mRNA表达(P<0.05)。结论艾灸关元穴可明显改善甲减大鼠的甲状腺功能,抑制甲状腺滤泡上皮细胞的凋亡,其机制可能与调节Bcl-2和Bax的平衡以及PI3K-AKT通路有关。

PI3K-AKT通路对脑缺血损伤神经干细胞的增殖作用

目的:利用低氧干预分离的小鼠神经干细胞,通过构建腺病毒载体将腺病毒5-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶3(Ad5-AKT3)基因和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶3小干扰RNA(AKT3 si RNA)干扰转染至缺血神经干细胞,探索磷酸肌醇三磷酸激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K-AKT)通路对缺血性神经干细胞的增殖作用。方法:取新生24h昆明小鼠海马,分离培养原代神经干细胞,并采用巢蛋白(Nestin)免疫荧光检测和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)渗入实验对其进行鉴定;将所培养的传代神经干细胞随机分组:正常组、缺血模型组、低氧组(低氧+缺血模型组)、Lip2000组(低氧+缺血模型组+Lip2000空转染组)、AKT转染组(低氧+缺血模型组+Ad5-AKT3转染组)、AKT干扰组(低氧+缺血模型组+Lip2000+AKT3 si RNA干扰组)。建立脑缺血损伤的体外模型,低氧干预,构建腺病毒Ad5-AKT3载体和AKT3 si RNA后,各组行MTT检测;RT-q PCR检测AKT3 m RNA表达情况;Werstern Blot检测PI3K、AKT3、PCNA。结果:通过免疫荧光检测Nestin鉴定神经干细胞球,在荧光显微镜下观察到绿色明亮且典型的细胞球,球内可见清晰结构;渗入Brdu免疫荧光检测可见整个着色细胞球。MTT OD值和RT-q PCR检测AKT3 m RNA均显示,与正常组相比,模型组和AKT干扰组下降(P<0.05),其余各组均升高(P<0.05),其中低氧组和Lip2000组之间无明显差异(P>0.05)。与模型组相比,除AKT干扰组下降外(P<0.05),其余各组均升高(P<0.05)。Western Blot检测PI3K、AKT3、PCNA蛋白表达与正常组相比,模型组和AKT干扰组表达量减少(P<0.05),低氧组、Lip2000组和AKT转染组均增加(P<0.05),其中AKT转染组差异最明显(P<0.01)。结论:PI3K-AKT信号通路在低氧干预下有效促进神经干细胞的增殖过程。

青蒿琥酯通过PI3K-Akt通路促进大鼠室管膜下区神经干细胞增殖的体外研究

目的探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响。方法不同浓度的ART(400 nmol/L、800 nmol/L、1.6μmol/L、3.2μmol/L)作用于NSCs 24 h后,采用CCK-8法检测其对NSCs增殖的影响。促增殖作用明显的800 nmol/L ART组加入10μmol/L PI3K-Akt通路阻断剂(LY294002),采用CCK-8法检测该通路对NSCs增殖的影响;分别设置空白对照组、LY294002组、800 nmol/L ART组、800 nmol/L ART+LY294002组,待细胞培养24 h时,行Ki-67免疫荧光染色观察ART对NSCs增殖的影响及PI3K-Akt通路在其中的作用,同时采用Western blot检测各组Nestin、Akt及p-Akt蛋白的表达水平。结果 1CCK-8法检测结果显示800 nmol/L ART组在波长450 nm处的光密度值较空白对照组明显升高,在加入LY294002后,其光密度值明显下降(P<0.05),与空白对照组水平相当;2Ki-67免疫荧光染色结果提示800 nmol/L ART可促进NSCs增殖,LY294002可抑制这一作用;3Western blot检测结果显示:神经干细胞表面标志蛋白Nestin及p-Akt蛋白表达水平在800 nmol/L ART组明显上调,在加入LY294002后两者表达水平均下调(P<0.05)。结论 ART可在体外促进SVZ区NSCs的增殖,其机制与PI3K-Akt信号通路相关。

