氧化苦参碱对脂多糖诱导的人肾小球系膜细胞增殖p-STAT1/PIAS1信号分子的影响

目的观察氧化苦参碱对LPS诱导下HMC增殖时p-STAT1、PIAS1蛋白和mRNA表达情况,探讨其相互关系。方法体外培养HMC,分为空白对照组和LPS模型组及氧化苦参碱干预组,培养12、24、48 h时以MTT法检测HMC的增殖情况,ELISA检测细胞上清Col-Ⅳ含量,收集同时段细胞,提取细胞裂解蛋白和mRNA,采用Western blot检测p-STAT1和PIAS1的蛋白表达,实时荧光定量PCR检测STAT1和PIAS1 mRNA表达。结果LPS组细胞增殖较对照组显著加快(P<0.01),Col-Ⅳ的表达显著高于对照组(P<0.01);氧化苦参碱干预后细胞增殖和Col-Ⅳ的表达显著较模型组降低(P<0.01)。蛋白和mRNA表达情况:LPS诱导下各时间段p-STAT1表达升高,表达量显著高于对照组(P<0.01),经OM干预后表达显著下降(P<0.01);LPS诱导下PIAS1表达量显著降低(P<0.01),经OM干预,与LPS组相比各时间段均显著上升(P<0.01)。结论氧化苦参碱对LPS诱导的人系膜细胞增殖过程中p-STAT1/PIAS1蛋白及mRNA表达有调节作用,氧化苦参碱可能影响JAK/STAT信号转导通路。

Caspase-3体外对PIAS1蛋白酶切作用的初步验证

目的观察凋亡相关蛋白Caspase-3体外对PIAS1蛋白的酶切作用,为后续研究奠定基础。方法以HEK293T细胞表达PIAS1蛋白,采用免疫共沉淀(Co-IP)实验观察其与Caspase-3间的结合作用;采用体外蛋白酶切实验检测Caspase-3对PIAS1的酶切作用。结果 Co-IP实验发现体外Caspase-3可与PIAS1蛋白结合;蛋白酶切实验发现PIAS1的酶切片段。结论 Caspase-3与PIAS1在体外具有相互作用,PIAS1体外可被Caspase-3酶切,为后续研究奠定了基础。

miR-181a-5p靶向PIAS1对雨蛙肽诱导的急性胰腺炎腺泡细胞损伤的影响

背景急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)引起的急性炎症对人们健康的危害性极大,严重时会危及生命.其发病机制复杂,尚未完全清楚,研究发现miRNA参与了AP的发病过程.研究发现miR-181a-5p可抑制癌细胞迁移、侵袭和血管生成;miR-181a-5p还能抑制胃癌细胞增殖、侵袭,转移和上皮间充质转化.抑制miR-181a-5p表达可通过负向靶向INPP5A抑制细胞增殖和侵袭,增强宫颈癌细胞凋亡.miR-181a可抑制胰腺癌细胞系的生长、减少迁移,增加凋亡.但miR-181a-5p在AP的增殖凋亡中的影响及作用机制尚不清楚.目的研究miR-181a-5p对AP腺泡细胞损伤的影响及潜在的作用机制.方法用100 nmol/L的雨蛙肽处理大鼠胰腺腺泡AR42J和MPC-83构建AP模型,设置Con组、Caerulein组、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-181a-5p组(转染miR-181a-5p mimics)、anti-miR-NC组(转染antimiR-NC)、anti-miR-181a-5p组(转染anti-miR-181a-5p)、Caerulein+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p组(转染anti-miR-181a-5p后进行Caerulein处)、Caerulein+pcDNA组(转染pcDNA后进行Caerulein处理)、Caerulein+pcDNA-PIAS1组(转染pcDNA-PIAS1后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-NC组(anti-miR-181a-5p和si-NC共转染后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-PIAS1组(anti-miR-181a-5p和si-PIAS1共转染后进行Caerulein处理),用脂质体法转染至AR42J和MPC-83细胞.酶联免疫吸附试验法检测雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞的TNF-α和IL-6的表达;qRT-PCR检测AR42J和MPC-83细胞中miR-181a-5p、PIAS1 mRNA的表达水平;Western Blot检测蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性.结果雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞后,TNF-α和IL-6的表达显著升高;miR-181a-5p的表达水平显著升高;PIAS1 mRNA和蛋白的表达水平显著降低.miR-181a-5p抑制表达和PIAS1过表达抑制TNF-α和IL-6的表达,抑制细胞凋亡.miR-181a-5p靶向负调控PIAS1;抑制PIAS1表达逆转了抑制miR-181a-5p对雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞的凋亡抑制作用.结论抑制miR-181a-5p表达可以抑制雨蛙肽诱导的AP腺泡细胞损伤,其机制可能与靶向调控PIAS1有关.可为AP诊断和治疗提供新靶点和新思路.

