体内Pig-a基因突变试验高通量方法联合验证研究

目的:建立大鼠磷脂酰肌醇聚糖A类(Pig-a)基因突变试验高通量方法,验证该方法的重复性,并探索将此方法与流式体内微核整合至同一个试验中的可能性。方法:将20只雄性SD大鼠按照体质量随机分为4组:溶剂对照组(PBS,pH=6.0)、N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)低剂量组(10 mg/kg)、ENU中剂量组(20 mg/kg)和ENU高剂量组(40 mg/kg),给药容量均为10mL/kg,经口灌胃给药,每天1次,连续给药3 d。分别于给药前1天、首次给药后第14和30天颈静脉取血,进行Pig-a基因突变分析;首次给药后第4天颈静脉取血,采用流式细胞仪进行微核检测。结果:在首次给药后第14和30天,3种剂量(10、20和40CD59-CD59-mg/kg)下的ENU均导致大鼠外周血RBC和RET频率显著增加(P<0.05),Pig-a基因突变结果与之前的基础型试验得到的结果类似,分析速率和分析细胞的数目得到显著提升;3个剂量的ENU均导致明显的微核率升高,与对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究成功建立了大鼠体内Pig-a基因突变高通量试验方法,该试验具有较好的重复性,并提示该试验可以和微核试验结合到同一个试验中。

免疫磁珠分离技术联合流式细胞术检测ENU致大鼠体内Pig-a基因突变

目的结合免疫磁珠分离技术和流式细胞术两种方法,对大鼠外周血突变型红细胞进行富集和检测,优化大鼠外周血Pig-a基因突变试验方法。方法用20、40和80 mg/(kg·bw)剂量的N-乙基-N-亚硝基脲(Nethyl-N-nitrosourea,ENU)连续3 d给予SD大鼠,在染毒前、染毒后第7、14和28天分别采集大鼠外周血,经免疫磁性分离柱富集RET^(CD59-)和RBC^(CD59-),用流式细胞术分别对免疫磁珠分离柱前和柱后的外周血红细胞进行计数。结果与对照组相比,ENU各剂量组的RET^(CD59-)和RBC^(CD59-)发生率均显著升高(P<0.05);采用免疫磁珠分离技术后,可以在3 min内完成一个样品的Pig-a基因突变检测,分析的RET^(CD59-)或RBC^(CD59-)细胞数量分别最高可达2×10~4个或9×10~4个。结论本研究联合运用免疫磁珠分离术和流式细胞术,建立并优化了大鼠体内Pig-a基因突变试验方法,实现了高通量检测,提高了试验的准确性和效率。

Pig-a基因突变试验研究进展

建立灵敏可靠的遗传毒性试验方法是全面充分评价化学物质致突变性的必要保障。近年来,一种基于Pig-a基因的新型基因突变试验成为研究热点,该方法具有灵敏度高,成本低,与其他遗传毒性试验整合潜力高,减少动物使用等优点,有望成为未来评估体内基因突变的新方法。本文就Pig-a基因突变试验的研究与应用进展进行综述。

