PIG11蛋白在人体正常组织及其相应肿瘤组织中表达的研究

目的检测PIG11(p53-induced gene 11)蛋白在人体正常组织及其相应肿瘤组织中的表达情况,探讨PIG11蛋白在人体正常组织的分布特点,及在肿瘤发生发展中所起的作用。方法利用免疫组化SP法检测PIG11蛋白在319例人体正常组织及其相应肿瘤组织中的表达。结果PIG11蛋白在胃、肠、肝、乳腺等腺上皮及鳞状上皮组织中明显表达阳性,在正常胃黏膜腺颈部较体部和底部表达降低。在纤维、脂肪、平滑肌、淋巴组织及脑组织中无明显表达。PIG11蛋白在肝癌、低分化胃和肠腺癌、乳腺癌组织中较相应正常组织均有明显表达下调(P<0.01);在鳞癌组织中,与正常鳞状上皮比较,也有表达下调(P<0.05)。结论PIG11蛋白主要分布在人体上皮组织,且与细胞的分化程度有关;PIG11蛋白低表达与上皮源性的恶性肿瘤发生发展有关。

HepG2细胞中PIG11相互作用蛋白质的初步分离与鉴定

目的探讨人肝细胞癌细胞系(HepG2)并初步鉴定候选肝癌抑癌蛋白肿瘤蛋白P53下游靶基因11号(PIG11)相互作用蛋白,确定PIG11的作用方式。方法课题组前期利用质粒pLXSN构建逆转录病毒载体,转染细胞后建立起PIG11高表达HepG2细胞株。将HepG2分为HepG2对照组,空载体HepG2组和PIG11高表达HepG2组分别培养,流式细胞术检测细胞凋亡。采用免疫共沉淀富集HepG2细胞中PIG11结合蛋白,切取PIG11结合蛋白条带,胶内酶解后进行电喷雾串联质谱得到肽序列标签,通过数据库查询蛋白。结果PIG11蛋白高表达组凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。串联质谱后数据库查询鉴定出11个蛋白,分别是热休克蛋白家族中的HSP60,KH型剪接调节蛋白(KSRP)、脑酸溶性蛋白BASP1、蛋白水解诱导因子(PIF/DCD)、Y染色体RNA结合蛋白、碳酸酐酶、白蛋白以及骨架蛋白中的波形蛋白、α、β-微管蛋白、肌动蛋白。结论PIG11蛋白高表达对HepG2具有诱导凋亡作用;初步鉴定出11个PIG11结合蛋白,为进一步阐明PIG11蛋白的作用机制提供线索。

PIG11高表达诱导HepG2细胞凋亡及其机制的初步探讨

目的利用已建立的稳定高表达PIG11蛋白的HepG2细胞株,探讨PIG11蛋白表达对HepG2细胞凋亡的影响,以及线粒体膜电位改变和Cyt C释放在凋亡过程中的作用。阐明PIG11诱导细胞凋亡的分子机制。方法 PI染色,流式检测细胞的凋亡情况。用Rh123标记,流式测定线粒体膜电位。Western Blot检测胞浆和线粒体中Cyt C的含量变化。结果流式细胞仪检测Rh123荧光强度,结果显示:pLXSN-PIG11-HepG2细胞荧光强度(5.4±0.15)低于HepG2细胞(14.7±0.56)和pLXSN-HepG2细胞(13.2±0.53)(P<0.01)。表明PIG11高表达诱导细胞凋亡过程中存在线粒体膜电位去极化。用CsA(10μmol/L)抑制各组细胞的线粒体通透性转移孔后,流式凋亡检测结果显示pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率明显降低。Western Blot检测发现存在线粒体Cyt C向胞浆释放。结论 PIG11高表达可诱导HepG2细胞凋亡,PIG11诱导细胞凋亡机制可能由线粒体膜电位改变及Cyt C向胞浆释放而介导。