小鼠乳腺组织不同发育时期STAT1和PIAS1蛋白表达

STAT1(Signal transducer and activator of transcription 1)是关系到细胞生长、分化、凋亡和干扰刺激的重要转录因子。PIAS1(Protein inhibitor of activated STAT1)作为STAT1的特异抑制因子,能够阻断STAT1的DNA结合活性,抑制STAT1对于细胞刺激所介导的基因激活。最近几年,关于STAT1和PIAS1的研究已有报到,但在乳腺发育方面研究尚未见报道。试验应用qRT-PCR、Western blotting和免疫组织化学的方法分析STAT1和PIAS1在小鼠乳腺发育的不同时期中的表达情况。结果表明,STAT1和PIAS1的mRNA和蛋白水平从妊娠期到泌乳期都有显著增加,呈协同状态;定位表达结果显示STAT1和PIAS1主要出现在导管上皮细胞以及腺泡上皮细胞上,在乳腺发育的个别时期细胞外基质中有弱表达。从而初步探讨STATI信号转导途径及其负调节因子PIAS1与乳腺发育的关系。

PIAS1与肿瘤

PIAS1(protein inhibitor of activated signal transducer and activators of transcription 1)蛋白是一种可以抑制信号转导与转录激活子1(signal transducer and activators of transcription 1,STAT1)的特异性抑制蛋白,也具有小泛素样修饰剂(small ubiquitin-like modifier,SUMO)连接酶E3的活性,参与多种转录因子的活性调控和多种蛋白质的SUMO化修饰。PIAS1在肿瘤的发生发展过程中是一把"双刃剑",既有促进作用,也有抑制作用。PIAS1在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤等组织中高表达,可以通过促进肿瘤细胞的增殖和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡作用,来调控肿瘤的发生发展;但是PIAS1在胃癌、结肠癌等组织上表达较低。本文综述PIAS1在肿瘤发生发展过程中的调控作用,为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。

PIAS1通过调控Sonic hedgehog信号通路使胰腺癌细胞SW1990获得对吉西他滨的耐药性

目的 :研究吉西他滨耐药性胰腺癌细胞中Sonic hedgehog(Shh)信号通路异常激活的机制。方法:通过间歇梯度倍增法筛选出对吉西他滨产生耐药性的胰腺癌细胞SW1990-GEM,荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测耐药细胞中PIAS1的表达;利用RNA干扰技术构建稳定低表达PIAS1的细胞株SW1990-GEM-sh PIAS1,从增殖速度、克隆形成能力及裸鼠皮下成瘤能力等方面考察PIAS1、Shh信号通路与胰腺癌耐药性的相关性。结果:耐药株SW1990-GEM中PIAS1基因表达量明显升高;PIAS1的高度表达正向激活了Shh信号通路的活性,使得细胞获得耐药能力;人为降低PIAS1的高表达后,耐药株的耐药能力同时被减弱。结论:PIAS1是使耐药株获得耐药性的关键因子,PIAS1通过正向调控Shh信号通路使其获得耐药能力。