大鼠和小鼠Pig-a基因突变试验历史背景数据采集

目的介绍大鼠及小鼠Pig-a基因突变试验方法,并汇总国家药物安全评价监测中心2015—2022年开展的基于免疫磁珠检测法的大鼠及小鼠Pig-a基因突变试验背景数据。方法阴性物质包括超纯水和0.5%羧甲基纤维素钠(CMCNa),雄性C57BL/6J小鼠间隔24 h ig 0.5%CMC-Na,连续7 d;雄性SD大鼠间隔24 h ig 0.5%CMC-Na,连续14 d;大鼠间隔24 h ig超纯水,连续3 d。阳性对照为已知致细菌突变化合物,包括N-乙基-N-亚硝基脲(ENU,10、40 mg·kg^(−1))、盐酸丙卡巴肼(PCZ,60、150 mg·kg^(−1))、乌拉坦(EC,300、800 mg·kg^(−1))、N-亚硝基二甲胺(NDMA,1.5 mg·kg^(−1))、N-亚硝基二乙胺(NDEA,15 mg·kg^(−1))。小鼠间隔24 h ig ENU 40 mg·kg^(−1),连续3 d;间隔24 h ig NDMA 1.5 mg·kg^(−1)、NDEA 15 mg·kg^(−1),连续7 d。大鼠间隔24 h ig PCZ 150 mg·kg^(−1)、EC 800 mg·kg^(−1)、ENU 40 mg·kg^(−1),连续3 d;间隔24 h ig PCZ 60 mg·kg^(−1)、EC 300 mg·kg^(−1)、ENU 10 mg·kg^(−1),连续28 d。分别于给予受试物前,首次给予后14、28 d采集外周血,用流式细胞术检测大鼠红细胞表面CD59蛋白的结合情况,结合免疫磁性计数微球技术计算网织红细胞(RETs)占总红细胞的百分率(%RET)(作为外周血毒性考察指标)、总红细胞中CD59表达为阴性细胞(RBC^(CD59−),即突变的总红细胞)发生率和RETs中CD59表达为阴性细胞(RET^(CD59-),即突变的RETs)发生率。结果各试验%RET数值均无大幅增加。SD大鼠和C57BL/6J小鼠的阴性对照组RBC^(CD59-)和RET^(CD59-)突变率均低于5×10^(−6),小鼠的背景值相对不稳定。连续3 d ig给予小鼠40 mg·kg^(−1)的ENU,RBC^(CD59−)和RET^(CD59−)发生率自给药后2周开始均大幅增加(P<0.05),给药后4周进一步增加(P<0.01、0.001);给予小鼠NDMA后2、4周,RBC^(CD59−)发生率略有增加,但仍在阴性背景范围内,但RET^(CD59−)发生率在给药后第2周大幅增加(P<0.001),给药后第4周则大幅回落;给予小鼠NDEA后2周,RBC^(CD59−)和RET^(CD59−)发生率均有所增加(P<0.05、0.001),给药后第4周则有所降低。连续3 d ig给予大鼠40 mg·kg^(−1)ENU,或连续28 d ig给予大鼠10 mg·kg^(−1)ENU,RBC^(CD59−)、RET^(CD59−)发生率自给药后第2周开始均大幅增加(P<0.001),给药后第4周进一步增加(P<0.001);连续3、28 d ig给予大鼠不同剂量的PCZ或EC后,RBC^(CD59−)和RET^(CD59−)发生率的变化趋势与ENU类似,但EC诱发的突变细胞率低于ENU和PCZ。结论体内Pig-a基因突变试验可在首次给药后4周内有效检出致细菌突变化合物ENU、PCZ、EC、NDMA、NDEA的致突变性。提供了大鼠和小鼠Pig-a基因突变试验的背景值范围,为标准化试验方法的建立和研究结果的判定提供借鉴。

大鼠体内Pig-a基因突变试验的优化及ENU时-效关系和量-效关系评估

目的对大鼠Pig-a基因突变试验方法进行优化,并初步探讨阳性诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)在该实验中的时-效关系和量-效关系。方法 30只雄性SD大鼠随机平均分为5组,即溶剂对照组,ENU10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg 4个剂量组,连续3d经口灌胃染毒。分别于实验第0、15、30、45、60、75、90天尾静脉取血,分离红细胞,经Anti-CD59-APC和SYTO 13核酸染料标记后采用流式细胞仪分析CD59表型突变为成熟红细胞(RBCCD59-)率、CD59表型突变为网织红细胞(RETCD59-)率以及RET占总红细胞百分率。结果 ENU各组大鼠在染毒后第15~90天的RBCCD59-率呈现随时间和剂量反应性地增高。RETCD59-率随时间延长,ENU各组表现为先增后基本稳定伴小幅波动趋势,但均保持在较高水平,在染毒后30d出现最高峰,在45d时出现下降;同时,随着ENU剂量的增加,ENU各组RETCD59-率也随之增加。随时间延长,ENU各组大鼠RET百分率有所下降,30d后呈现较为稳定的轻微波动,5组间RET%在各时间点处差异均无统计学意义。结论本研究改良的大鼠Pig-a基因突变试验可进行快速检测,ENU短期(3d)染毒诱导大鼠红细胞Pig-a基因突变具有时-效关系和量-效关系。