Caspase-8和Bcl-2在PIG11诱导HepG2细胞凋亡中的作用

目的:利用本实验室已建立PIG11蛋白稳定低表达的HepG2细胞株和PIG11蛋白稳定高表达HepG2细胞株,研究Caspase-8和Bcl-2在PIG11诱导HepG2细胞凋亡中的作用,进一步探讨PIG11基因表达对HepG2细胞凋亡的机制。方法:细胞培养,分组:HepG2细胞、pLXSN-PIG11-HepG2(pLXSN-PIG11转染建立PIG11蛋白高表达HepG2细胞)、pLXSN-HepG2(pLXSN空载体转染HepG2细胞)、miR-PIG11-HepG2(miRNA干扰PIG11蛋白低表达HepG2细胞)、miR-HepG2(干扰空载体HepG2细胞)。Hoechst33342染色荧光和PI染色流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。Western blot检测Caspase-8蛋白、Bcl-2蛋白的表达情况。结果:Hoechst 33342染色荧光显微镜下pLXSN-PIG11-HepG2细胞组可见核染色质浓缩,核碎片,荧光增强,以及凋亡小体。PI染色流式细胞仪检测结果显示:HepG2细胞、miR-PIG11-HepG2细胞、miR-HepG2细胞、pLXSN-PIG11-HepG2细胞、pLXSN-HepG2细胞的凋亡率分别为5.72%±0.81%、1.34%±0.71%、5.10%±0.40%、34.83%±2.29%、5.34%±0.60%。PIG11高表达的pLXSN-PIG11-HepG2细胞组凋亡率比其它各组增高(P<0.01),PIG11低表达的miR-PIG11-HepG2细胞组凋亡率降低(P<0.01)。Western blot检测结果显示PIG11高表达的pLXSN-PIG11-HepG2细胞Caspase-8蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调(P<0.01),PIG11低表达的miR-PIG11-HepG2细胞Caspase-8蛋白的表达下调,Bcl-2蛋白表达上调(P<0.01)。结论:PIG11蛋白高表达能诱导HepG2细胞凋亡,其机制可能与Caspase-8蛋白及Bcl-2蛋白表达相关。

miR-186靶向PIG11基因抑制胃癌MKN-28细胞侵袭的作用

目的研究mi R-186靶向PIG11基因抑制胃癌细胞的侵袭。方法首先通过生物信息学方法分析,寻找与PIG11(TP53I11)结合的靶mi RNAs。分别构建mi R-186 mimics、点突变序列(Point mutation,PM)、空白载体(Scramble),转染胃癌MKN-28细胞。q RT-PCR检测mi R-186表达,Western blot检测PIG11表达,分析mi R-186表达和PIG11表达之间的相关性。Transwell检测转染前后各组胃癌MKN-28细胞侵袭能力变化。结果生物信息学发现12个mi RNAs可能是PIG11的潜在靶mi RNAs,其中mi R-186与PIG11结合特异性最好、稳定性最强;MKN-28-mi R-186 mimics细胞株中mi R-186表达增高,而PIG11表达下调,而MKN-28、MKN-28-mi R-Scramble、MKN-28-mi R-186-PM 3个细胞株中mi R-186表达水平较低,而PIG11表达水平较高。MKN-28-mi R-186 mimics侵袭细胞计数明显低于其他3组(P<0.05)。结论 mi R-186有可能靶向结合PIG11,下调其表达并抑制胃癌细胞的侵袭。

结肠癌PIG11表达与临床病理的关系

目的:探讨PIG11蛋白在结肠癌组织中表达的临床病理学意义。方法:采用免疫组化Envision法,对100例结肠癌标本组织芯片中PIG11蛋白的表达情况进行检测,并分析其与临床病理参数及患者生存期的相关性。结果:结肠癌组织中PIG11蛋白表达阳性率为25%,癌旁组织阳性率为65%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。PIG11蛋白表达与肿瘤组织分化程度、浸润深度及TNM临床分期相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析提示PIG11蛋白低表达患者的5年生存率低于高表达患者(P<0.001)。结论:PIG11蛋白的表达与结肠癌的发生、发展可能有关,并可提示结肠癌患者的预后。