miR-375调控PIAS1对急性胰腺炎腺泡细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨微小RNA-375(miR-375)对急性胰腺炎(AP)腺泡细胞增殖及凋亡的影响及其对信号转导和转录激活子1的活化抑制蛋白(PIAS1)的调控作用。方法用雨蛙素(CAE)处理胰腺腺泡细胞株(AR42J细胞)构建AP模型,实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)与Western印迹分别检测miR-375与PIAS1的表达。利用脂质体转染技术分别将anti-miR-NC、anti-miR-375、si-NC、si-PIAS1转染至AR42J细胞,同时将anti-miR-375与si-NC、si-PIAS1分别共转染至AR42J细胞后加入CAE处理细胞。噻唑蓝(MTT)实验与流式细胞仪分别检测AR42J细胞增殖及凋亡。双荧光素酶报告基因实验检测miR-375对PIAS1的靶向作用。Western印迹检测CyclinD1、P21、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白的表达。结果CAE处理后AR42J细胞中miR-375的表达升高,而PIAS1的表达降低;双荧光素酶报告基因实验证实PIAS1是miR-375的直接靶点;转染anti-miR-375后,由CAE诱导的AR42J细胞凋亡明显受到抑制,而细胞增殖能力明显增强,CyclinD1、Bcl-2蛋白表达上调,P21、Bax蛋白表达下调(均P<0.05);共转染si-PIAS1后,明显促进CAE诱导的AR42J细胞凋亡,而抑制细胞增殖,CyclinD1、Bcl-2蛋白表达下调,P21、Bax蛋白表达上调(均P<0.05)。结论miR-375在AP腺泡细胞中高表达,而PIAS1低表达,沉默miR-375可通过上调PIAS1表达而抑制腺泡细胞凋亡并促进细胞增殖进而减缓AP发展进程。

肝细胞癌和癌旁肝组织中PIAS1蛋白表达及其临床意义

目的探讨肝细胞癌(HCC)和癌旁肝组织中信号转导和转录激活因子1(STAT1)抑制因子(PIAS1)的表达及其临床意义。方法利用两步法免疫组织化学技术检测PIAS1蛋白在HCC及其癌旁肝组织的表达。结果PIAS1蛋白在HCC中的阳性率和阳性强度均低于癌旁肝组织(P<0.01);HCC中PIAS1蛋白的表达强度与患者的性别和肿瘤的大小无关(P>0.05),但与肿瘤细胞的分化程度明显相关(P<0.01)。分化越差,表达越弱。结论提示检测PIAS1蛋白对判断HCC的预后具有一定意义,纠正PIAS1蛋白的表达有可能成为HCC基因治疗新策略。

PIAS1介导的A型流感病毒PB2苏素化修饰抑制病毒复制和致病性

A型流感病毒(Influenza A virus)基因组由8条单股负链RNA片段组成,编码至少10种蛋白质。A型流感病毒因亚型和毒株不同可以引起人的全身性或呼吸道传染病,对人类生命健康构成严重威胁,而且其易于发生突变和基因重组的特性为疫苗和药物研发带来了极大挑战。因此,深入解析病毒致病机制和宿主防御机制,可以为新型干预和阻断技术研发积累科学数据。

从癫痫模型大鼠海马神经元中克隆caspase 3的新底物PIAS1

目的 从癫痫模型大鼠海马凋亡神经元中克隆caspase - 3的新底物。 方法 制作癫痫模型大鼠海马组织cDNA文库 ;PCR获得caspase- 3的P12和P17两亚基 ,然后分别定向插入pBridge质粒 ,构建三杂交诱饵载体 ;进行酵母三杂交筛库。结果 建立成功癫痫模型大鼠海马组织cDNA文库 ,构建了大鼠caspase- 3基因的酵母三杂交诱饵载体 ,并通过了caspase - 3与eIF2α之间的相互作用验证 ,筛库获得caspase- 3的新底物PIAS1。 结论 用酵母三杂交系统寻找caspase- 3下游底物具有可行性 ,从癫痫模型大鼠海马的cDNA文库中筛库获得caspase - 3的新底物PIAS1,为进一步研究caspase

Pias1对Foxp3的表观遗传学调控

鉴于Treg细胞在免疫负向调控方面的重要作用,Treg细胞的特征标志分子——Foxp3的转录调控一直受到广泛的关注。目前对诱导Foxp3的转录信号研究比较透彻,例如CD3、CD28介导的信号可以激活AP-1和NFAT,结合于Foxp3的启动子序列激活转录；而IL-2R介导的信号可以激活STAT5并结合于Foxp3的CNS2序列，稳定Foxp3表达；TGF-βR介导的信号可以激活SMAD2和SMAD3结合于Foxp3的CNSl序列，在iTreg的分化中起着重要的作用。但对抑制Foxp3转录信号几乎没有研究涉及。