使用体内Pig-a基因突变试验组合体系评估丙烯酸-2-乙基己酯的遗传毒性

目的使用体内Pig-a基因突变试验组合体系进一步评估丙烯酸-2-乙基己酯(2-ethylhexyl acrylate,2-EHA)在体内的遗传毒性。方法使用28日重复剂量染毒,联合Pig-a基因突变试验、彗星试验和微核试验检测2-EHA的遗传毒性。30只SPF级雄性SD大鼠随机分为6组,即溶剂对照组(植物油),阳性对照组(N-乙基-N-亚硝基脲10 mg/kg)和2-EHA 100、200、400、800 mg/kg剂量组。连续灌胃28 d,于实验第0、15和29 d取尾静脉血,使用流式细胞术测定突变成熟红细胞和网织红细胞数。末次灌胃6 h后取尾静脉血进行外周血彗星试验,随后处死动物进行骨髓红细胞微核试验。结果实验后期,400 mg/kg和800 mg/kg 2-EHA组大鼠出现轻微中毒体征(束毛,精神萎靡)。Pig-a基因突变试验结果显示,各时间点4个剂量组成熟红细胞和网织红细胞突变细胞数均未见显著增加。彗星试验结果显示,各组间彗星尾长和Olive尾矩差异无统计学意义。微核试验结果显示,各组微核率差异无统计学意义。结论在该研究条件下,2-EHA在体内Pig-a基因突变试验、彗星试验和微核试验结果均为阴性,2-EHA可能不具有致突变性。

大鼠体内Pig-a基因突变试验设计及统计学分析方法建议

目的对Pig-a基因突变试验设计和统计学分析方法提出建议。方法使用本实验室阴性对照历史数据128例,使用描述统计学获得数据分布特征。在此基础上对不同条件(检测细胞数目、每组动物数量、试验组数)进行模拟试验,提出可达到理想统计学功效的试验设计建议和统计学分析方法。结果阴性样本突变成熟红细胞(RBCs^(CD59-))和突变网织红细胞(RETs^(CD59-))均数为26.63×10^(-6)、35.85×10^(-6),标准差为27.71×10^(-6)、31.06×10^(-6)。频率分布图显示RBCs^(CD59-)和RETs^(CD59-)呈偏态分布,经对数转换后呈正态分布。在精度为2个标准差时,每样本1×10~6个RBCs和0.3×10~6个RETs的总体均数置信度分别为100%和92%;若RETs的检测数量扩大至1×10~6时,置信度可达100%。当检测最小差异为2倍时,使用每组5只动物的统计学功效均较低;当检测最小差异为4倍或5倍时功效为>80%。结论本实验室对Pig-a基因突变时试验设计建议如下:①建议将数据进行log(10)转化后可进行参数检验,如方差分析。②建议选用年轻成年动物进行试验,大鼠约为6周龄。③进行流式细胞术检测时建议获取细胞量为:RETs>1×10~6,RBCs>5×10~7。④检测差异为4倍以上时,使用3个剂量组和1个阴性对照组可获得理想的统计学功效。⑤在剂量组为4组时(包括对照组),每组5只动物可基本满足试验要求,但为获得更良好的结果推荐使用的动物数量为每组6只或7只。

基于L5178Y细胞的Pig-a基因突变试验方法学研究

目的:采用不同作用机制化合物研究基于L5178Y细胞体外Pig-a基因突变试验方法。方法:使用不同浓度范围的马兜铃酸I(aristolochic acid I,AAI)、N-亚硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine,NDEA)、甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)、秋水仙素(colchicine,COL)、丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)、糖精、乙烯利、苯并芘[benzoa pyrene,B(a)P]和4-硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline N-oxide,4-NQO)共10种化合物,分别与L5178Y细胞作用一段时间后表达8 d,细胞经APC抗CD45与PE抗CD90.2抗体孵育后使用流式细胞术收集100万个细胞并识别表型为CD90-/CD45^(+)突变细胞,并计算突变率。结果:致突变剂AAI、NDEA、MMS、MMC、B(a)P、4-NQO分别在无或有代谢活化条件下导致L5178Y细胞Pig-a基因突变率显著性升高,而需代谢活化的致突变剂CP、整倍体诱变剂COL、非遗传毒性致癌物乙烯利和糖精的试验结果为阴性。结论:基于L5178Y细胞的体外Pig-a基因突变检测方法可在无及有代谢活化条件下有效检出致突变剂,特异性和可靠性较高,在药物基因突变风险评价及机制研究领域具有不可或缺的价值。

