链霉菌高拷贝质粒pIJ101的分子生物学

pIJ101是一个8.9kb的高拷贝链霉菌质粒,在载体的构建和应用方面得到了广泛的应用。pIJ101具有质粒大小适中,在接合时能够自我转移和诱动染色体的能力强,具有清晰的"麻点"形成特征,并在接合时的供受体双方均携带有pIJ101时没有"进入不利"的属性。通过缺失分析,已确定了与接合转移、麻点形成、复制功能及质粒稳定性等功能区。本文对pIJ101分子生物学研究和应用的进展进行系统综述。

以链霉菌高拷贝质粒pIJ101上一个专一性DNA片段所介导的链霉菌质粒之间的共整合体的形成

在链霉菌高拷贝质粒pIJ101上发现并定位了一段0.6kb的DNA片段。这段DNA可专一性地刺激不同配对的质粒之间共整合体的形成以及在细胞中的累积。形成共整合体的2个质粒之间的亲缘关系可以相近,也可以很远。然而,这段刺激2个质粒分子之间共整合的DNA片段在2个质粒上必须处于互反取向,共整合体才能形成;而处于同一取向时,根本不能发生共整合。已经证明,这个片段的存在和方向极大地影响单链质粒DNA的积累。本文阐述了这个片段刺激质粒形成共整合体的可能机制。

链霉菌高拷贝质粒pIJ101 DNA的研究 Ⅳ.BclI-E片段上启动子的定位

将链霉菌高拷贝质粒pIJ101上具有明显启动子活性的BclI—E片段(1.18kb)用MboI酶切后克隆到链霉菌启动子探针载体pIJ425中所做的试验证明,当把这个片段的末端去掉以后,中间的两个次级片段(0.63kb和0.68kb)比完整的BclI—E片段具有更强的(4～6倍)激活指标基因neo表达的能力.Southern印迹杂交试验证明这两个片段均来自于pIJ101的BclI—E片段.这项试验不仅大大缩小了BclI—E片段上的启动子活性区域,而且说明BclI—E片段末端有转录终止子的存在.

链霉菌高拷贝质粒pIJ101DNA的研究 Ⅲ.在变铅青链霉菌中的启动子活性

链霉菌高拷贝质粒pIJ101上的两个片段(1.18kb和0.54kb)在大肠杆菌中具有明显的启动子活性。把这两个片段克隆到链霉菌启动子探针载体pIJ424和pIJ425(修饰了克隆位点)上,转化到变铅青链霉菌中,然后用梯度平板测定转化子对卡那霉素的抗性水平发现:在变铅青链霉菌中,1.18kb的片段在两个方向都有启动子活性,而0.54kb的片段则明显没有。

链霉菌高拷贝质粒pIJ101衍生物之间的“强不相容性”(下)

Bcll-E片段在pWOR120中的亚克隆在截止现在所描述的各项试验中,sti和cop的功能都是单纯通过体外构建pIJ101的衍生质粒来加以鉴定的。如果把sti和cop克隆到另一个不同的复制子上照常可以显示它们的功能,那么上述结论即可得到证实。这样也可以使得顺反式试验不因pIJ101衍生质粒共有的复制功能之间相互的不相容性反应而变得复杂化。我们选择了链霉菌高拷贝质粒pJVI的衍生质粒pWOR120(图5)来进行该项试验。已经证明,pWOR120的亲本质粒pWOR109。

链霉菌高拷贝质粒pIJ101衍生物之间的“强不相容性”(上)

前言pIJ101是一个8.9kb的高拷贝质粒,可在许多链霉菌中复制。它具有自我转移的功能,至少在部分宿主中可促进染色体的重组(致育性)。从这个质粒中已经衍生了许多有用的克隆载体。在pIJ101的限制图谱上已经定位了基本复制功能,致育性决定子,两个kil功能以及相对应的kor功能。已经发现,许多成对标记的pIJ101的衍生质粒之间可在同一个变青链霉菌66寄主中共存。一个衍生质粒(如pIJ303)的转化频率并不因寄主中另一个衍生质粒(如pIJ211)的存在而大大降低。两个衍生质粒之间的重组很容易发生,说明两个质粒进入了同一个“细胞室”,然而,与拷贝数相当的两个亲本质粒相对而言,这种重组分子出现的很稀少。

链霉菌高拷贝质粒pIJ101的研究——Ⅴ.两个拷贝数突变子及其与克隆片段的关系

在分离和定位链霉菌高拷贝质粒 pIJ101上启动子活性区域的过程中,我们将 Bcll-E 片段经 MboI 进一步酶解后,克隆到由 pIJ101基本复制功能区所衍生的载体 pIJ425的 BgIII位点上,从转化变铅青链霉菌 TK64的原生质体所获得的硫链丝菌素抗性转化子中,发现了两个拷贝数极其异常的衍生质粒,命名为 pIJ2743和 pIJ2744。与 pIJ425相比,pIJ2743的拷贝数增加约10倍,而 pIJ2744的拷贝数则降低约10倍。拷贝数的剧增和剧减不是由于质粒宿主的突变,因为它们在重新转化的宿主中仍显示了突变型拷贝数特征。拷贝数的变化也不是由于载体的突变,因为切除插入片段后,载体区域再连接后的质粒仍与原始 pIJ425的拷贝数相同。将高拷贝突变子中0.63kb 的插入片段以两种不同的取向克隆到另一个类似于pIJ425的载体 pIJ486的 BamHI 位点,在一种取向插入时,新衍生的质粒仍显示出极高的拷贝数,而在另一种取向时,质粒的拷贝数不发生变化,说明拷贝数的剧增不仅只与插入片段有关,而且其功用具有明显的方向性,即为一顺式作用因子。