PIAS1对裸鼠胃癌种植瘤模型肿瘤细胞增殖的影响及机制研究

目的通过检测信号转导与转录激活子1(STAT1)的活化抑制蛋白(PIAS1)在胃癌细胞株中的表达水平,分析其与胃癌细胞增殖及肿瘤微环境的关系,为胃癌的诊治提供新的靶点。方法构建慢病毒携载PIAS1基因(LV-EGFP-PIAS1)胃癌细胞株SGC-7901,检测PIAS1的表达水平及细胞增殖率。收集LV-EGFP-PIAS1胃癌细胞、LV-EGFP-native空白细胞和对照SGC-7901细胞种植于裸鼠皮下。观察肿瘤体积,通过免疫组织化学法测定增殖细胞核抗原(PCNA)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、CD34、F4-80的表达水平,计算各组间肿瘤微环境转移(TMEM)结构的数目,应用统计学软件分析各指标表达水平的差异。结果Western blotting测定结果显示,LV-EGFP-PIAS1胃癌细胞株SGC-7901中PIAS1呈高表达,并且细胞增殖率相较于LV-EGFP-native空白组及对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。裸鼠种植瘤模型显示,相较于LV-EGFP-native空白组及对照组,LV-EGFP-PIAS1转染组的肿瘤体积明显减小,且PCNA、HIF-1α蛋白表达水平明显降低。肿瘤组织TMEM计数结果显示,LV-EGFP-PIAS1转染组为(2.83±0.93)个,少于LV-EGFP-native空白组(3.83±0.83)个和对照组(3.91±0.99)个,差异有统计学意义(P<0.05)。上述各指标在LV-EGFP-native空白组及对照组之间的差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论PIAS1参与了胃癌细胞的增殖过程,并可抑制肿瘤的发生、发展,其机制可能为通过调控HIF-1α而改变肿瘤的微环境结构。PIAS1可能成为胃癌治疗的新靶点。

尖锐湿疣患者皮损中SOCS1和PIAS1的表达及意义

目的探讨尖锐湿疣（CA）皮损角质形成细胞中细胞因子信号转导JAK／STAT通路负调控蛋白细胞因子信号抑制剂-1（SOCS1）和活化STAT的蛋白抑制剂-1（PIAS1）的表达。方法采用SP免疫组化染色技术检测40例CA患者皮损、20例宫颈癌和20例正常人皮肤（包皮）中SOCS1和PIAS1的表达及分布。结果①CA患者皮损中SOCS1和PIAS1的表达阳性细胞分布主要位于棘细胞层，为棕黄着色，阳性反应定位胞质；宫颈鳞状细胞癌亦为胞质阳性表达，棕黄着色，呈弥漫性分布；而正常包皮少数阳性着色主要定位于基底层细胞的胞质，呈浅黄着色。②CA皮损中SOCS1和PIAS1的表达阳性率分别为85％和80％，高于在正常人上皮中的表达（阳性率分别为30％和35％），两组比较差异均有统计学意义（前者X^2=18．15，P〈0．01；后者X^2=11．87，P〈0．01）；宫颈癌中SOCS1和PIAS1的表达阳性率分别为90％和85％，虽较CA有升高，但两者比较差异均无统计学意义（两者均P〉0．05）。③CA中SOCS1与PIAS1的表达无显著相关性（rs=0．14，P〉0．05）。结论CA皮损中可能通过细胞因子信号转导负调控蛋白SOCS1和PIAS1在角质形成细胞过度增殖或恶性转化过程中起调控作用。

PIAS1对PRRSV N蛋白SUMO化修饰及病毒复制的影响

【目的】猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种危害全球养猪业的重要病原。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)化修饰作为一种可逆的翻译后修饰在调节病毒复制方面发挥着重要功能。PIAS1(Protein inhibitor of activated STAT1)是SUMO E3连接酶PIAS家族的一员,可以促进靶蛋白的SUMO化修饰,进而影响靶蛋白的功能,参与基因转录调控过程。探究PIAS1与PRRSV N蛋白相互作用的机制及其对N蛋白SUMO化修饰和病毒复制的影响,为进一步阐明PRRSV复制调控和致病的分子机制提供科学依据。【方法】利用酵母回复杂交、免疫共沉淀和激光共聚焦技术验证N蛋白与PIAS1的相互作用;以递增剂量外源性转染PIAS1观察其是否介导N蛋白SUMO化修饰;采用RNA干扰和慢病毒转导技术测定PIAS1对PRRSV复制的影响。【结果】PIAS1能与N蛋白相互作用,而且两者主要共定位于胞浆中;外源转染PIAS1并未增加N蛋白SUMO化修饰水平;在MARC-145细胞中,PIAS1的表达有利于PRRSV的复制。【结论】PIAS1可促进PRRSV的复制。