“三棱-莪术”组分配伍介导PI3K-AKT通路治疗大鼠子宫肌瘤的研究

目的:研究三棱-莪术对治疗子宫肌瘤的疗效及可能作用机制。方法:36只雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、1∶1组、1∶2组,每组9只,其中模型组、1∶1组、1∶2组制备子宫肌瘤模型,空白组、模型组用生理盐水灌胃,1∶1组、1∶2组根据三棱-莪术配伍比例进行灌胃,干预结束后比较各组子宫/卵巢系数、子宫大小,子宫病理形态以及PI3K/AKT通路标志因子的表达的变化。结果:1)模型组子宫平滑肌出现明显的病变,三棱-莪术干预后大鼠子宫组织病变有所改善,其中1∶1组改善较1∶2组明显。2)子宫肌瘤大鼠子宫系数、卵巢系数、子宫横竖径、子宫组织中E2和ER、PI3K、p-AKT/AKT表达水平均明显增加(P<0.05),经三棱-莪术干预后上述指标下降,其中术1∶1组改善较1∶2组明显(P<0.05)。结论:三棱-莪术配伍可改善子宫肌瘤,这一作用机制可能通过激活PI3K/AKT通路实现。

LncRNA DSCAM-AS1通过miR-144-5p激活PI3K-AKT通路对前列腺癌细胞的影响

目的探讨LncRNA DSCAM-AS1通过miR-144-5p激活PI3K-AKT通路对前列腺癌细胞的影响机制。方法选取2019年8月至2020年12月新疆医科大学第二附属医院确诊的前列腺癌患者的50例癌组织标本和38例癌旁正常组织标本,以及前列腺癌PC-2、DU145细胞和人正常前列腺上皮RWPE-1细胞作为研究对象。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LncRNA DSCAM-AS1和miR-144-5p的表达;分别下调或上调DSCAM-AS1与miR-144-5p的表达后,采用MTT实验检测DU145细胞活力、Transwell检测DU145细胞侵袭数目及Western blot检测DU145细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达;采用miRcode预测LncRNA DSCAM-AS1的靶基因;上调或下调DSCAM-AS1表达后,采用Western blot检测p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表达;将LY294002作用于DU145细胞,检测DU145细胞增殖、侵袭和EMT情况。结果前列腺癌组织和癌旁正常组织中DSCAM-AS1表达分别为2.28±0.42和1.06±0.71,miR-144-5p表达分别为0.37±0.24和1.19±0.96,二者比较,差异具有统计学意义(P<0.01);DU145和RWPE-1细胞中DSCAM-AS1表达分别为3.45±1.28和1.15±0.92,miR-144-5p表达分别为0.23±0.16和1.18±0.63,二者比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。下调LncRNA DSCAM-AS1会抑制DU145细胞的活力、侵袭和EMT;LncRNA DSCAM-AS1靶向调控miR-144-5p;上调LncRNA DSCAM-AS1通过miR-144-5p促进DU145细胞的增殖、侵袭和EMT。将pcDNA-DSCAM-AS1和LY294002作用于DU145细胞会明显抑制DU145细胞的活力、侵袭和EMT。结论上调LncRNA DSCAM-AS1会通过miR-144-5p激活PI3K-AKT信号通路促进前列腺癌细胞的发展。

人脐血间充质干细胞旁分泌通过PI3K-Akt通路抑制缺氧诱导的H9C2细胞凋亡

目的:探讨人脐血间充质干细胞(UCBMSCs)旁分泌在缺氧诱导的H9C2细胞凋亡中的作用及机制。方法:制备正常氧及缺氧预处理UCBMSCs条件培养基,抗体芯片检测各组条件培养基中细胞因子表达差异,CCK-8检测各组UCBMSCs活性;细胞上清外泌体提取试剂盒提取正常氧及缺氧预处理UCBMSCs外泌体,免疫印迹检测CD63,电镜及纳米微粒示踪技术(NTA)鉴定并比较两组UCBMSCs外泌体形态、数量的差异。