大鼠体内Pig-a基因突变试验影响因素研究

目的为进一步完善和推广应用Pig-a基因突变试验,本研究拟在本实验室建立的试验方法基础上,对影响试验结果稳定性的3种主要影响因素进行探讨。方法15只雄性SD大鼠按照体重随机分为3组:溶媒对照组(PBS,pH=6.0)、N-乙基-N-亚硝基脲(N-Ethyl-N-nitrosourea,ENU)20和80 mg/kg·bw剂量组。连续经口灌胃3 d,于暴露后28 d取血。按照本实验室已建立的流式细胞术Pig-a基因突变试验双染(CD59-APC/SYTO 13)或三染(CD59-APC/CD61-PE/SYTO 13)方案,针对网织红细胞突变频率(RET^CD59-)、成熟红细胞突变频率(RBC^CD59-)和网织红细胞比例3项指标,分别进行多项影响因素检测:样本贮存液和贮存时间[肝素钠抗凝剂和血液保存液-1(枸橼酸-磷酸-葡萄糖-腺嘌呤,citrate phosphate dextrose adenine-1,CPDA-1),0~6 d]、样本染色前贮存时间(0~24 h)和样本染色后固定和贮存时间(1%多聚甲醛,0~24 h)。结果使用双染方案时,4℃避光保存条件下,CPDA-1保存6 d内RBC^CD59-、RET^CD59-和RET比例指标均未见明显影响(P>0.05);而肝素钠溶液第3天即可观察到RETCD59-明显升高,与第0天相比差异具有统计学意义(P<0.05)。肝素钠溶液4℃避光保存24 h时使用三染方案检测,3项指标与第0 h相比差异无统计学意义(P>0.05);而6 h时使用双染方案检测可观察到与第0 h相比,RET^CD59-差异具有统计学意义(P<0.05)。双染方案染色后,未固定样本高剂量组在第12 h与第0 h相比,RET^CD59-差异具有统计学意义(P<0.05),RET比例在第6 h明显降低(P<0.05),但经1%多聚甲醛固定后导致RET^CD59-和RET比例降低幅度更为明显(P<0.05)。结论使用CPDA-1保存血液样本时(避光4℃),可使样本保存时间延长至6 d(双染方案)。使用肝素钠溶液保存血液样本时(避光4℃),双染方案检测时间需在6 h内,而三染方案检测时间可延长至24 h。1%多聚甲醛固定可能不适用于Pig-a基因突变试验。

茜素型蒽醌化合物体外Pig-a基因突变性试验研究

目的对具有相同母核结构的7种茜素型蒽醌化合物开展体外Pig-a基因突变试验,分析不同茜素型蒽醌化合物取代基结构与其致突变性的关联。方法小鼠淋巴瘤细胞L5178Y(tk+/--3.7.2.C)分别与系列浓度的茜草素、异茜草素、甲基异茜草素、羟基茜草素、甲基异茜草素-1-甲醚、茜草素-1-甲醚和光泽汀作用4 h(有S9)或24 h(无S9),给药24 h后应用细胞计数仪进行计数,计算细胞相对倍增速率(RPD)评价受试物细胞毒性;细胞培养8 d后经APC-anti-CD45和PE-anti-CD90.2抗体孵育后,使用流式细胞仪检测细胞突变(CD45+CD90.2−)率。结果所有受试物在有或无代谢活化条件下所设浓度组RPD均大于50%,未见明显细胞毒性作用,可排除试验中假阳性结果。在无S9代谢活化条件下,光泽汀(16μg·mL^(−1))组、羟基茜草素(10μg·mL^(−1))组、甲基异茜草素-1-甲醚(31.25μg·mL^(−1))组Pig-a基因突变率与溶媒对照组比较显著升高(P<0.05、0.01、0.001);在有S9代谢活化条件下,光泽汀(4、8μg·mL^(−1))、羟基茜草素(10μg·mL^(−1))、茜草素-1-甲醚(3.75、15.00μg·mL^(−1))、甲基异茜草素(12.5、25.0、50.0、100.0μg·mL^(−1))、甲基异茜草素-1-甲醚(15、30、60μg·mL^(−1))、异茜草素(2.50、5.00μg·mL^(−1))组Pig-a基因突变率与溶媒对照组比较显著升高(P<0.05、0.01、0.001)。结论羟基取代基所在位点是茜素型蒽醌化合物致突变性强弱的决定性因素,其体内致突变性有待进一步确证。