LIM结构域蛋白KyoT相互作用分子的筛选

KyoT为LIM结构域蛋白 ,可与转录因子RBP Jk相互作用。为了研究其功能 ,用酵母双杂交法筛选了与KyoT相互作用的蛋白。以KyoT2为诱饵筛选人淋巴结cDNA文库 ,从 5× 10 6 个克隆中共获得 4 2个阳性克隆。提取质粒进行酶切鉴定 ,获得 2 2个非重复克隆。对此 2 2个克隆进行序列分析 ,共获得 13种基因 ,其中包括已知的KyoT相互作用蛋白RBP Jk和两个未知基因。另一种被筛选到的已知基因是激活状态的信号转导物和转录因子 1活化物的抑制蛋白 (proteininhibitorofactivatedsignaltransducerandactivatoroftranscription 1,PIAS1)。由于KyoT在小鼠睾丸中表达较高 ,因此进一步探讨了KyoT2与PIAS1的相互作用。并首先在酵母中证实KyoT2与PIAS1的相互作用并得到阳性结果。进而在大肠杆菌中表达纯化了KyoT2蛋白 ,并以此为抗原制备了抗KyoT2多克隆抗体 ,再用GST pulldown实验验证了KyoT2和PIAS1在体外的相互作用。成功筛选了KyoT相互作用蛋白 ,发现并验证了KyoT与PIAS1的相互作用 。

苦参碱对宫颈癌HeLa细胞JAK-STAT通路负调控机制研究

目的:观察苦参碱对宫颈癌HeLa细胞中JAK-STAT信号通路的负性调控作用。方法:以不加药细胞为对照组,实验组加入不同浓度苦参碱(0.5、1.0、2.0 mg/m L)作用24 h,Western blot法检测SHP2、SOCS3、PIAS1蛋白表达、Real-Time PCR检测SHP2、SOCS3、PIAS1的mRNA表达。结果:与对照组比较,各给药组细胞SHP2、SOCS3蛋白及mRNA表达显著上调(P<0.05),其作用呈浓度依赖性;各组PIAS1蛋白及mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:苦参碱通过上调HeLa细胞中SHP2、SOCS3蛋白及mRNA水平,负性调节JAK-STAT信号通路活性,抑制宫颈癌HeLa细胞增殖。

海人藻酸致痫大鼠海马神经元凋亡中caspase-3作用的实验研究

目的阐明癫痫模型大鼠海马神经元凋亡中caspase-3的作用机制。方法以TUNEL法检测KA致痫大鼠海马神经元凋亡情况,以WesternBlot方法检测其海马神经元中eIF2α的表达变化。取模型鼠海马组织制备cDNA文库,以caspase-3的大小亚单位构建酵母三杂交诱饵载体,并进行酵母三杂交筛库实验。结果在癫痫发作后12h海马出现凋亡神经元,72h达高峰;发作后24h海马神经元出现eIF2α被caspase-3酶切的片段,逐渐增加至72h。成功制备癫痫模型大鼠海马组织cDNA文库,构建了caspase3酵母三杂交诱饵载体,验证了caspase3与eIF2α之间的相互作用,并经筛库获得caspase3的新底物PIAS1。结论在癫痫模型大鼠海马凋亡神经元中eIF2α被caspase3酶切。酵母三杂交技术可用于筛库寻找caspase3下游底物,从癫痫大鼠海马中获得caspase3的新底物PIAS1,为进一步研究在癫痫发作致神经元损伤中caspase3的作用建立了基础。

癫癎模型大鼠海马神经元凋亡细胞中caspase3新底物的寻找

目的:在癫癎模型大鼠海马神经元凋亡细胞中寻找caspase 3新底物。方法:建立癫癎模型大鼠海马组织cDNA文库,构建含caspase 3的P12和P17两亚基的三杂交诱饵载体,检测其效果,并进行酵母三杂交筛库。结果:成功建立了癫癎模型大鼠海马组织cDNA文库,构建了大鼠caspase 3基因的酵母三杂交诱饵载体,并通过caspase 3与eIF2α之间的相互作用验证;以此三杂交诱饵载体筛库获得caspase 3的新底物PIAS1及MIZ1。结论:从癫癎模型大鼠海马的cDNA文库中筛库获得caspase 3的新底物,为进一步研究caspase 3在癫癎发作引起海马神经损伤中的作用创造了条件。