理筋手法通过PI3K-Akt通路干预兔静力性损伤的机制研究

目的:观察理筋手法对颈后肌静力性损伤模型兔肌卫星细胞增殖与修复的影响,探讨理筋手法通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路对静力性损伤的干预机制。方法:选择日本大耳白兔38只,按随机数字表法选取3只作为空白组,其余兔根据相关文献和课题组前期研究,采用颈椎前屈位45°固定,每日5 h,连续60 d,建立颈部慢性静力性损伤模型。造模结束后随机选取5只造模兔作为模型组与空白组进行一般行为学和组织形态学对照。剩余30只造模兔随机分为模型对照组和手法治疗组,每组15只。模型对照组不予任何治疗,手法治疗组每日予松筋、拨筋、顺筋三种手法治疗,力量为2 kg,每种手法治疗5 min,每日1次,每次15 min,共干预30 d。从造模后手法治疗组开始干预为观察的第1天,每组于分别于观察10 d、20 d、30 d时随机取5只兔处死取材,采用苏木精-伊红(HE)染色法光镜下观察各组兔颈后肌组织形态,免疫组织化学法(IHC法)和蛋白免疫印迹法(Western blot法)检测各组兔颈后肌组织胰岛素样生长因子-1(IGF-1)与成肌分化抗原(MyoD)表达,Western blot法检测各组兔颈后肌组织磷酸化-PI3K(P-PI3K)、磷酸化-Akt(P-Akt)蛋白表达。结果:造模结束后,与空白组比较,模型组兔精神萎靡,但触及颈部时反应警觉,易躲闪,颈部可触及条索状物;HE染色见颈后肌肌纤维严重扭曲变形,肌细胞变形,肌间隙宽窄不一,大量炎性物质浸润;IHC法和Western blot法检测结果显示颈后肌组织IGF-1与MyoD表达显著高于空白组(P<0.05),IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表达显著高于空白组(P<0.05)。IHC法检测结果可见,手法治疗组治疗10 d时IGF-1与MyoD阳性表达的棕黄色范围显著大于同时期模型对照组,此后随着治疗时间的延长染色范围逐渐减少,至治疗30 d时光镜下棕黄色染色基本消失。Western blot法检测结果显示,与同一观察时点模型对照组比较,手法治疗组干预10 d和20 d时IGF-1与MyoD蛋白表达量显著升高(P<0.05),干预30 d时上述蛋白表达量显著降低(P<0.05);随着治疗时间的延长,手法治疗组IGF-1与MyoD蛋白表达量逐渐降低。与同一时间点模型对照组比较,手法治疗干预10 d、20 d、30 d时P-PI3K、P-Akt蛋白表达量均显著升高(P<0.05)。结论:理筋手法可能通过更大程度激活PI3K-Akt信号通路,调控肌卫星细胞的增殖与分化,促进静力性损伤模型兔骨骼肌损伤的修复。

痛泻要方通过PI3K-AKT通路诱导细胞自噬治疗腹泻型肠易激综合征的机制

目的观察PI3K-AKT信号通路相关蛋白变化,探讨痛泻要方干预腹泻型肠易激综合征(IBS-D)的可能机制。方法将雄性SD大鼠60只随机分为正常组,模型组,对照组及治疗组,每组各15只。除正常组,各组均采用束缚应激联合番泻叶灌胃法制备IBS-D模型,分组干预2周。综合运用光镜、透射电镜、RT-PCR、Western Blot等技术观察各组大鼠治疗前、后结肠黏膜超微结构、相关蛋白如P110、AKT及其mRNA表达、结肠上皮细胞自噬等变化。应用Power lab仪检测大鼠内脏敏感性变化。结果除正常组,光镜下各组大鼠结肠组织符合IBS改变,电镜下模型组上皮细胞间隙增宽,线粒体肿胀,其周围出现的自噬囊泡。内脏敏感性比较,模型组与治疗组差异有统计学意义(P<0.05);与正常组比较,模型组结肠黏膜P110、AKT蛋白及其mRNA表达上升,差异有统计学意义(P<0.05),治疗组、对照组结肠黏膜P110、AKT蛋白及其mRNA表达接近正常组,差异无统计学意义(P> 0.05)。结论痛泻要方可能通过下调P110及AKT表达,诱导细胞自噬,降低内脏高敏感而发挥治疗IBS-D的效果。

PRMT1影响胃癌PI3K-AKT通路基因表达的转录组分析

目的探讨胃癌中蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)对PI3K-AKT通路的基因表达的影响情况。方法转录组测序筛选2例胃癌及对应2例癌旁组织之间的差异表达基因,京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析影响胃癌相关通路中的关键基因并利用免疫组化进行验证。结果高通量测序获得758个长度>200 bp的差异表达基因。KEGG富集分析表明25条显著富集代谢通路,其中PI3K-AKT代谢通路显著异常活化,共有15个基因显著上调;利用cBioportal数据库相关性分析,显示PRMT1与PI3K-AKT信号通路上的关键基因(PPP2R3A、THBS4)表达呈现负相关关系;免疫组化结果进一步表明低表达PRMT1的胃癌组织高表达p-AKT(473Ser),并且PRMT1与p-AKT(473Ser)呈现负相关关系,说明PRMT1与PI3K-AKT信号活性负相关。结论 PRMT1可能通过PPP2R3A、THBS4影响胃癌中PI3K-AKT信号通路的活性,为寻求胃癌诊断标志物及治疗靶点提供了线索。