基于体外Pig-a基因突变试验的大黄素型蒽醌致突变风险评价

目的对相同母核结构的8种大黄素型蒽醌类化合物开展体外Pig-a基因突变试验,分析不同大黄素型蒽醌结构与致突变性的关联。方法L1578Y细胞分别与系列浓度的大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸、羟基大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷作用4 h(有S9)或24 h(无S9),给药24 h后应用细胞计数板进行计数,计算细胞相对倍增速率(RPD)评价受试物细胞毒性;细胞表达8 d后经APC-anti-CD45和PE-anti-CD90.2标定后,使用流式细胞仪检测突变细胞(CD45+CD90-)发生率。结果所有受试物在有或无S9代谢活化条件下所设浓度组RPD均大于50%,未见明显细胞毒性作用,可排除试验中假阳性结果。在非S9代谢活化条件下芦荟大黄素25μg·mL^(−1)组Pig-a基因突变率与溶媒对照组比较显著升高(P<0.001);S9代谢活化条件下,与溶剂对照组比较,大黄素50μg·mL^(−1)组,羟基大黄素6.25、12.5、25μg·mL^(−1)组,大黄酚25、50、100μg·mL^(−1)组和大黄酸12.5、25、50μg·mL^(−1)组Pig-a基因突变率显著升高(P<0.05、0.01、0.001)。结论羟基取代基的多寡及所在位点是蒽醌类化合物致突变性强弱的决定性因素,其体内致突变性及致癌性作用仍需进行大量体内研究证实。

大黄素型单蒽酮基因突变风险评价

目的为评价大黄素型单蒽酮潜在遗传毒性致基因突变,分别开展miniAmes试验和体外Pig-a基因突变试验进行研究。方法 miniAmes试验:分别设置对照组(DMSO),单蒽酮(0.6、1.1、2.3、4.5、9μg/皿),阳性剂组,使用鼠伤寒沙门氏菌TA 97、TA 98、TA 100、TA 102、TA 1535、TA 1537和大肠杆菌WP2 uvrA分别在-S9和S9两种代谢状态下开展基于6孔板培养的细菌回复突变试验,48 h后计数突变菌落数。体外Pig-a基因突变试验:以L5178Y细胞为体系,非S9代谢条件:分别设对照组(1%DMSO),阳性剂(EMS 500μg/mL),单蒽酮(0.2μg/mL,0.39μg/mL,0.78μg/mL,1.56μg/mL),受试物处理4 h后计数,去除受试物更换培养,24 h后计数,表达8 d,表达期维持细胞密度在1×106~2×106个/mL,表达结束后进行抗体孵育流式检测。S9代谢条件:分别设对照组(1%DMSO),阳性剂(B(a)P 5μg/mL),单蒽酮(0.2μg/mL,0.39μg/mL,0.78μg/mL,1.56μg/mL),受试物处理4 h后,去除受试物更换培养,24 h后计数,表达8 d,表达期维持细胞密度在1×106~2×106个/mL,表达结束后进行抗体孵育流式检测。结果 Ames试验结果:非S9代谢活化条件下,单蒽酮可诱导TA97、TA1537回复突变菌落数与阴性对照组相比有所增加;S9代谢活化条件下,可诱导TA1537回复突变菌落数与阴性对照组相比有所增加。增加倍数超过阴性对照组的2~3倍,且上述结果均存在一定剂量相关变化趋势。体外Pig-a基因突变结果:非S9代谢活化条件下,单蒽酮浓度大于0.78μg/mL,Pig-a基因突变频率与溶媒对照组相比存在显著性差异(P <0.01),且存在剂量相关性。结论本研究条件下,大黄素型单蒽酮存在基因突变风险。

