人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的 :研究人Flt 1胞外区 2 3loopcDNA在Pichia pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt 1(2 3)。方法 :采用PCR扩增Flt 1(2 3)基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母表达载体中 ,构建重组质粒pPIC9K Flt 1(2 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Muts 表型转化子 ,摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达。表达产物经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,测定其生物学活性。结果 :SDS PAGE分析显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中 ,诱导 4d的表达量达上清总蛋白的 6 0 %以上。ELISA及Westernblot实验表明 ,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,Flt 1(2 3)纯度达到 90 %以上。生物学活性检测证实其具有结合hVEGF1 6 5 的能力和抑制hVEGF1 6 5 对HUVEC的促增殖功能。结论 :获得了具有生物学活性的可溶性重组Flt 1受体胞外区 2 3loop小片段 ,为进一步的动物实验和临床应用打下了基础。

新型酵母表达系统-Pichia.pastoris高效分泌型表达病毒生长因子的研究

目的：实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法：构建pPIC9K/VGF表达载体，扩增引物分别为P1：TATACGTAGATAGTGGTAAGG，P2：TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT；采用Pichia.pastoris酵母表达系统。结果：经酶切鉴定，证明克隆的基因是正确的；经SDS-PAGE分析，证明转化基因组中确实整合有VGF基因，其分子量为9．6kD；得到了高效分泌型VGF高产菌株，目的蛋白占培养液上清蛋白总量的80％以上，产量为0.45g/L。结论：证实可以通过Pichia.pasoris系统制备可溶性痘菌病毒生长因子。为大规模工业生产打下基础。

肠道病毒71型外壳蛋白VP3在Pichia.pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆肠道病毒71型SHZH98株外壳蛋白VP3基因,连接T载体,经序列测定后,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP3,经序列测定证实-factor信号肽和VP3的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导,筛选到5株高效表达VP3蛋白的工程菌株.ELISA实验表明:重组蛋白VP3具有较好的免疫原性.

藏獒IFN-γ基因在毕赤酵母中的表达与抗病毒活性分析

采用毕赤酵母表达系统表达藏獒γ-干扰素(Tibetan mastiff interferon gamma,TmIFN-γ)并分析其生物活性,为抗病毒生物制品的研发与临床应用奠定基础。将构建的TmIFN-γ的真核表达质粒pPIC9k-TmIFN-γ转化至毕赤酵母GS115细胞,用不同浓度的G418筛选得到多拷贝重组菌株;利用甲醇进行诱导表达,以镍层析柱纯化目的蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;通过CCK-8试验检测重组TmIFN-γ蛋白的细胞毒性作用,利用VSV-MDBK系统检测其抗病毒生物活性。结果显示,成功筛选得到高拷贝pPIC9k-TmIFN-γ重组转化毕赤酵母菌株,利用甲醇诱导可获得TmIFN-γ重组蛋白,该蛋白对细胞无毒性,具有显著抗病毒活性,其抗病毒生物效价为1.727×10~5IU/mL。本研究获得了具有抗病毒活性的TmIFN-γ,有助于进一步探索TmIFN-γ的功能和开发新型基因工程抗病毒药物。

密码子优化和信号肽对猪圆环病毒ORF2基因在毕赤酵母表达中的影响

为了在毕赤酵母中高效表达PCV2ORF2基因,对PCV2ORF2基因编码的187个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏爱性优化,利用两步PCR全化学合成优化后的ORF2基因。将优化前后的PCV2ORF2基因片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,构建重组质粒pPICZα-C-ORF2和p PICZα-C-ORF2op。将线性化的重组质粒电转化毕赤酵母GS115,并筛选Zeocin抗性重组子。同时,也研究了信号肽对PCV2ORF2表达效率的影响。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,只有经密码子优化且去除ORF2基因自身信号肽的重组子能够分泌表达PCV2 ORF2蛋白,目的蛋白分子质量约为30 ku,表达的重组ORF2蛋白可被PCV2阳性血清识别,具有生物学活性。

