PIG/PGAP基因及其相关表型研究进展

人体中150余种蛋白通过糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜上发挥功能,从GPI锚的合成、与蛋白结合到定位于细胞膜上发挥作用,这一系列过程受一大类基因调控,包括PIG基因,如PIGA、PIGB、PIGC等及PGAP基因,如PGAP1、PGAP2等。近年来,国外对PIG/PGAP基因变异所致疾病的报道逐渐增多,但国内罕见报道。现就PIG/PGAP基因相关疾病的遗传方式、临床特点、治疗及基因型-表型相关性的研究进展进行综述。

^(60)Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用^(60)Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义。用^(60)Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化。结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系。5Gy剂量^(60)Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低。PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要。

利用PIG基因枪进行水稻基因转化的研究

我们利用自行安装的ＰＩＧ基因枪瞬时转化水稻悬浮细胞，对其操作参数及转化条件的优化进行了研究。ＰＩＧ基因枪结构简单，操作方便，价格及维持费很低。研究结果表明，在设计参数为轰击持续时间５０ｍｓ及样品室真空度为２９～３０ｉｎ．Ｈｇ时，其它操作参数的优化值为氦气压力６０ＰＳｌ，轰击高度为１７ｃｍ，缓冲网板高度为ｇｃｍ。水稻悬浮细胞在轰击前后分别进行高渗处理（含有０．５Ｍ甘露醇的ＬＳ０．５培养基）４ｈ和１０～１６ｈ可提高转化率４倍以上，在ＤＮＡ吸附过程中，用乙醇进行后处理比用水处理可提高转化率３．８倍。另外，用金粉为ＤＮＡ载体比钨粉效果好，转化量可提高一倍以上。这些结果证实ＰＩＧ基因枪的可靠性及稳定性。这对促进ＰＩＧ基因枪在植物基因工程中的应用有着重要意义。

质子诱导AHH-1细胞PIG3基因的mRNA表达和细胞周期改变研究

本文利用串列加速器加速的21MeV的质子束流对人正常淋巴细胞AHH-1进行辐照,研究了质子诱导AHH-1细胞PIG3基因的mRNA表达量和细胞周期改变的剂量和时间相关性。实时定量聚合酶链式反应(PCR)结果显示,质子辐照后,PIG3基因mRNA的表达量随剂量的增大而增大,表现出很好的剂量相关性。在不同的剂量点下,表达量随时间的变化趋势也大致相似,峰值出现的时间点除8Gy剂量点出现在12h外,其他剂量点均在照后6h达到。理论拟合曲线和实验数据也呈现出很好的一致性。细胞周期检测结果显示,在每个剂量点下,G2/M期细胞随着时间的延长呈现先增加后减少的趋势。以上结果说明PIG3基因mRNA的表达量在生物剂量计的应用上可能具有一定的基础和潜力,值得进一步研究。

逆转录病毒载体介导PIG-A基因在突变型K562细胞中的表达

目的应用逆转录病毒载体将PIG—AeDNA转导至突变型K562细胞中，观察是否能够逆转K562细胞CD59的表达。方法采用PCR方法从质粒pEBPIG—A中扩增PIG-A基因片断，BamHI及XhoI双酶切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1相应位点。脂质体法转染PA317包装细胞，收集病毒上清感染突变型K562细胞，流式细胞仪测定感染前后CD59的表达情况。结果重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后，24～48h荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。C,418筛选后，病毒滴度测定达（1．6±0．2）×10^5CFU／mL。感染K562细胞前后测定CD59的表达率分别为4．5％±O．7％及21-3％±0．3％（R〈0.01）。结论成功构建了PIG—A基因逆转录病毒载体，感染突变型K562细胞后可以提高其CD59的表达。

