心梗大鼠持续和间歇运动干预的心肌血管新生相关miRNAs表征与EGFL7／miR126-PIK3R2／SPRED1通路激活的心脏保护效应

目的:探讨持续和间歇运动对心梗大鼠心脏血管新生相关mi RNAs表征及可能的效应机制。方法:3月龄雄性SD大鼠,随机分为假心梗组(S)、心梗组(MI)、心梗持续运动组(MCE)、心梗间歇运动组(MIE),每组10只。采用左脉前降支结扎制备心梗模型。MCE和MIE组术后1周进行跑台适应性训练(15 m/min,30 min/天×5天),之后MCE组以16 m/min(50%~60%O_(2max))速度持续运动64 min/天,5天/周×8周;MIE组以25 m/min×4 min(85%~90%O_(2max))和15 m/min×3 min(50%~60%O_(2max))速度依次交替运动49 min/天,5天/周×8周,训练结束后次日测定心功能。Masson染色观察分析心肌胶原容积分数(CFV),免疫组化观察心肌CD31和α-SMA表达,RT-q PCR检测心肌血管新生相关mi RNAs、egfl7、pik3r2和spred1表达,Western Blotting检测心肌PIK3R2、SPRED1和VEGF表达。结果:与S组比较,MI组心肌mi R-222表达显著上调,mi R-126表达显著下调,心肌CFV显著增加,心功能下降;与MI组比较,MIE组心肌mi R-17-5p、mi R-126表达均显著上调,MCE和MIE组CD31、α-SMA阳性颗粒显著增加,VEGF和egfl7 m RNA表达显著上调,且egfl7 m RNA与mi R-126表达呈高度正相关,PIK3R2、SPRED1蛋白及其m RNA表达均显著下调,心功能显著提升,且间歇运动优于持续运动。结论:间歇运动可显著上调心梗心脏mi R-126和mi R-17-5p表达,且mi R-126表达的变化率更大;持续和间歇运动显著激活心梗心脏EGFL7/mi R126-PIK3R2/SPRED1通路,抑制其下游靶蛋白PIK3R2/SPRED1表达,促进心脏梗死边缘区血管新生,产生心脏保护效应,且间歇运动的保护效应优于持续运动。

microRNA-126靶向PIK3R2调控肝癌细胞SMMC-7721的增殖和凋亡

目的研究micro RNA-126(mi R-126)对肝癌细胞SMMC-7721迁移能力的影响以及对靶基因PIK3R2表达的影响。方法通过慢病毒转染肝癌细胞株SMMC-7721使其过表达mi R-126,利用CCK-8法检测细胞增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡;采用实时定量PCR和蛋白印迹检测细胞PIK3R2表达水平的变化,并通过荧光素酶实验验证mi R-126与PIK3R2基因的直接调控关系。结果与对照组相比,转染mi R-126组的SMMC-7721细胞的增殖能力减弱,凋亡增加。过表达mi R-126后,SMMC-7721细胞PIK3R2的蛋白表达下调(P=0.0135)。荧光素酶报告基因实验显示,mi R-126能明显抑制PIK3R2-3’UTR的荧光素酶活性(P=0.0016)。结论过表达mi R-126可能通过靶向降低PIK3R2基因的蛋白表达,抑制肝癌细胞的迁移。

慢病毒介导PIK3R2基因沉默对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其机制研究

目的通过体外实验探讨沉默PIK3R2基因对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响和机制。方法qRT-PCR和Western blot技术检测正常宫颈细胞Ect1/E6E7和4种宫颈癌细胞(C33A、HeLa、SiHa和CaSki)中PIK3R2的表达。将携带PIK3R2 shRNA的慢病毒载体转染SiHa细胞,建立稳定沉默PIK3R2的细胞株LV-PIK3R2-shRN,MTT法检测细胞增活力,Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,Western blot检测增殖相关基因(CyclinD1和p21)、迁移侵袭相关基因(MMP-2和MMP-9)及PI3K/Akt信号通路重要蛋白(PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt)的表达水平。结果与正常宫颈细胞Ect1/E6E7相比,4种宫颈癌细胞C33A、HeLa、SiHa、CaSki中PIK3R2 mRNA和PIK3R2蛋白相对表达量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与LV-NC组相比,LV-PIK3R2-shRNA组SiHa细胞PIK3R2蛋白的表达显著降低,SiHa细胞在24h、48h、72h和96h时间点细胞活力显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与LV-NC组相比,LV-PIK3R2-shRNA组SiHa细胞的迁移和侵袭细胞数目显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与LV-NC组比较,LV-PIK3R2-shRNA组p-PI3K和p-AKT蛋白的表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与LV-NC组相比,LV-PIK3R2-shRNA组SiHa细胞的增殖活力显著降低,迁移和侵袭细胞数目显著减少差异具有统计学意义(P<0.05);与LV-PIK3R2-shRNA组相比,LV-PIK3R2-shRNA+激动剂组SiHa细胞的增殖活力显著升高,迁移和侵袭细胞数目显著增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论沉默PIK3R2可抑制PI3K/AKT信号通路激活,进而抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