茯苓多糖合成途径磷酸葡萄糖变位酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因鉴定

采用已报道的灵芝磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPP)基因序列对茯苓基因组进行搜索比对,获得茯苓WcPGM和WcUGPP候选基因序列;以茯苓的cDNA为模板,成功克隆获得WcPGM和WcUGPP基因;随后利用pPIC9K构建2个基因的表达载体,并转化至毕赤酵母进行异源表达。序列分析表明WcPGM和WcUGPP基因全长分别为2021 bp和2144 bp,其中WcPGM基因含有5个外显子和4个内含子,编码564个氨基酸;WcUGPP基因含有11个外显子和10个内含子,编码502个氨基酸。氨基酸序列比对表明,WcPGM和WcUGPP与来源于绣球菌的ScPGM和ScUGPP的同源性分别为87%和91%。酶活测定表明,重组酶WcPGM可转化葡萄糖-1-磷酸(G1P)为葡萄糖-6-磷酸(G6P),酶活达1540 U·mL^(-1);重组酶WcUGPP可催化G1P和尿苷三磷酸(UTP)合成UDP-葡萄糖(UDP-Glc),酶活达660 U·mL^(-1),表明从茯苓中筛选到的2个酶WcPGM和WcUGPP具有PGM和UGPP活性。分子模拟表明,WcPGM在催化可逆反应过程中S114为磷酸供体和受体,R24和K379作为催化酸和碱实现底物的磷酸化和去磷酸化,而E366和S368可实现底物的2种朝向,保障了中间产物葡萄糖-1,6-二磷酸的翻转,确保了WcPGM的可逆反应;而WcUGPP活性中心的核苷酸结合Loop和糖结合Loop保障了底物的正确朝向,K390作为催化碱实现了底物UTP/G1P与UDP-Glc的可逆反应。该研究为茯苓多糖合成途径的解析和代谢工程提升茯苓多糖产量奠定了基础。

转录因子Prm1和Mit1对毕赤酵母产外源蛋白的影响

【目的】研究转录因子Prm1和Mit1在毕赤酵母表达外源蛋白中的作用,为提高毕赤酵母中的外源蛋白产量提供参考。【方法】以毕赤酵母GS115为出发菌构建8种菌株,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,过表达Prm1、Mit1或敲除Prm1、Mit1和Mxr1,以GFP的表达量为指标,分析其对毕赤酵母产外源蛋白的影响。在甲醇和甘油2种碳源下,利用实时定量PCR分析Prm1和Mit1在转录水平的表达情况,探究Prm1和Mit1的关系。【结果】成功构建了表达GFP的菌株、单因子过表达Prm1和Mit1的菌株及敲除Prm1、Mit1、Mxr1的菌株等8种菌株。利用P AOX1诱导型过表达Prm1,毕赤酵母细胞内的GFP表达量极显著提高(P<0.01),而用P_(GAP)组成型过表达Prm1,GFP的表达量无明显变化;利用P_(AOX1)诱导型和P_(GAP)组成型过表达Mit1,GFP表达量均极显著提高(P<0.01),较对照分别提高3.2和2.5倍;敲除Prm1后,GFP的表达量显著下降(P<0.05);敲除Mit1后,GFP几乎不能发出荧光。实时荧光定量PCR结果显示,在甲醇和甘油2种碳源下,敲除Prm1后Mit1少量表达,敲除Mit1后Prm1大量表达。【结论】利用P_(AOX1)诱导型过表达Prm1、Mit1和利用P_(GAP)组成型过表达Mit1,均能提高GFP在毕赤酵母细胞内的表达量。Prm1和Mit1可作为正调控因子在毕赤酵母产外源蛋白中发挥作用,且Prm1能激活Mit1,Mit1可反馈抑制Prm1。

组胺降解酵母的筛选及其对桑葚果酒品质的影响

为了筛选能够有效控制桑葚果酒组胺的非酿酒酵母,该研究对桑葚和自然发酵桑葚果酒中的微生物进行分离,通过评价分离菌株降解组胺和合成生物胺的能力筛选目的菌株,并解析目的菌株对桑葚果酒品质的影响。结果显示,菌株SJ36表现出较好的组胺降解能力(65.32%)且无生物胺合成能力,经分子生物学以及系统发育学分析鉴定为库德里阿兹威氏毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)。为评价其酿造特性,将SJ36复合酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵桑葚果酒。与酿酒酵母单菌发酵相比,复合发酵获得的桑葚果酒酒体丰满,酒香浓郁,感官评分为82.51分,白藜芦醇含量、总花色苷含量、DPPH自由基清除能力和ABTS阳离子自由基清除能力分别提高5.52%、8.27%、5.93%和6.86%,而组胺、甲醇和高级醇含量分别下降89.02%、23.00%和10.67%。综上,P.kudriavzevii SJ36和S.cerevisiae复合发酵更适合桑葚果酒的酿造,研究结果可为高品质高安全性的桑葚果酒的生产提供潜在发酵菌株。