非洲猪瘟病毒Pig/HLJ/2018分离株MGF多基因家族优势B、T细胞抗原表位分析

运用生物信息学手段对非洲猪瘟病毒中国Pig/HLJ/2018分离株MGF多基因家族的42条编码蛋白进行二级结构、B细胞抗原表位区域、T细胞抗原表位区域分析,筛选出了25条优势B细胞抗原表位序列、20条优势T细胞抗原表位序列,MGF多基因家族在疫苗研发中具有重要的作用,筛选出的优势B、T细胞抗原表位区域为构建非洲猪瘟多表位疫苗提供了基础依据和指向。

PIG7慢病毒表达载体的构建

目的:构建一个含有PIG7基因ORF区的表达载体pPRRL-PIG7-IRES,为研究PIG7基因的功能打下基础。方法:采用RT-PCR方法从经苯丁酸钠处理过的Kasumi-1细胞获得PIG7基因SIMPLE转录本的ORF片段,再用酶切-连接的方法将目的片段亚克隆入慢病毒表达质粒PRRL.SIN.CPPT.PGK/GFP.WPRE。结果:PIG7基因ORF区成功亚克隆入了慢病毒表达质粒PRRL.SIN.CPPT.PGK/GFP.WPRE。结论:成功完成了PIG7慢病毒表达载体的构建,为研究PIG7基因的功能打下了基础。

甜味蛋白Brazzein基因合成及其在酵母中表达的初步研究

采用pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌。按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因,共设计4对引物,采用SOE-PCR法合成Brazzein基因,构建克隆载体pUC57-Bra与酵母表达载体pGAPZαA-Bra。将重组质粒线性化,电转导入Pichia.pastoris SMD1168中,用高浓度的Zeocin筛选高拷贝转化子。将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,进行SDS-PAGE分析。成功构建了分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌,SDS-PAGE表明,目标蛋白的相对分子量与理论值一致,诱导72h后的目的蛋白表达量达0.12g/L。

用毕赤酵母的GAP启动子调控表达L-阿拉伯糖异构酶

应用PCR从大肠杆菌基因组中扩增L-阿拉伯糖异构酶基因,用EcoR I和Not I双酶切将其克隆进P.pastoris表达载体,获得重组表达载体pGAP9K-L-ai。通过电转法将pGAP9K—L-ai转化毕赤酵母GS115,筛选高G418抗性和高表达L-阿拉伯糖异构酶的重组工程菌。用葡萄糖作为碳源在摇瓶中发酵48 h,表达重组L-ai 53 mg/L。用毕赤酵母的GAP启动子调控表达的重组L-ai具有异构D-半乳糖生成D-塔格糖的生物学活性。

60Co γ射线诱导正常人淋巴母细胞PIG3基因mRNA表达的剂量相关性研究

目的 探讨正常人淋巴母细胞AHH1电离辐射作用后PIG3基因mRNA表达变化的剂量-效应规律,建立一种基于基因表达变化的新型辐射生物剂量计的可能性.方法 激光共聚焦检测DNA双链断裂分子标记γ-H2AX集簇点,1、2、4、6、8和10 Gy 60Coγ射线照射AHHI细胞后4、10和24h收集细胞,应用实时荧光定量PCR技术对PIG3基因mRNA表达水平进行相对定量检测.结果 γ射线照射后30 min检测发现PIG3蛋白与γ-H2AX在细胞核内有部分共定位,形成集簇点(foci),表明其参与电离辐射致DNA双链断裂损伤信号识别反应.γ射线诱导PIG3基因mRNA表达水平随时间推移不断提高,持续时间可达24 h.PIG3基因mRNA表达水平具有显著的剂量依赖性,其表达丰度变化的剂量依赖范围在照射后4h为0～6Gy、照射后10和24 h均为0～10 Gy.结论 PIG3基因参与DNA双链断裂损伤信号识别反应,其mRNA的辐射诱导表达具有良好的剂量-效应关系,具有发展成为新的放射生物剂量计的价值.

