基于PINK1/parkin信号转导通路研究灵芝孢子对糖尿病心肌损伤的保护作用

目的探讨灵芝孢子对糖尿病(DM)大鼠心肌损伤的保护作用及对PTEN诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(parkin)信号通路的作用机制。方法将40只雄性SD大鼠随机分成对照(NC)组、高脂高糖饮食(HFD)组、DM组和灵芝孢子(GLS)组各10只。12 w末,记录各组末次体质量及空腹血糖。麻醉处死大鼠后,采集心脏组织,计算心脏指数,并检测丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量。苏木素-伊红染色(HE)和马松(Masson)染色观察心脏病理学变化。Western印迹检测PINK1/parkin通路蛋白、自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白,免疫组织化学技术验证PINK1、parkin的表达水平,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色评估细胞凋亡情况。结果与NC组相比,HFD组体质量明显增加,DM组体质量明显减轻,血糖水平明显升高(P<0.05);HFD组和DM组心脏指数、MDA含量、PINK1、parkin、p-parkin、微管相关蛋白轻链(LC)3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2同源结构域蛋白抗体(beclin)1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)/Bcl-2蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率及血管周围胶原含量明显增加,SOD活性、p62蛋白表达水平显著下降(均P<0.05)。与DM组相比,HFD组和GLS组体质量、SOD活性、p62蛋白表达水平明显增加,血糖水平、心脏指数、MDA含量、PINK1、parkin、p-parkin、LC3、beclin1、Bax/Bcl-2蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率、血管周围胶原含量明显降低(均P<0.05)。结论灵芝孢子可减轻DM大鼠心肌损伤,改善纤维化程度,具有良好的抗氧化活性,可逆转心肌细胞过度自噬,抑制细胞凋亡,其保护作用可能与下调PINK1/parkin信号通路有关。

艾帕素13(apelin-13)通过阻断PINK1/parkin信号通路促进线粒体自噬改善大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的研究脂肪细胞因子艾帕素13(AP13)对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中线粒体自噬水平的影响及机制。方法通过结扎大鼠冠状动脉分支建立MIRI模型,大鼠分为假手术组、AP13处理的假手术组、MIRI组、AP13处理的MIRI组。MIRI模型建立24 h后,采用ELISA检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平,2,3,4-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测大鼠心肌梗死面积,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测MIRI心肌区的心肌细胞凋亡水平,透射电镜观察受损心肌区心肌细胞线粒体损伤情况及自噬体的形成。取各组大鼠心肌梗死区组织,Western blot法检测细胞中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)/LC3Ⅰ比值,泛素结合蛋白P62蛋白及线粒体自噬通路中磷酸酶与张力蛋白同源物诱导激酶1(PINK1)、泛素连接酶parkin和裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)的蛋白表达。采用携带GFP-LC3的腺病毒感染分离的各组大鼠心梗区心肌细胞,并采用免疫荧光细胞化学染色观察线粒体外膜转位酶20(TOM20)和LC3的共定位。结果与假手术组或AP13处理的假手术组相比,MIRI组或AP13处理的MIRI组大鼠血清CK、LDH、cTnI和心肌梗死面积和细胞凋亡率均显著增加,前两组无明显差异。而与MIRI组相比,AP13处理的MIRI大鼠的上述变化均明显降低。与假手术组或AP13处理的假手术组相比,MIRI组或AP13处理的MIRI组大鼠心肌细胞中线粒体结构的完整性明显破坏,且包裹线粒体的自噬体大量出现,而与MIRI组相比,AP13处理的MIRI组大鼠的心肌细胞线粒体损伤明显减轻,自噬体的数量显著增加。MIRI组或AP13处理的MIRI组梗死心肌组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、PINK1、parkin及c-caspase-3蛋白表达均显著增加,P62表达水平明显降低,而与MIRI组相比,AP13处理的MIRI组中上述蛋白水平的变化趋势明显降低;MIRI造模后LC3与TOM20共定位于心肌细胞线粒体中,且在AP13处理的MIRI组中LC3的表达强度较MIRI组显著增加。结论AP13可能通过阻断PINK1/parkin信号通路,促进线粒体自噬水平减少MIRI造成的心肌梗死面积,降低细胞凋亡率。