基于计算设计的GH11家族木聚糖酶CDBFV的热稳定性改造及潜在机制研究

【目的】瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum GH11家族木聚糖酶CDBFV在饲料、食品等领域具有良好应用前景,提高其热稳定性对其生产应用十分重要。【方法】使用分子动力学模拟、机器学习等策略设计潜在CDBFV热稳定性突变体,在大肠杆菌和毕赤酵母中进行异源表达纯化,测定最适反应条件、比酶活和85℃孵育3 min后相对剩余活力,通过结构分析明确热稳定性提高机制。【结果】位于CDBFV N端基序~(36)GNNS~(39)具有较高柔性,对其改造设计的单突变体N37P和N38V在85℃孵育3 min后,相对活力分别降低至70.3%和55.1%,较野生型(48.7%)提升了21.6%和6.5%;进而,在相对活力提升显著的N37P基础上叠加已报道优势突变体N88G,构建双突变体N37P/N88G,其相对活力达到了73.4%,较野生型提高了24.7%;此外,将N37P/N88G在毕赤酵母中进行了分泌表达,在85℃处理3 min后,相对活力达到了88.8%;结构分析表明,N37P突变的引入使得CDBFV形成了新的氢键相互作用,降低活性位点附近柔性,并干预了糖基化形成,进而提高了热稳定性。【结论】成功得到了高耐热双突变体N37P/N88G,为提高GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造提供了新的思路和方法,有望推动CDBFV在饲料工业等高温环境下的广泛应用。

基于稀酸预处理和库德毕赤酵母发酵的蜈蚣藻多糖利用制备生物乙醇研究

蜈蚣藻多糖含量丰富,价格低廉,具有发酵生产生物乙醇的潜力。该研究以蜈蚣藻为原料,通过单因素和响应面试验优化确定最佳稀酸预处理蜈蚣藻水解液的条件为料液比1∶20(g∶mL)、时间1.8 h、温度100℃、稀硫酸质量分数为3%,获得的还原糖含量最高,达到37.64%。对稀酸预处理蜈蚣藻水解液中单糖组成和含量进行分析,结果发现,稀酸预处理能够显著提高蜈蚣藻水解液中单糖含量,半乳糖和葡萄糖是其中含量最高的单糖组分。利用库德毕赤酵母对蜈蚣藻水解液进行发酵,结果发现该菌具有良好的生长和产乙醇能力,而且接种量的增加能够显著提高菌株的生物量和乙醇发酵特性。Pearson相关性分析显示,蜈蚣藻水解液中各单糖含量与生物量和各乙醇发酵参数呈显著负相关,生物量与各乙醇发酵参数呈显著正相关,表明蜈蚣藻水解液中单糖的消耗在库德毕赤酵母的生长和乙醇生产过程中起重要作用,而酵母菌的生长状况直接关系到乙醇的发酵生产。相关性网络图显示,葡萄糖和半乳糖的消耗对库德毕赤酵母生物量增加和乙醇生产的影响最大。结果表明,利用蜈蚣藻为原料通过稀酸预处理结合库德毕赤酵母发酵,具有生产生物乙醇的应用潜力,该研究也为其他海藻发酵生产生物乙醇提供重要的技术参考。

白酒大曲中产香微生物筛选及提升再造烟叶品质研究

针对再造烟叶香气质较差的问题,从广西特香型白酒大曲中筛选能够利用再造烟叶萃取液中营养物质发酵产香的微生物,结合形态学及分子生物学方法对产香效果最佳的微生物进行菌株鉴定及发酵条件优化,利用GC-MS技术测定其产香的物质基础,并将其添加于再造烟叶中进行感官评价。结果表明:筛选出的Y-1菌株对再造烟叶萃取液中可溶性糖和蛋白质的利用能力最强,对萃取液的香气改善效果最佳;经鉴定,Y-1菌株为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii),其在25℃、pH值为5、体积分数为80%的再造烟叶萃取液中发酵24 h后,能够显著提升萃取液中酯类、酮类、醇类和酸类等挥发性香气物质的含量,提升幅度分别达2.31倍、0.66倍、12.15倍和2.74倍,且萃取液中新增16种挥发性香气物质;Y-1菌株发酵萃取液添加于再造烟叶后,能显著增强其果香、甜香感及香气层次感,提升其吸味品质。