PIK3R2基因错义变异所致MPPH综合征I型患儿遗传学分析

目的:总结1例罕见的巨脑畸形-多小脑回-多指(趾)畸形-脑积水(MPPH)综合征Ⅰ型患儿的临床特点及基因检测结果。方法:回顾性总结2021年1月在温州医科大学附属第一医院新生儿科确诊的1例MPPH I型患儿的临床表现、影像学检查和基因检测结果等病例资料。并通过文献复习,分析和总结国内外已报道的MPPH I型综合征病例的临床特征及遗传学特点。同时对患儿进行全外显子组检测,对候选变异用Sanger测序进行家系验证。结果:先证者携带PIK3R2基因c.1117(p.Gly373Arg)杂合错义变异,国内既往未见报道,其父母未携带相同变异。相关文献报道的16例MPPH I型患儿主要表现为不同程度的脑积水、巨脑畸形、癫痫发作、多指(趾)畸形、发育迟缓及智力发育障碍。共报道了3个基因突变位点,其中p.Gly373Arg杂合变异最多(14例),罕见变异包括p.Leu401Pro变异1例和p.Asp557His变异1例。结论:PIK3R2基因c.1117G>A(p.Gly373Arg)杂合错义变异可能是该患儿发生MPPH I的原因,脑积水考虑与该综合征相关,其母亲再次怀孕时需接受产前诊断。

NAC饲喂努比亚山羊对ADCY8、PIK3R2基因在性腺轴组织表达水平研究

为探究N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)对山羊繁殖性能的影响,该试验在前期饲喂0.07%的NAC提高了山羊产仔数的基础上,以努比亚山羊为研究对象,采用q-PCR检测ADCY8、PIK3R2基因在空白组和NAC饲喂组(0.07%NAC)下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管5个组织中的表达量变化。结果表明:ADCY8和PIK3R2基因在5个组织中均有表达。ADCY8基因在空白组下丘脑中表达量最高,饲喂组子宫中表达量最高,在卵巢中的表达量均最少,垂体和下丘脑中空白组极显著高于饲喂组(P<0.01);PIK3R2基因在空白组和饲喂组中垂体的表达量最高,在卵巢中表达量最少,在垂体和下丘脑中空白组极显著高于饲喂组(P<0.01)。综上所述,饲喂0.07%的NAC可能通过上调ADCY8、下调PIK3R2在性腺轴的表达量进而影响努比亚山羊的繁殖性能。

mtr-miR156a在奶牛乳腺上皮细胞的靶基因筛选鉴定及其调控奶牛乳蛋白生物合成的研究

本试验旨在探究苜蓿miR156a(mtr-miR156a)在奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)的靶基因及其对乳蛋白合成的调控作用,为进一步研究外源性植物微小RNA(miRNA)调控奶牛乳蛋白合成提供研究基础。首先通过联川生物云平台、TargetScan和RNAhybrid在线网站预测和筛选出mtr-miR156a调控蛋白合成的候选靶基因,然后构建候选靶基因丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 56 kDa调节亚基delta亚型(PPP2R5D)和磷酸肌醇3激酶调控亚单位2(PIK3R2)的重组质粒,并通过双荧光素酶验证鉴定出靶向基因,最后运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测过表达mtr-miR156a对BMECs乳蛋白合成相关基因表达以及酪蛋白编码基因mRNA和蛋白表达的影响。结果表明:1)双荧光素酶报告基因和qRT-PCR鉴定了mtr-miR156a可以靶向结合PPP2R5D和PIK3R2并极显著降低其表达水平(P<0.01)。2)与mimic NC相比,过表达mtr-miR156a极显著降低丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)、核糖体蛋白S6激酶beta-1(S6K1)、真核翻译起始因子4B(eIF4B)、核糖体蛋白S6(RPS6)、结节性硬化症复合物亚基2(TSC2)、脑富集Ras同源物(RHEB)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和真核翻译起始因子4E(eIF4E)相对表达量(P<0.01),极显著提高蛋白激酶B1(Akt1)和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(EIF4EBP1)相对表达量(P<0.01)。3)与mimic NC处理相比,过表达mtr-miR156a极显著提高酪蛋白alpha S1(CSN1S1)、酪蛋白alpha S2(CSN1S2)、酪蛋白beta(CSN2)和酪蛋白kappa(CSN3)相对表达量(P<0.01)。4)ELISA结果表明,与mimic NC处理相比,过表达mtr-miR156a显著提高BMECs培养液上清液中α酪蛋白和β酪蛋白含量(P<0.05),极显著提高上清液中κ酪蛋白含量(P<0.01)。综上所述,mtr-miR156a通过靶向结合位于磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信号通路的PPP2R5D和PIK3R2,调控PI3K/Akt/mTOR信号通路PDK1、S6K1、eIF4B、RPS6、Akt1、TSC2、RHEB、mTOR、eIF4E和EIF4EBP1等基因表达,上调BMECs中编码酪蛋白基因mRNA和蛋白表达水平,参与BMECs中酪蛋白的调控。