基于PINK1/Parkin通路探讨灵芝孢子对糖尿病肾病模型大鼠肾脏细胞凋亡的影响

目的基于PTEN诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)通路研究灵芝孢子对糖尿病肾病(DN)模型大鼠的肾脏细胞凋亡的影响。方法32只SPF级雄性SD大鼠(180~200 g),随机分成正常对照(NC)组、高脂高糖(HF)组、DN模型(DN)组和灵芝孢子(GLSP)组。除NC组外,其余各组均采用高脂、高糖饲养,同时DN组和GLSP组均联合腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ,50 mg/kg)。GLSP组每日灌胃给予灵芝孢子〔300 mg/(kg•d)〕持续3个月,其余组均灌胃给予等量生理盐水〔10 ml/(kg•d)〕。每周测定各组空腹血糖。12 w后评估肾脏功能,用试剂盒检测尿素氮、血清肌酐、24 h尿蛋白等生化指标。苏木素-伊红(HE)、过碘酸希未反应(PAS)和Masson染色用于检查肾脏病理学。通过TUNEL法观察大鼠肾脏组织凋亡细胞的分布及凋亡率情况。通过免疫组化检测肾脏组织中P62、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。Western印迹检测PINK1/Parkin通路涉及的关键蛋白PINK1、Parkin及微管相关蛋白1轻链(LC)3、P62、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved)-Caspase3、Bax、Bcl-2表达水平。结果与NC组相比,DN组尿中出现大量尿蛋白,血清肌酐及尿素氮水平明显升高(P<0.01),肾小体直径增大、肾小囊腔变小、肾小球内细胞数增多并有糖原累积、肾小球内含有大量的胶原纤维,肾组织中PINK1、Parkin、LC3的蛋白表达显著降低、P62表达显著升高,凋亡相关蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3表达明显升高,Bcl-2/Bax表达明显降低(P<0.01),肾脏凋亡荧光强度明显增加(P<0.01)。与DN组相比,GLSP组肾脏滤过功能明显改善(P<0.01),肾脏病理损伤缓解,肾小球体积有明显减小、肾组织胶原纤维覆盖面积明显降低、糖原明显减少;肾组织中PINK1、Parkin表达明显升高、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显增加,P62表达明显下降,且凋亡相关蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3表达明显下降,Bcl-2/Bax表达明显升高(P<0.01),肾脏凋亡荧光强度明显降低(P<0.01)。结论灵芝孢子可能调控PINK1/Parkin途径,激活肾脏细胞自噬有关,抑制重要的促凋亡蛋白的表达,减轻高糖水平对肾脏的损害,抑制细胞凋亡。

化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的影响

目的:研究化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及对线粒体自噬相关蛋白PTEN诱导激酶1(PINK1)、Parkin的影响。方法:将48只雄性SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组(化浊解毒活血通络方)、抑制剂组[3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制剂],每组12只。按照Longa法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型,造模成功给药3 d后,行大鼠神经功能缺损评分,HE染色观察脑组织病理改变,TTC染色观察脑梗死体积,Western Blot检测脑组织PINK1、Parkin蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测脑组织中PINK1、Parkin mRNA的表达。结果:与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分和脑梗死体积显著增加(P<0.05),病理损伤加重,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,中药组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积显著减少(P<0.05),病理损伤减轻,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与模型组及中药组比较,抑制剂组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积显著增加(P<0.05),病理损伤加重,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。结论:化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠具有脑保护作用,其机制可能与上调线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达相关。

肉桂醛通过PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬促进糖尿病大鼠创面愈合机制

目的:采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射链尿佐菌素(STZ)及手术制备全层皮肤缺损的方法制备糖尿病大鼠创面模型,观察肉桂醛对糖尿病大鼠创面愈合情况的影响,并基于PTEN诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)信号通路介导的线粒体自噬探讨肉桂醛对糖尿病大鼠创面的治疗机制。方法:48只雄性SD大鼠随机分为空白组12只,糖尿病组36只,糖尿病组随机分为模型组、肉桂醛组和贝复新组,每组12只,空白组与模型组创面常规消毒后予生理盐水,肉桂醛组创面局部外敷含4μmol·L^(-1)肉桂醛的聚乙二醇400(PEG 400)凝胶,贝复新组创面外敷贝复新凝胶,每日换药1次。观察各组创面愈合率,取干预后7、14 d大鼠创面组织,苏木素-伊红(HE)染色观察局部组织病理变化,免疫组化(IHC)检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、胶原纤维的表达情况,免疫荧光(IF)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测PINK1、Parkin、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)蛋白和mRNA的表达情况。结果:腹腔注射STZ后,与空白组比较,糖尿病组大鼠随机血糖值显著升高(P<0.01),均高于16.7 mmol·L^(-1),且在造模后一段时间持续保持高血糖状态。与空白组比较,模型组大鼠创面肉芽组织生长、愈合情况较差,创面愈合率显著降低(P<0.01);干预后7 d,空白组创面已有鳞状上皮覆盖,与空白组比较,模型组大鼠创面仅创缘少量结痂,创面中大量炎细胞浸润,组织IL-6、TNF-α蛋白表达水平显著上升(P<0.01),PINK1、Parkin、LC3Ⅱ蛋白表达及mRNA水平显著降低(P<0.01);干预后14 d,空白组创面肉芽组织成熟,愈合良好,与空白组比较,模型组创面炎细胞浸润和红细胞渗出尚未完全消退,组织VEGF、胶原纤维蛋白表达水平显著降低(P<0.01),PINK1、Parkin、LC3Ⅱ蛋白表达及mRNA水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,肉桂醛组和贝复新组大鼠创面愈合情况较好,创面愈合率显著升高(P<0.01),干预后7 d组织IL-6、TNF-α蛋白表达水平显著降低(P<0.01),PINK1、Parkin及LC3Ⅱ蛋白表达及mRNA水平显著升高(P<0.01),干预后14 d组织VEGF、胶原纤维蛋白表达水平显著上升(P<0.01),PINK1、Parkin、LC3Ⅱ蛋白表达及mRNA水平显著降低(P<0.01)。结论:肉桂醛能促进糖尿病创面愈合,上调创面愈合率,降低炎症因子IL-6、TNF-α的水平,增加VEGF、胶原纤维蛋白的水平,其机制可能是通过调节PINK1/Parkin信号通路表达,激活线粒体自噬,抑制炎症反应,增加血管新生和胶原合成,从而达到促进糖尿病大鼠创面愈合的目的。