一株脱氮毕赤酵母Y 4的分离鉴定及其氨氮降解性能

当前水体氨氮污染严重,环境治理迫在眉睫,筛选高效安全的脱氮菌株可为废水脱氮提供更多选择。本研究从沼气发酵污泥中分离筛选能降解氨氮的菌株,使用18S rDNA序列分析,对筛选出的优良菌株进行种类鉴定;同时采用单因素试验和正交试验,探究菌株最佳脱氮条件[培养温度、初始pH值、盐浓度、碳氮比(C/N)]及其硝化、反硝化能力。结果表明,分离筛选得到1株具有较强脱氮能力的野生型毕赤酵母(Pichia sp.)菌株Y 4。在试验优化后,得到菌株Y 4的最适脱氮条件:培养温度25℃,初始pH值8.0、盐浓度(氯化钠浓度)30 g/L、C/N为30。在培养24 h后菌株Y 4对亚硝酸氮(NO-2 N)的降解率为80.50%,在培养48 h后菌株Y 4对氨氮(NH+4 N)的降解率达99.92%,且在24 h内菌株Y 4的异养硝化和好氧反硝化的速率分别达到6.25和6.71 mg/(L·h),表明毕赤酵母菌株Y 4对废水氮污染处理以及生物修复具有一定的应用价值与潜力。

毕赤酵母PAS_chr4_0427基因敲除促进神经酰胺合成

神经酰胺是应用于化妆品和药品的一类脂质分子,利用微生物代谢工程合成神经酰胺具有重要前景。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是优良的工业宿主,目前尚无利用P.pastoris强化神经酰胺的研究。首先构建P.pastoris GS115ΔPAS_chr3_0329(G-K)作为底盘,然后在G-K中敲除神经酰胺合成负反馈基因PAS_chr4_0427(G-KO),并利用脂质组学技术探究神经酰胺的组成及含量变化。结果表明,与G-K相比,G-KO中神经酰胺在总脂质中相对含量增加了628.13%,达到9.32%;并促进合成更多具有不饱和长链碱基的神经酰胺。与此同时,G-KO中鞘脂相对含量增加,而磷脂相对含量降低。对P.pastoris中神经酰胺丰度最高的Cer(d18∶0)神经酰胺进行HPLC分析,显示G-KO中Cer(d18∶0)神经酰胺合成量达90.22 mg/L,相比G-K提升了872.20%。该研究证实P.pastoris可用于神经酰胺合成,PAS_chr4_0427缺失株G-KO具有良好的神经酰胺合成能力,具有工业发酵制备神经酰胺的潜力。

毕赤酵母分泌型遗传操作工具的构建与优化

为了解决毕赤酵母遗传操作效率低且流程繁琐的问题,提高其应用价值,构建并优化了分泌型遗传操作工具。首先,以α-淀粉酶为报告蛋白,通过融合自主复制序列构建非整合型表达质粒;其次,借助通用引物和POE-PCR,快速筛选评估与目的蛋白最匹配的内源信号肽;最后,构建以亚磷酸盐为唯一磷源的营养依赖型筛选标记。结果表明:2种非整合型质粒表达α-淀粉酶的酶活分别是整合型质粒的2倍和1.6倍;以FLO10、EXG1和MSB 2为信号肽引导的α-淀粉酶酶活分别是常规信号肽α-MF的2.5倍、1.94倍和1.75倍;亚磷酸脱氢酶基因(ptxD)成功筛选出异源表达α-淀粉酶的重组菌株。研究简化了基因操作流程,改进了遗传操作工具,开发的绿色安全且低成本的营养依赖型筛选标记,有助于毕赤酵母分泌表达系统的应用和推广。