MicRNA-126与肝癌细胞增殖、凋亡的关系研究

目的分析探究micRNA-126与肝癌细胞增殖、凋亡的关系,并筛查作用机制。方法体外培养人肝癌细胞株HepG2、MHCC97-L、PLC、Huh7以及人肝细胞株L02,将HepG2、MHCC97-L细胞随机分为micRNA-126 mimics组(转染micRNA-126 mimics)、micRNA-126 NC组(转染阴性对照序列)和control组(不转染任何序列),RT-PCR法检测人肝癌细胞株HepG2、MHCC97-L、PLC、Huh7中micRNA-126表达水平以及过表达micRNA-126后HepG2、MHCC97-L中micRNA-126表达水平,MTT法检测HepG2、MHCC97-L细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡能力,Western blot法检测PIK3R2、PI3K、PDK1、AKT、p-PI3K、p-PDK1、p-AKT蛋白水平,建立裸鼠皮下成瘤模型并观察过表达micRNA-126对肿瘤生长的影响,生物信息学软件预测micRNA-126与PIK3R2的靶向关系,采用荧光素酶实验进一步验证micRNA-126与PIK3R2的靶向关系。结果人肝癌细胞株HepG2、MHCC97-L、PLC、Huh7中micRNA-126表达水平显著低于人肝细胞株L02,且差异有统计学意义(P<0.05);micRNA-126 mimics组HepG2、MHCC97-L细胞中micRNA-126表达水平显著高于control组和micRNA-126 NC组,且差异有统计学意义(P<0.05);MTT法检测结果显示,在24 h、48 h、72 h以及96 h时,micRNA-126 mimics组HepG2、MHCC97-L细胞增殖率显著高低于control组和micRNA-126 NC组,且差异均有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,micRNA-126 mimics组HepG2、MHCC97-L细胞凋亡率显著高于control组和micRNA-126 NC组,且差异均有统计学意义(P<0.05);过表达组裸鼠肿瘤体积显著小于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05);micRNA-126 mimics组PIK3R2、p-PI3K/PI3K、p-PDK1/PDK1、p-AKT/AKT蛋白表达水平显著低于control组和micRNA-126 NC组(P<0.05);PIK3R2为肝癌细胞中micRNA-126的靶基因,与转染WT荧光素酶质粒mimic NC组相比,共转染WT荧光素酶质粒micRNA-126 mimic组荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而转染MUT荧光素酶质粒mimic NC组和共转染MUT荧光素酶质粒micRNA-126 mimic组荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝癌细胞中micRNA-126下调表达,肝癌细胞中PIK3R2可能是micRNA-126的潜在靶基因,micRNA-126可能靶向负调控PIK3R2表达,抑制肝癌细胞增殖及促进其凋亡。

通脉养心丸对PCI术后微血管病变胸痹患者miR-126调控机制

为了探究通脉养心丸对冠心病合并糖尿病PCI术后微血管病变胸痹患者血清microRNA-126的影响及其调控机制,本研究采用随机挑选60例冠心病合并糖尿病PCI术后微血管病变胸痹患者,随机分成对照组及治疗组,每组各30例,治疗组在规范化西药治疗的基础上给予通脉养心丸进行干预。治疗4周后,收集患者血浆,采用real-time PCR法测定miR-126;microRNA.org软件预测miR-126靶基因,并通过双荧光素酶实验验证;从基因和蛋白水平上对靶基因进行检测。研究发现通脉养心丸对PCI术后微血管病变胸痹有显著疗效;治疗组血浆miR-126表达量显著性高于对照组;生物信息学预测并验证miR-126靶基因为PIK3R2,且治疗组血浆PIK3R2 mRNA及蛋白表达量均低于对照组。研究认为miR-126可能通过抑制靶基因PIK3R2翻译来调控相关基因表达,从而抑制冠心病合并糖尿病PCI术后微血管病变胸痹发生。通脉养心丸对miR-126的影响和调控机制为冠心病合并糖尿病PCI术后微血管病变胸痹的中医治疗提供理论基础。