新型冠状病毒侵染所需宿主基因TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2重要功能变异分析

目的研究新型冠状病毒(SARS-CoV-2)侵染所需宿主基因TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2的重要功能变异在全世界不同人群间的分布差异。方法使用GTEx数据库,在新型冠状病毒的主要侵染器官肺中分析TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因的eQTL位点。使用1 k GP(千人基因组计划)数据库,系统分析上述4个基因的错义变异在世界不同人群间的分布差异,并使用PolyPhen-2和SIFT软件预测错义突变导致的氨基酸替代是否影响蛋白功能。结果在肺中发现了4个q值小于0.05的eQTL位点,分别为TMPRSS2基因的rs35074065、CTSL基因的rs2378757、PIKFYVE基因的rs12475932、TPCN2基因的rs930786。TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因的4个eQTL位点可能与上述4个基因在东亚人群中的较低表达水平有关。在TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因上分别有10、6、15、30个有害错义变异,大部分变异都是低频变异,其中大多数仅在一个人群中具有特异性。唯一的例外是TPCN2基因的变异位点rs78034812,它在全球的等位基因频率大于1%,在东亚人群中具有最高的等位基因频率且该位点在物种间具有保守性。结论TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因存在重要功能变异,这些变异的等位基因频率在不同人群间存在差异,可能影响基因的表达和功能,从而影响人群对新型冠状病毒的易感性以及感染后症状的差异。

PIKfyve基因敲除对小鼠成熟免疫细胞分布与数量的影响

目的建立PIKfyve基因全身与造血系统诱导性敲除小鼠模型,探索PIKfyve对免疫稳态的影响,为后续研究PIKfyve在造血系统中的功能提供基础。方法将LoxP位点插入PIKfyve基因第六外显子两端,建立PIKfyve+/flox小鼠,PIKfyve+/flox小鼠与PIKfyve+/flox小鼠互配得到PIKfyveflox/flox小鼠,PIKfyveflox/flox小鼠与UBC-Cre/ERT2小鼠杂交得到PIKfyve+/flox、UBC-Cre/ERT2小鼠,再与PIKfyveflox/flox小鼠杂交即可得到PIKfyveflox/flox、UBC-Cre/ERT2小鼠,即为目的小鼠。经基因型鉴定与诱导后,利用实时荧光定量PCR与Western印迹鉴定敲除效率,观察比较敲除小鼠与对照小鼠血象以及外周血、骨髓、脾脏中成熟免疫细胞的比例与数量。经同样配繁策略引入PIKfyveflox/flox、MX1-Cre小鼠对结果进行验证。结果通过小鼠杂交与鼠尾基因PCR鉴定成功获得PIKfyveflox/flox、UBC-Cre/ERT2小鼠,经诱导后敲除小鼠PIKfyve的mRNA与蛋白含量显著下降,表明模型小鼠建立成功。此外,外周血象检测发现PIKfyve基因缺失小鼠外周血中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞与单核细胞数量均显著下降。流式检测发现整体上看PIKfyve基因缺失小鼠B细胞与NK细胞比例显著下降,T细胞与中性粒细胞比例显著上升,而整体数量上依然呈现下降趋势。PIKfyveflox/flox、MX1-Cre小鼠实验结果与PIKfyveflox/flox、UBC-Cre/ERT2小鼠一致。结论成功建立PIKfyve敲除小鼠模型,发现PIKfyve调控成熟免疫细胞数量与比例,影响免疫稳态。

水稻3-磷脂酰肌醇激酶FAB1/PIKfyve基因家族的鉴定及功能分析

FAB1/PIKfyve是催化3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)形成3,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3,5)P_(2))过程的关键酶,其产物PtdIns(3,5)P_(2)在真核细胞发育中发挥重要功能。为探寻PtdIns(3,5)P_(2)在水稻生殖发育过程中的功能,本研究结合生物信息学和遗传学方法,对水稻FAB1/PIKfyve基因进行鉴定,分析其理化性质、基因结构、保守结构域、系统进化、顺式作用元件和组织表达模式并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得osfab1b突变体。生物信息学分析结果显示,水稻基因组中共鉴定到9个FAB1基因家族成员;基因结构分析显示FAB1家族基因结构存在差异,外显子数量为8~12个;保守结构域分析表明仅Os FAB1A和Os FAB1B含有N端FYVE结构域,其余成员具有Cpn60_(T)CP1结构域和PIPKc激酶结构域;系统进化分析提示FAB1家族功能在单双子叶植物中具有高度保守性;FAB1基因上游调控区域顺式元件预测发现多种生长发育相关、光响应以及激素和胁迫响应顺式元件;组织表达模式分析显示大多数FAB1基因为泛表达,其中FAB1C亚类基因在内外稃中的高表达提示其可能参与花器官发育。最后通过CRISPR/Cas9系统得到osfab1b突变体,经碘染观察花粉活力无明显异常,暗示FAB1家族在水稻生殖发育调控中存在功能冗余。本研究结果为单子叶模式植物水稻中磷脂酰肌醇调控网络及其生物学功能的研究提供了理论参考。

PIKfyve的生物学功能及与疾病的关系

含FYVE结构的磷酸肌醇3-磷酸5-激酶(FYVE domain-containing phosphatidylinositol 3-phosphate5-kinase,PIKfyve)是哺乳动物体内的一种磷脂酰肌醇脂质激酶。PIKfyve通过催化磷脂酰肌醇-3-磷酸[phosphatidylinositol 3-phosphate,PtdIns(3)P]生成磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸[phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate,PtdIns(3,5)P2]或磷脂酰肌醇-5-磷酸[phosphatidylinositol-5-phosphate,PtdIns(5)P],在调节膜运输以及维持溶酶体功能中发挥关键作用,还参与内体转运、转录调控和免疫调节等重要细胞生物学功能。近年来的研究表明,PIKfyve在炎症、病原微生物感染、神经退行性疾病和肿瘤的发生发展中起重要作用,可作为潜在的疾病防治靶点。本文就PIKfyve的生化特点、生物学功能及其在相关疾病中发挥的作用研究进展进行综述。