过敏原肌质钙结合蛋白在毕赤酵母中的表达、优化及免疫反应性研究

目的 利用毕赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)高效表达三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)重要过敏原肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein, SCP),并检验其免疫反应性。方法 根据毕赤酵母的密码子偏好性优化SCP基因并构建重组质粒。将其热激转化至P. pastorisGS115菌株后经遗传霉素(geneticin,G418)筛选获得阳性高拷贝子。最后通过甲醇诱导表达重组SCP并结合免疫印记(western blotting,WB)和间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)验证其免疫反应性。结果 在摇瓶水平下,重组SCP在毕赤酵母中最佳的表达条件为:诱导温度为28℃,甲醇添加量为每24h添加1.0%甲醇,诱导pH为6.0,诱导时间为144 h。在此条件下, SCP(纯度为91.6%)的得率为1.5 mg/100 mL菌液,实现了可溶性高效表达。WB和间接ELISA结果表明,重组SCP具有免疫球蛋白G结合能力。结论 毕赤酵母表达系统可以得到纯度较高且免疫反应性良好的重组SCP。本研究可为SCP的理化研究及过敏原标准物质的应用奠定基础,并有望促进特异性甲壳类过敏原检测的发展。

分子伴侣增强蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及对羊毛鳞片层的作用分析

【目的】通过分子伴侣共表达增强毕赤酵母中异源蛋白酶K的分泌水平,并对其的羊毛无氯剥鳞作用机制进行解析,旨在提高蛋白酶K的表达量并为高效酶法剥鳞技术的应用奠定基础。【方法】利用毕赤酵母表达系统对tprK基因进行异源表达,首次分析了影响蛋白质折叠和质量控制的分子伴侣Ssa1、Erj5、Sil1、Hac1、Kar2、Lhs1和Ydj1分别过表达对TPRK的表达量和酶活力的作用,并对TPRK处理的羊毛纤维效果进行分析。【结果】TPRK在毕赤酵母GS115中表达,其最适反应条件为65℃、pH 9.0,且具有良好的热稳定性和pH稳定性。过表达ssa1、hac1、erj5和sil1基因的重组菌株酶活分别提升了36.8%、20.0%、17.7%和14.8%。5 L发酵罐进行高密度发酵,诱导72 h后,TPRK的酶活达到77471.99 U/mL。在羊毛水解应用中TPRK可水解羊毛鳞片内层使鳞片逐渐剥落,起到剥鳞效果,并且最适水解条件为:TPRK添加量为300 U/mL、反应温度55℃、pH 9.0和反应时间2 h。【结论】过表达分子伴侣Ssa1能够有效提升TPRK的表达量,利用该TPRK处理羊毛纤维,可有效去除羊毛鳞片层,而对羊毛核心皮质层造成的损伤较小。

二苯甲酮(BP-3)对树干毕赤酵母的细胞毒性和毒理

二苯甲酮(BP-3,氧苯酮)是1种常见的紫外线(UV)过滤剂,由于其生态毒理作用越来越受到关注。本研究目的是探索不同浓度的BP-3对树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的毒性影响。将树干毕赤酵母分为溶剂对照组CK(二甲基亚砜DMSO)、CK(无菌水)、0.01、10、20、50、80和100 mg·L^(-1),从酵母细胞密度、细胞形态、细胞死亡率、细胞膜通透性、乙醇发酵、丙二醛(MDA)含量以及细胞抗氧化酶活性及抗氧化剂含量(超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT)进行检测。根据实验结果,揭示了BP-3对树干毕赤酵母的生态毒理效应。结果表明,不同浓度BP-3暴露后,树干毕赤酵母细胞生长受到抑制,死亡率随着暴露时间和BP-3浓度的增加而增加。从抗氧化指标来看,BP-3胁迫后,抗氧化酶活性受到一定影响。BP-3引起酵母细胞内活性氧(ROS)水平的增加,而脂质过氧化是由ROS引起的,ROS增加导致MDA含量增加。同时,为了消除过量ROS,胞内SOD和POD的活性随着BP-3浓度的增加而增加。BP-3具有亲脂性,通过破坏细胞膜进入细胞,导致DNA和蛋白质的泄露,同时也使细胞产乙醇能力下降。扫描电子显微镜(SEM)结果显示,BP-3会导致细胞表面产生皱纹和凹坑,导致细胞变形甚至破裂。这些发现为BP-3在生态环境中的风险评估提供了有价值的数据支撑。