pig7基因在急性白血病细胞中的表达及其临床意义

目的检测 pig7基因在急性白血病(AL)细胞中的表达水平及其临床意义,在基因甲基化调控方而探讨 pig7基因表达异常的可能机制。方法应用实时定量逆转录 PCR(RT-PCR)方法对138例 AL 患者、21名正常人骨髓标本以及6个白血病细胞株进行了 pig7转录本的检测,并在全反式维甲酸(ATRA)作用下观察 NB4细胞分化效应及 pig7基因表达情况。进行限制性内切酶分析以鉴定白血病细胞中存在的 pig7转录剪接体。通过甲基化特异性 PCR(MSP)检测白血病细胞 pig7基因启动子区域是否存在过度甲基化。结果 AL 进展期(包括初治、复发/难治)患者骨髓细胞 pig7 mRNA 相对表达水平与正常骨髓细胞相比明显降低(RQ 中位数分别为0.62和18.30,P<0.01),其中急性髓系白血病(AML)与急性淋巴细胞白血病(ALL)差异无统计学意义,而初治组与复发/难治组比较 pig7mRNA 水平差异有统计学意义,前者明显高于后者(RQ 中位数分别为1.43和0.16,P<0.05)。pig7低表达患者完全缓解率也较低(P<0.05)。NB4细胞经 ATRA 诱导分化后 pig7表达水平由1.61±0.72增至44.75±3.93(P<0.01)。酶切结果提示白血病细胞中仅存在 SIMPLE 剪接体。在 K562、HL-60及 Nalm-6细胞 pig7启动子区域存在过度甲基化,而 U937、NB4和 kasumi-1细胞中该区域非甲基化状态占优势。结论 pig7基因在 AL 的表达下调为白血病发病机制的探讨和疗效预测提供了新的思路。

关于PNH克隆演变的研究进展

随着阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)发病机制研究的深入,很多学者都发现PNH细胞克隆的演变与疾病进展密切相关,可能是PNH发病的关键环节。与正常造血干/祖细胞相比,PNH缺陷细胞克隆可能存在增殖优势,而且PNH克隆的演变与PNH患者的临床病程有很大的关系。PIG-A基因突变本身并不能赋予PNH缺陷细胞的增殖优势,而免疫和凋亡机制可能参与了PNH克隆的选择。这些认识对PNH克隆演变机制的研究、PNH发病机制的阐明以及为临床提供更有效的诊断和治疗手段具有重要意义。

DeoR家族转录因子PsrB调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素

灵菌红素(prodigiosin,PG),一种由粘质沙雷氏菌产生的次级代谢产物,因其具有抗细菌、抗疟疾、抗肿瘤和免疫抑制等重要功能而备受关注,然而,对黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的调控机制的了解依然有限。作者以黏质沙雷氏菌JNB5-1为出发菌株,通过构建Tn5G转座子插入突变文库,发现并解析了DeoR家族转录调控因子BVG90_04085(PsrB)正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制。结果发现,LB培养基中psrB突变株SK8-61和ΔPsrB产灵菌红素能力仅为出发菌株JNB5-1的0.22倍和0.26倍。RT-qPCR分析菌株JNB5-1及ΔPsrB中pig基因簇的表达水平发现,相比于出发菌株JNB5-1,在psrB缺失突变株ΔPsrB中,灵菌红素合成途径关键基因pigABCDEFGHIJKLMN的表达水平下调了5.81~22.93倍。凝胶阻滞EMSA等实验证实转录因子PsrB可直接与pig基因簇启动子区域结合,表明转录因子PsrB正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制可能为:PsrB与灵菌红素合成基因簇启动子区域直接结合,正向调控pig基因簇的转录水平,进而影响黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。最后,发酵培养基中psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906可合成8.61g/L的灵菌红素,为出发菌株JNB5-1(5.53g/L)的1.56倍。