遗传毒性基因突变评价方法的研究进展

基因突变是癌症发生与发展的重要物质基础,也是遗传毒性评价重要的检测终点之一.随着新型药物的涌现以及对药物评价试验要求的不断提高,传统的试验体系也历经了一系列优化.然而,不同的致突变新检测方法对不同检测品种的适用性及其优势和局限不尽相同.本文根据2018年国家食品药品监督管理总局颁布的《药物遗传毒性研究技术指导原则》,就临床前安全性评价领域常用的致突变性检测方法及研究进展进行总结,以期为相关科研及安全评价工作者提供有益借鉴.

N-亚硝基布美他尼SD大鼠体内致突变性风险研究

目的评价布美他尼杂质N-亚硝基布美他尼的体内致突变风险和肝细胞DNA损伤风险。方法SD大鼠随机分为6组,分别为:溶媒对照组(溶媒为0.5%羧甲基纤维素钠),N-亚硝胺布美他尼100、300、1000 mg·kg^(-1)剂量组,阳性对照组1[N-乙基-N-亚硝基脲(ENU),40 mg·kg^(-1)]、阳性对照组2[甲磺酸乙酯(EMS),200 mg·kg^(-1)]。2个阳性对照组均为每组6只动物,其余每组12只动物。大鼠连续14 d经口灌胃给予受试物N-亚硝胺布美他尼。首次给药后约14 d和约28 d后采集外周血用于Pig-a基因突变率检测,末次给药后约3 h取肝细胞开展彗星试验。结果试验期间给予N-亚硝基布美他尼未导致异常临床症状和动物体重及摄食量改变。100、300、1000 mg·kg^(-1)剂量组动物肝细胞平均tail%DNA值(平均数/中位数)分别为2.90±0.38/2.34±0.46、3.58±0.27/2.87±0.51、3.45±0.59/2.21±1.44,与溶媒对照组相应数值相比未见差异,且无明显剂量效应相关性。首次给药后14 d,100、300、1000 mg·kg^(-1)剂量组动物平均RBC^(CD59-)和RET^(CD59-)百万分之发生率(RBC^(CD59-)百万分之发生率/RET^(CD59-)百万分之发生率)分别为2.9±1.6/1.2±0.8、2.8±2.4/1.3±1.5、2.4±1.0/1.3±1.5;首次给药后28 d,100、300、1000 mg·kg^(-1)剂量组动物RBC^(CD59-)百万分之发生率/RET^(CD59-)百万分之发生率分别为5.1±1.5/2.2±0.6、4.3±1.5/3.5±3.6、4.8±2.4/2.5±2.7。上述数值与相同时间点溶媒对照组相比均未见差异,且经统计学分析未见剂量效应相关性。结论连续经口给予N-亚硝基布美他尼14 d,SD大鼠的最大耐受量高于1000 mg·kg^(-1),未检出外周血基因突变风险和肝细胞DNA损伤风险。研究数据可为药品中遗传毒性杂质的合理监管和含N-亚硝基杂质药物的安全使用提供数据支持。