猫球形马拉色菌脂肪酶SMG 1基因的真核表达及重组载体脂肪酶活性分析

【目的】马拉色菌(Malassezia)是引起猫外耳炎的病因之一,具有脂质依赖性,脂肪酶SMG 1基因能调控球形马拉色菌脂肪酶的合成。本研究旨在构建脂肪酶SMG 1基因毕赤酵母表达载体,获得SMG 1基因重组表达产物,并对脂肪酶酶活性进行分析,为后续马拉色菌脂肪酶SMG 1基因功能研究提供依据。【方法】对1例疑似猫马拉色菌性外耳炎病例的致病菌进行真菌分离鉴定,并通过相似性比对确定菌种类型;利用DNAworks软件优化脂肪酶SMG 1基因,构建克隆载体并鉴定;使用毕赤酵母表达系统构建SMG 1基因真核表达载体,并对重组表达载体进行筛选及鉴定;对重组载体脂肪酶活性进行测定。【结果】试验成功从疑似患有马拉色菌性外耳炎的患猫耳道中分离得到1株马拉色菌菌株,鉴定为球形马拉色菌;通过对马拉色菌脂肪酶SMG 1基因密码子的优化,将密码子适应指数(codon adaptation index,CAI)提高至0.95;成功构建脂肪酶SMG 1基因克隆载体,成功构建重组质粒pGAPZαA-SMG1并转入毕赤酵母X33中,诱导表达后使用SDS-PAGE分析,蛋白产物大小为35 ku,脂肪酶酶活性测定为0.023 U/mL;重组脂肪酶SMG1在30℃酶活性最高(0.027 U/mL),与40、45℃组间差异均极显著(P<0.01)。【结论】球形马拉色菌在猫耳道皮肤温度附近有较高的脂肪酶活性,同时脂质促进了马拉色菌的生长;毕赤酵母表达系统可成功表达并分泌重组脂肪酶SMG1。试验结果为后续猫马拉色菌性外耳炎的致病机制研究、脂肪酶抑制剂研制及快速检测技术的开发奠定了基础。

酿酒功能菌的基因组测序及基因功能注释

为挖掘库德毕赤酵母FJZ在清香型白酒酿造过程中的代谢机制,基于Illumina Novaseq和PacBio测序平台对菌株FJZ进行基因组测序,将测序数据在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库进行比对,并通过GO、KOG和KEGG数据库进行基因功能注释。CAZy分析表明:菌株FJZ具有催化酚类化合物转化合成芳香化合物的香草醇氧化酶(VAO)活性,具有羧酸酯酶催化合成和分解乙酸乙酯、乳酸乙酯的能力,具有甘露糖转移酶催化甘露糖转移到底物生成多萜寡糖的前体的能力等。在GO数据库共注释分子功能类别的基因6320个,具有转移烷基或芳基、糖基、酰基等与酯合成相关的转移酶活性。在KEGG的7类功能数据库中共注释基因7815个,其中代谢相关的基因有1406个,萜类和聚酮类物质代谢相关的基因30个。在KOG共注释到基因3704个,辅酶运输和代谢相关的基因83个等。本研究为清香型白酒酿造过程中酶系的研究,以及白酒风味物质形成机理和酒醅功能菌结构探索提供参考依据。

发酵过程优化提高毕赤酵母合成血红素

血红素(heme)是一种卟啉衍生物,是血红蛋白的重要组成部分,在氧气运输以及电子传递链中有着重要作用。该研究以一株具有血红素高生产能力的毕赤酵母(Pichia pastoris)为出发菌株,在5 L发酵罐上,从pH、亚铁离子添加量、温度和溶氧水平等方面进行发酵条件优化,提高其积累血红素的水平。最后,对发酵条件最优的一组结果进行了生长动力学和生产动力学的模拟。结果表明,当控制pH值为4时最有利于血红素的生产积累,每日添加2 mL FeSO_(4)·7H_(2)O溶液(100 mg/L)时即可满足毕赤酵母生产血红素对亚铁离子的需求,血红素产量达到160.1 mg/L。应用毕赤酵母甲醇补料发酵过程常用的降低温度提高蛋白表达水平的策略在甘油补料发酵生产血红素过程并未发挥预期作用,血红素产量反而降低。另外,对比不同溶氧水平发现,提高溶氧对提高血红素的积累效果不明显,但是能有效改善菌体的生长状况。最后,通过动力学模型拟合发现,发酵过程中血红素的积累与细胞生长是耦合的。研究成果为促进发酵法生产血红素的工业化提供了借鉴意义。