猪肝酯酶在甲醇酵母中的克隆与表达

猪肝酯酶(Pig Liver Esterase,PLE)是手性合成工业中最常用的三种生物催化剂之一,它的 生化提取物是多种同工酶(α、β和γ亚基)的混合物,而它的单一组分(γ亚基)有很高的手性拆分 活性。为获得重组PLE,从猪肝提取总RNA,经RT-PCR得到γ亚基目的基因,并利用pPIC9K质 粒构建成pPIC9K-PLE表达载体,转化到Pichia pastoris中,转化细胞株摇瓶发酵表达重组PLE达 450mg／L,活性染色证明分子量略低于天然酶。

膀胱癌病理分级与PGAP2基因表达的相关性及分子生物学关系的研究

目的:检测不同病理分级膀胱癌患者组织PGAP2表达水平,并探讨其表达水平与膀胱癌病理分级及分子生物学关系。方法:选取2011年8月—2015年4月于开滦总医院林西医院住院的78例膀胱癌患者肿瘤组织作为肿瘤组,膀胱癌患者均为尿路上皮癌,组织学分级按照WHO分级标准:Ⅰ级24例、Ⅱ级29例、Ⅲ级25例;根据膀胱癌患者肿瘤组织PGAP2 mRNA水平平均值,将患者分为PGAP2高表达组(n=39)和PGAP2低表达组(n=39);根据患者出院后5年内是否出现复发或因膀胱癌死亡,将患者分为预后良好46例和预后不良32例。选取膀胱癌患者相应癌旁正常组织作为正常组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测膀胱癌肿瘤组织及癌旁正常组织PGAP2 mRNA水平;Ualcan数据库检索验证PGAP2在正常膀胱组织及膀胱癌肿瘤组织中的表达;分析肿瘤组织PGAP2 mRNA水平与膀胱癌患者病理分级等临床病理特征的关系;多因素Cox回归分析影响膀胱癌预后的因素。结果:肿瘤组PGAP2 mRNA水平高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05),与Ualcan数据库结果一致;PGAP2高表达组肿瘤多发、组织浸润深度为肌层浸润性膀胱癌、预后不良的患者比例均高于PGAP2低表达组,差异有统计学意义(P<0.05);肿瘤组织PGAP2表达水平与膀胱癌病理组织学分级有关,差异有统计学意义(P<0.05);病理分级、PGAP2是影响膀胱癌预后的独立危险因素(P<0.05)。结论:膀胱癌患者肿瘤组织PGAP2表达水平与病理分级等临床病理特征密切相关,且是影响膀胱癌预后的独立危险因素,可对膀胱癌的病情评价及治疗提供一定理论依据。

PIG7基因与Litaf/Simple蛋白

PIG7基因是与p53诱导凋亡密切相关的基因,与代谢、炎症、肿瘤等关系紧密。该基因可能存在2种不同的转录本——Litaf与Simple,Litaf在LPS诱导TNF-α表达过程中起转录激活作用,Simple可能参与溶酶体介导的细胞内蛋白分选和降解过程。

体内Pig-a基因突变实验评估纳米氧化锌致突变性

【目的】利用体内Pig⁃a基因突变实验方法,检测纳米氧化锌(ZnO NPs)颗粒对大鼠遗传毒性的作用。【方法】结合28 d经口毒性试验,设14、70、350 mg‧kg^(−1) ZnO NPs(纳米尺度分散状态最大浓度)3个剂量组、常规ZnO组(350 mg‧kg^(−1) ZnO)、阳性对照组(40 mg‧kg^(−1) N⁃亚硝基⁃N⁃乙基脲)和溶剂对照组(0 mg‧kg^(−1) ZnO NPs),每组各10只大鼠经口灌胃28 d,记录并观察体重变化。在给药0、15、28 d和恢复观察期28 d取各组大鼠尾静脉血200µL,用APC mouse anti⁃rat erythroid cells及FITC mouse anti⁃rat CD59抗体进行标记后,使用流式细胞仪收集各样本1×10^(6)个红细胞信息,计算其中外周血红细胞CD59缺失突变发生率。【结果】与溶剂对照组比较,在灌胃15 d后,350 mg‧kg^(−1) ZnO NPs组、阳性对照组大鼠外周血红细胞CD59缺失突变发生率均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);在灌胃28 d后,70 mg‧kg^(−1) ZnO NPs组、350 mg‧kg^(−1) ZnO NPs组和阳性对照组大鼠红细胞CD59缺失突变发生率均升高,且呈时⁃效和量⁃效关系;在停止灌胃28 d后,除阳性对照组外,其余各组大鼠外周血红细胞CD59缺失发生率与溶剂对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。【结论】70、350 mg‧kg^(−1) ZnO NPs会提高大鼠外周血Pig⁃a基因突变率。