miR-339-5p过表达对带状疱疹后遗神经痛大鼠疼痛缓解的机制

目的探究miR-339-5p过表达对带状疱疹后遗神经痛大鼠的疼痛缓解机制。方法选取48只健康SPF级SD大鼠,分别将48只大鼠分为空白组、模型组、过表达组、沉默组各12只,模型组、过表达组、沉默组构建带状疱疹后遗神经痛模型,做miR-339-5p慢病毒滴定,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-339-5p基因表达量,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠5-羟色胺(HT)、神经生长因子(NGF)、白细胞介素(IL)-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α,采用电子测痛仪进行测定机械痛阈,采用Western印迹检测大鼠同源性磷酸张力蛋白诱导激酶1/帕金森蛋白(PINK1/Parkin)信号通路基因表达量。结果与模型组相比,过表达组miR-339-5p基因表达量、不同时间点痛阈值、IL-2、TNF-α、5-HT、NGF、PINK1/Parkin信号通路表达量明显升高(P<0.05)。与模型组相比,沉默组miR-339-5p基因表达量、PINK1/Parkin信号通路表达量明显降低,不同时间点痛阈值、IL-2、TNF-α、5-HT、NGF明显升高(P<0.05)。与过表达组相比,沉默组miR-339-5p基因表达量、PINK1/Parkin信号通路表达量明显降低,不同时间点痛阈值、IL-2、TNF-α、5-HT、NGF明显升高(P<0.05)。结论miR-339-5p过表达基因通过作用于PINK1/Parkin信号通路,调控PINK1、Parkin表达量,显著减轻了带状疱疹后遗神经痛大鼠的疼痛程度。

PINK1在人卵巢癌细胞系SKOV3增殖及顺铂诱导细胞死亡中的作用

目的研究线粒体丝苏氨酸蛋白激酶PINK1(PTEN induced putative kinase 1)在卵巢癌细胞生长增殖中的作用,及其表达在顺铂诱导细胞死亡中的作用。方法转染并用G418筛选稳定表达pcDNA3.1-PINK1及pcDNA3.1的SKOV3细胞系,细胞设3组:正常培养组、转染空质粒pcDNA3.1组,过表达PINK1组。采用实时定量PCR检测各组细胞PINK1 m RNA的表达,MTT和流式细胞仪检测各组细胞生长增殖及细胞周期分布情况。观察PINK1在顺铂(DDP)诱导卵巢癌细胞死亡中的作用,并检测耐药基因MDR1、MRP1以及ABCG2在各处理组中的表达水平。结果过表达PINK1的SKOV3细胞系PINK1 m RNA的表达水平显著高于正常培养组及转染空质粒pcDNA3.1组细胞(P<0.05)。过表达PINK1组较其他两组细胞增殖率显著提高,细胞进入S和G2/M期比例增加(P<0.05)。过表达PINK1显著抑制了10μmol/L和20μmol/L顺铂诱导细胞死亡,并诱导了耐药基因MDR1、MRP1和ABCG2的表达升高。结论上调PINK1的表达可促进卵巢癌细胞增殖,降低细胞对顺铂作用的敏感性并诱导耐药基因的表达。