与流感病毒NP互作的宿主靶点及栀子环烯醚萜苷抗流感病毒的机制

目的:探索与流感病毒核蛋白(NP)相互作用的宿主因子,研究其对流感病毒复制的影响,以及栀子环烯醚萜苷(IGE)抑制流感病毒的作用机制。方法:利用酵母双杂交系统筛选与流感病毒NP相互作用的宿主因子;通过免疫共沉淀实验对异质核糖核蛋白(HNRNPD)、氨基葡萄糖6磷酸脱氨酶1(GNPDA1)、Poly/rC结合因子1(PCBP1)、激活信号转导和转录激活因子(STAT)蛋白1抑制因子(PIAS1)进行验证;通过双荧光素酶实验比较PIAS1和HNRNPD对流感病毒复制的影响,并检测在转染核糖核蛋白体复合物(RNP)及PIAS1敲低的情况下,给予栀子环烯醚萜苷对流感病毒复制的影响。将ICR小鼠随机分为正常组、模型组、达菲组和IGE高、中、低剂量组,每组10只。除正常组外各组滴鼻感染甲型流感病毒FM1株建立病毒性肺炎模型。IGE高、中、低剂量组分别给予50、25、12.5 mg∙kg^(-1)IGE灌胃,达菲组给予27.5 mg∙kg^(-1)达菲灌胃,正常组和模型组灌服等体积蒸馏水,连续4 d。实验结束后,蛋白免疫印迹法检测肺组织中PIAS1、NP、磷酸化(p)-STAT3、STAT3、p-STAT1、STAT1的蛋白表达。结果:在酵母双杂交实验中,发现了16个流感病毒NP的潜在互作宿主靶点;免疫共沉淀实验发现HNRNPD和PIAS1可以与流感病毒NP相互作用;双荧光素酶报告实验中PIAS1敲低和过表达都可明显影响IAV RNP活性(P<0.05,P<0.01),HNRNPD对IAV RNP的影响差异无统计学意义;IGE高、低剂量组均可使流感病毒复制减少(P<0.05),并可逆转PIAS1敲低导致的流感病毒复制增加(P<0.05,P<0.01)。IGE各剂量组不同程度地降低感染小鼠肺组织PIAS1、NP、p-STAT3、p-STAT1、STAT1的表达量(P<0.05,P<0.01)。结论:PIAS1和流感病毒NP相互作用,并能够抑制流感病毒的复制,栀子环烯醚萜苷可能通过PIAS1/STAT1通路抑制IAV RNP的活性,从而发挥抗病毒作用。

氧化苦参碱对棕榈酸诱导的人脐静脉内皮细胞胰岛素抵抗的作用及机制

目的 探讨氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)对棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)作用及机制。方法 通过PA(0.25 mmol/L)诱导HUVECs建立IR模型后,进行OMT的量效关系和时效关系研究,筛选出OMT的最佳作用浓度和最佳作用时间。CCK-8法检测HUVECs活力;苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态;Westernblotting检测细胞磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)通路、激活信号传导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)蛋白抑制因子1(protein inhibitor of activated STAT 1,PIAS1)蛋白表达;试剂盒检测一氧化氮(nitric oxide,NO)水平。根据筛选出的OMT最佳浓度(4μmol/L)和作用时间(48 h),敲低PIAS1进行机制探讨,Western blotting检测PIAS1、核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)蛋白表达;荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;ELISA法检测白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平;免疫荧光法观察NF-κB p65核转位情况。结果 随着OMT作用浓度和时间的增加,PI3K/Akt/eNOS通路和PIAS1蛋白表达量及NO水平均增加(P<0.05、0.01、0.001)。转染Ad-PIAS1-RNAi后,NF-κB p65蛋白表达量、ROS和IL-6水平均显著增加(P<0.01、0.001),NF-κB p65入核程度显著增强(P<0.05、0.01),而OMT可以部分逆转上述作用(P<0.05、0.01、0.001)。结论 OMT能改善PA体外诱导的血管内皮IR,其机制主要是通过上调PIAS1通路减轻高脂诱导的炎症反应和氧化应激。