PIG11与热休克蛋白60的相互作用介导肝癌HepG2细胞凋亡

为了探讨候选肝癌抑癌蛋白PIG11(p53-induced gene11,PIG11)诱导细胞凋亡的机制,首次在HepG2细胞株中鉴定了11个PIG11结合蛋白,热休克蛋白60(heat shock protein60,Hsp60)为其中之一.采用免疫共沉淀联合Western blot技术对Hsp60进行了验证.用Western blot检测其蛋白质表达,结果显示:pLXSN-PIG11-HepG2细胞中Hsp60蛋白表达较pLXSN-HepG2、HepG2细胞组下调(n=3,P<0.01).选取与Hsp60关系密切的Bax蛋白进行研究,Western blot结果显示PIG11高表达可引起胞浆Bax向线粒体转位.以上结果表明,PIG11蛋白能与HepG2细胞中的Hsp60结合,促进Hsp60-Bax的分离,引起Bax从胞液到线粒体转位,激活线粒体凋亡途径,这可能是其诱导HepG2细胞凋亡的主要机制之一.

PIG11、Caspase-3蛋白在胃癌中的表达及临床意义

目的:探讨PIG11、Caspase-3蛋白在胃癌中的表达及临床意义。方法:采用免疫组织化学SP法检测80例胃癌组织、36例正常胃黏膜组织、30例肠上皮化生组织及31例异型增生组织中PIG11、Caspase-3蛋白的表达水平,并分析其表达与胃癌临床病理特征的关系及两者之间的相关性。结果:胃癌组织中PIG11、Caspase-3蛋白的阳性表达率均显著低于正常胃黏膜、肠上皮化生及异型增生组织(P<0.01);PIG11、Caspase-3蛋白表达水平与胃癌的分化程度、临床分期、有无淋巴结转移及远处转移密切相关(P<0.05),但与患者的年龄、性别及肿瘤的浸润深度无关(P>0.05);PIG11、Caspase-3蛋白在胃癌组织中的表达呈正相关(r=0.859,P<0.01)。结论:PIG11、Caspase-3蛋白在胃癌中明显表达下调,且与胃癌的分化程度、临床分期、有无淋巴结转移及远处转移密切相关,可能作为胃癌预后评估的参考指标。PIG11表达下调可能通过抑制Caspase-3的表达促进胃癌的发生和发展。

PIG11基因沉默与HepG2细胞凋亡关系的研究

目的:构建人PIG11的miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR,建立PIG11蛋白稳定低表达的HepG2细胞株,联合PIG11蛋白稳定高表达HepG2细胞株,探讨PIG11基因表达对HepG2细胞凋亡的影响。方法:构建miRNA干扰载体,通过脂质体转染HepG2细胞,建立PIG11蛋白稳定低表达的HepG2细胞,与前期已建立的PIG11蛋白稳定高表达的HepG2细胞模型作对比,利用PI染色流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,蛋白质印迹法检测Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白的表达情况。结果:成功构建人PIG11的miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR,转染后获得PIG11基因沉默的HepG2细胞株。PI染色流式细胞仪检测结果显示,HepG2细胞、miR-PIG11-HepG2细胞、miR-HepG2细胞、pLXSN-PIG11-HepG2细胞和pLXSN-HepG2细胞的凋亡率分别为(5.72±0.81)%、(1.34±0.71)%、(5.10±0.40)%、(34.83±2.29)%和(5.34±0.60)%。PIG11高表达的pLXSN-PIG-11-HepG2细胞组凋亡率比其他组增高(P<0.01),PIG11低表达的miR-PIG11-HepG2细胞组凋亡率降低(P<0.01)。蛋白质印迹法检测结果显示,PIG11高表达的HepG2细胞Caspase-3及Caspase-9蛋白表达均上调(P<0.01),PIG11低表达的HepG2细胞Caspase-3及Caspase-9蛋白的表达下调(P<0.01)。结论:构建人PIG11的干扰载体成功获得PIG11蛋白稳定低表达的HepG2细胞株,PI染色流式细胞仪检测及Caspase-3的检测证实PIG11对HepG2细胞凋亡起负调控作用,Caspase-9检测显示PIG11诱导HepG2细胞凋亡可能通过线粒体途径。