职业照射对心血管介入工作者遗传学损伤的初步探索

目的探索可以用于评价心血管介入工作者遗传学损伤的实验室方法,为更好地进行介入职业防护提供依据。方法纳入上海交通大学医学院附属同仁医院心血管介入工作者14例,非介入工作者14例。收集受试者的基本信息和基础临床资料,进行血常规检测,采集肝素抗凝全血进行外周血淋巴细胞胞质分裂阻滞微核试验和外周血红细胞PIG-A基因突变试验。采用多因素泊松回归分析和多因素线性回归来分析介入相关工作人员的遗传学损伤是否与介入辐射相关。结果心血管介入组外周血淋巴细胞的微核率(3.64‰±1.57‰)和核芽率(0.71‰±0.67‰)显著高于非介入组[微核率(2.61‰±1.56‰),RR=1.80,95%CI:(1.11,2.91),P=0.02;核芽率(0.32‰±0.46‰),RR=3.71,95%CI:(1.13,12.22),P=0.03];介入组的核质桥率(0.11‰±0.29‰)和非介入组(0.21‰±0.38‰)之间的差异无统计学意义。PIG-A基因突变试验结果显示,介入组PIG-A基因突变率[(8.36±8.80)×10^(-6)]显著高于非介入组[(5.71±3.25)×10^(-6)][RR=2.36,95%CI:(1.48,3.78),P<0.001]。结论在本实验条件下,心血管介入工作人员遗传性损伤高于非介入人员,为进一步研究职业照射对相关医务工作者是否存在遗传学影响提供基础数据及参考。

药物杂质遗传毒性评价策略与监管研究

伴随大量创新及仿制药面世而来的是对遗传毒性杂质加强监管的迫切需求。一系列与国际接轨的指南性文件的出台,弥补了我国杂质监管的空白,但难点尚存。传统评价方法具有局限性,新方法与传统方法间缺乏一致性比较,药物特定合成路线实际产生的大量含警示结构杂质缺乏毒理学评价数据支持,毒性预测软件的预测效力不足等。本文就国内外杂质遗传毒性杂质监管科学现状、遗传毒性杂质控制策略、杂质遗传毒性评价方法进行论述,并提出充分结合计算机毒理学、毒性评价方法和符合我国国情的监管限度制定三个维度开展杂质监管工作。

流式细胞术在遗传毒性评价中的应用

遗传毒性是药物临床前安全性评价的重要组成部分,随着新型化合物数量的不断增加,建立高通量筛选方法以评价遗传毒性风险是当前药物研发人员的迫切需求。流式细胞术是一种能在短时间内对细胞进行多参数检测和分选的技术,具有自动化、高通量、特异性强等特点,目前已被应用于多种遗传毒性评价方法中。本文综述了流式细胞术在遗传毒性研究中的应用,并对其在遗传毒性评价上的应用前景进行探讨。

纳米银颗粒及纳米二氧化钛颗粒的体外遗传毒性研究

纳米物质以其独特的物理性质广泛用于化妆品、医药和食品工业,但它们的安全性和遗传毒性仍然存在争议。本研究拟采用基于人成淋巴TK6细胞的体外彗星实验整合体外PIG-A基因突变实验对纳米银颗粒(AgNPs)和纳米二氧化钛颗粒(TiO2NPs)的致DNA断裂作用和致突变性进行初步研究。本研究探究了最高至200μmol/L浓度时,TK6细胞暴露于两种纳米物质4 h时的彗星实验和经过暴露24 h以及10 d基因突变表达期后的PIG-A基因突变结果。同时,本研究还检测了TK6细胞暴露于纳米颗粒4 h及24 h对纳米物质的摄取能力。在纳米物质摄取实验中,随着纳米物质浓度的升高,TK6细胞在流式细胞仪检测图中的侧向散射角(side scatter,SSC)呈现浓度与时间依赖性升高,表明TK6细胞可摄取两种纳米颗粒。在4 h彗星实验中,AgNPs可导致彗星尾DNA荧光%强度呈现浓度依赖性显著升高,为阳性结果。而TiO2NPs则不能诱导彗星尾DNA荧光%强度呈现浓度依赖性显著升高,但最高浓度组尾DNA荧光%超过本实验室阴性历史对照数据,为可疑结果。而在体外PIG-A基因突变实验结果中,AgNPs和TiO2NPs均不能诱导TK6细胞的PIG-A基因突变率出现阳性升高。AgNPs可导致TK6细胞出现DNA损伤,但不能诱导PIG-A基因突变率升高。TiO2NPs既不能诱导TK6细胞出现DNA损伤,也不能诱导PIG-A基因突变率升高,TiO2NPs的遗传毒性有待进一步验证。