猪ADSL基因克隆及其在部分组织中的mRNA定量表达

试验以通城猪为研究对象,在对猪ADSL基因全长编码区cDNA片段进行克隆、序列测定、与GenBank中已收录的其他14种动物的ADSL全长编码区序列进行同源性分析,并构建系统发生树的基础上,采用实时(相对)定量PCR方法对刚出生和65日龄两个不同生长发育时期的通城猪心、肝、肾脏、背最长肌4种组织的ADSL基因表达谱进行分析。结果表明,所克隆的ADSL基因片段大小为1 548 bp(GenBank登录号:GU249574),其中包含一长为1 455 bp的完整阅读框,通过核酸序列分析发现,该基因编码484个氨基酸;与GenBank中已收录的猪ADSL基因序列同源性最高,达99.9%;与恒河猴和黑猩猩的序列同源性最低,分别为66.3%和41.3%;15种动物的20条ADSL全长CDS序列聚类分布为两个主支。刚出生时的通城猪ADSL基因在心、肝、肾脏组织的mRNA表达水平均高于65日龄通城猪的心、肝、肾脏组织中的mRNA表达;然而,其背最长肌的ADSL基因mRNA表达水平则低于65日龄的通城猪。本结果为猪ADSL基因的生物学功能研究和遗传进化研究提供了分子依据。

用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达漆酶

目的:用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达漆酶。方法:用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增漆酶基因lac2。用NotⅠ和EcoRⅠ双酶切将lac2基因重组于表达载体PGAP9K。通过电转法将其转化于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性以及高表达Lac2酶的重组子作为工程菌Gs115(pGAP9k-lac2)。用甘油作为碳源在50L生物反应器中表达重组漆酶Lac2。用ABTS法测定发酵液中的漆酶活力。结果:在发酵30h时,其Lac2酶的表达达峰值,其活性为136.67U/L。其峰值的Lac2酶的表达量为50mg/L。表达产物具有分解ABTs的活性。结论:成功克隆了漆酶基因lac2,并首次实现用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达漆酶,为用P.Pastoris规模化生产漆酶奠定了基础。

三种酵母启动子在毕赤酵母中的功能比较

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,启动子功能的强弱对于目的基因的表达非常重要。为找到一个启动转录功能较好的启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,在毕赤酵母中研究不同启动子对外源蛋白表达的影响。首先采用PCR扩增的方法克隆了酿酒酵母甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子pScgpd,借助于载体pPIC9K和pGAPZB,构建pPIC9K-gfp和pPIC9K-PG,pGAPZB-gfp和pGPDZB-gfp,将重组载体分别转入毕赤酵母GS115和毕赤酵母X33中,在不同渗透压条件下培养重组菌,通过GFP的表达情况比较启动子pScgpd与甲醇氧化酶启动子pAOX1、3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子pGAP的功能。荧光显微镜观察结果显示,pScgpd表现为受高渗条件诱导,重组毕赤酵母P.pastoris GS115和P.pastoris X33均能产生稳定的荧光,且在一定范围内随着葡萄糖或NaCl浓度的增加,GFP表达强度也有所增加;但分别与对应宿主P.pastorisGS115、P.pastoris X33的启动子pAOX1和启动子pGAP相比,表达水平仍较弱。