N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺的小鼠重复给药毒性及遗传毒性研究

目的 连续7 d重复给予C57BL/6J小鼠N-亚硝基二甲胺(NDMA)和N-亚硝基二乙胺(NDEA),观察至首次给药后28 d,评价两者主要毒性靶器官及遗传毒性风险。方法 分设溶媒对照组(0.5%羧甲基纤维素钠),受试物组(分别给予0.75、1.50、3.00 mg·kg^(-1)NDMA或3.25、7.50、15.00 mg·kg^(-1)NDEA)和阳性对照组(200 mg·kg^(-1)甲磺酸乙酯、40 mg·kg^(-1)N-乙基-N-亚硝基脲)。溶媒对照组和受试物组连续7 d每天ig给药1次,阳性对照组连续3 d每天ig给药1次。末次给药后开展小鼠肝、肾和外周血彗星试验,计算每只动物的肝、肾和血细胞尾DNA百分含量(%Tail DNA)和尾距(tail moment)平均值。观察结束后(D28)开展小鼠磷脂酰肌醇聚糖A类(Pig-a)基因突变试验,计算网织红细胞(RETCD24-)和总红细胞(RBCCD24-)的突变率。并在末次给药和恢复期结束后,试剂盒法检测小鼠肝、肾和肺的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测DNA损伤基因(ATM、gH2AX、Nbn、Prkdc、Trp)和肝药酶基因(CYP2E1、CYP2A6)。结果 NDMA剂量为3 mg·kg^(-1)时,动物全部死亡,自连续给药4 d后,NDEA 15 mg·kg^(-1)组小鼠体质量与溶媒对照组相比显著性降低(P<0.001);且NDMA和NDEA组与溶媒对照组在脏器系数、血液生化指标、组织病理学等方面存在显著差异(P<0.05、0.01、0.001),提示NDMA和NDEA对肝脏和肾脏存在一定毒性;NDMA和NDEA组小鼠肝、肾彗星试验结果均为阳性,Pig-a基因突变试验中NDEA高剂量组RETCD24-结果为阳性;与溶媒对照组比较,NDMA和NDEA组小鼠肝、肾和肺中8-OHdG含量显著升高(P<0.05、0.001),DNA损伤和肝药酶基因表达也存在显著差异(P<0.05、0.001)。结论 NDMA分别在1.5 mg·kg^(-1)剂量条件下产生肝脏毒性,0.75、1.50 mg·kg^(-1)剂量条件下使小鼠肝、肾细胞产生致突变性和肝、肾DNA损伤;NDEA可在15 mg·kg^(-1)剂量条件下产生肝脏毒性,并导致肝、肾细胞产生致突变性和DNA损伤;8-OHdG和DNA损伤基因等指标检测结果与NDMA和NDEA遗传毒性结果具有一定关联性。

染料溶剂红207的体外致突变风险评价

目的使用基于鼠伤寒沙门氏菌的Ames波动试验和小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)的体外Pig-a基因突变试验评价新型染料溶剂红207的碱基突变风险。方法不同质量浓度的溶剂红207(0.625~10.000μg/mL)分别与TA98和TA100混合于96孔培养板,在37℃条件下作用72 h后判断其对突变菌落数的影响。在优化后的体外L5178Y细胞Pig-a基因突变实验中,溶剂红207(2.5~20.0μg/mL)分别与L5178Y细胞在有或无S9代谢活化条件下作用24 h或4 h,于给药后第8天评价其是否可诱导哺乳动物细胞Pig-a基因的突变频率增加。结果无和有S9代谢活化条件下,溶剂红207可导致TA98和TA100回复性突变孔数显著增加(P<0.05、0.01、0.001),且存在浓度效应相关性,代谢活化后增加更为明显。在非S9代谢活化条件下,溶剂红207各浓度组Pig-a基因突变率与阴性对照组比较无显著性差异;在S9代谢活化条件下,溶剂红207质量浓度范围为2.5~20μg/mL时,可导致Pig-a基因突变率显著增加(P<0.01、0.001),且存在浓度效应关系。结论首次使用体外高通量试验方法评价溶剂红207的致突变风险,发现其存在体外致突变性且经I相代谢活化后致突变性进一步增强。