葛根素通过调节PINK1-parkin信号通路介导的线粒体自噬抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡上皮细胞凋亡

目的:建立大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型,探讨葛根素是否能够通过调控PTEN诱导假定激酶1(PINK1)-parkin信号通路介导的线粒体自噬,发挥肺保护作用。方法:气管滴注脂多糖+烟熏法建立COPD大鼠模型,建模成功后随机分为模型组、低剂量(50 mg/kg)葛根素组、中剂量(100 mg/kg)葛根素组、高剂量(200 mg/kg)葛根素组和3-甲基腺嘌呤(3-MA;10 mg/kg)组,每组15只;另取15只大鼠作为对照组。连续给药8周后进行大鼠肺功能检测;ELISA法检测大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平;HE染色观察大鼠肺组织病理变化;TUNEL染色观察大鼠肺泡上皮细胞凋亡情况;免疫组化法检测肺组织中BECN1和LC3B蛋白表达;Western blot法检测肺组织中PINK1、parkin、Bax和Bcl-2蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组大鼠肺组织病变明显,肺泡腔严重充血,炎症细胞大量浸润,肺泡间隔与肺泡壁增厚,病理评分显著升高(P<0.05),用力肺活量(FVC)、0.1 s用力呼气容积(FEV0.1)和呼气流量峰值(PEF)水平均显著下降(P<0.05),TNF-α、IL-1β和IL-6水平,肺泡上皮细胞凋亡率,肺组织中BECN1、LC3B、Bax、PINK1和parkin表达均显著升高(P<0.05),Bcl-2表达显著降低(P<0.05);与模型组比较,各剂量葛根素组和3-MA组大鼠肺组织病理评分均显著降低(P<0.05),FVC、FEV0.1和PEF水平均显著升高(P<0.05),TNF-α、IL-1β和IL-6水平,肺泡上皮细胞凋亡率,肺组织中BECN1、LC3B、Bax、PINK1和parkin表达均显著降低(P<0.05),Bcl-2表达显著升高(P<0.05),且具有剂量依赖性(P<0.05);与高剂量葛根素组比较,3-MA组大鼠上述指标无显著差异(P>0.05)。结论:葛根素可能通过调控PINK1-parkin信号通路介导的线粒体自噬,抑制肺泡上皮细胞凋亡和肺部炎症反应,从而减轻COPD大鼠肺损伤。

麝香保心丸调节PINK1/Parkin信号通路对糖尿病视网膜病变大鼠的影响

[目的]探讨麝香保心丸(SBP)对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠线粒体自噬及PTEN诱导激酶蛋白1(PINK1)/细胞质E3-泛素连接酶(Parkin)信号通路的影响。[方法]建立DR大鼠模型,将大鼠随机分为正常组(Control组)、模型组(DR组)、麝香保心丸低剂量组(SBP-L组)、麝香保心丸高剂量组(SBP-H组)、麝香保心丸高剂量+雷帕霉素组(SBP-H+RAP组)。检测各组大鼠空腹血糖(FPG)及总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠DR情况;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组大鼠血管内皮生长因子(VEGF)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)水平;透射电镜观察各组大鼠细胞线粒体形态;免疫组化检测线粒体自噬相关蛋白选择性自噬接头蛋白sequestosome-1(SQSTM1/P62)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)的表达;蛋白免疫印迹法检测各组大鼠PINK1、Parkin蛋白表达。[结果]与Control组比较,DR组视网膜结构破坏严重,细胞排列紊乱,水肿明显,细胞间隙变宽,线粒体损伤、肿胀明显,形态异常,FPG、TC、TG、LDL-C、VEGF、HMGB1、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平显著升高,SQSTM1/P62表达水平显著降低(P<0.05);与DR组比较,SBP-L组、SBP-H组视网膜细胞结构改善,细胞排列逐渐整齐,细胞水肿减轻,细胞、线粒体形态均趋于正常,线粒体肿胀减轻,FPG、TC、TG、LDL-C、VEGF、HMGB1、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平显著降低,SQSTM1/P62表达水平显著升高(P<0.05);与SBP-H组相比,SBP-H+RAP组视网膜细胞结构破坏加重,细胞排列紊乱,水肿明显,线粒体肿胀加重,形态异常,FPG、TC、TG、LDL-C、VEGF、HMGB1、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平显著升高,SQSTM1/P62表达水平显著降低(P<0.05)。[结论]麝香保心丸通过抑制PINK1/Parkin信号通路抑制DR大鼠线粒体自噬。

基于线粒体自噬PINK1/Parkin信号通路的枳实、麸炒枳实和烫枳实对功能性消化不良大鼠治疗作用比较

目的基于线粒体自噬PINK1/Parkin信号通路对比枳实、麸炒枳实和烫枳实对功能性消化不良(FD)大鼠的治疗作用。方法将36只大鼠随机分为正常组、模型组、多潘立酮组、枳实组、麸炒枳实组、烫枳实组。除正常组外其他各组采用碘乙酰胺灌胃结合夹尾刺激法制作FD大鼠模型。造模结束后各给药组给予相应药液灌胃,模型组和正常组给予等体积生理盐水灌胃,持续14 d。造模和给药时,记录大鼠饮食量、饮水量和体质量。给药结束后,测定大鼠小肠推进率,苏木-伊红(HE)染色观察胃组织损伤情况,Western blot检测自噬相关蛋白PINK1、Parkin、Beclin-1、p62的表达。结果与模型组比较,各给药组小肠推进率提高。在造模期间,与正常组比较,各组大鼠的体质量增长减慢,平均日饮食量降低,模型组大鼠平均日饮水量降低。在给药期间,与模型组比较,多潘立酮组、麸炒枳实组和烫枳实组平均日饮食量增加;与模型组比较,麸炒枳实组PINK1、Parkin蛋白表达增加,烫枳实组p62蛋白表达提高、Beclin-1蛋白表达降低,枳实组Beclin-1蛋白表达降低。结论枳实、麸炒枳实和烫枳实治疗FD的作用机制可能与抑制PINK1/Parkin信号通路激活有关,麸炒枳实对FD大鼠的治疗效果优于枳实和烫枳实。

基于FOXO1/PINK1信号通路探讨线粒体自噬在胰岛细胞衰老促进肥胖型糖尿病中的机制

目的基于FOXO1/PINK1信号通路介导的线粒体自噬,探究胰岛细胞衰老在肥胖型糖尿病中的可能作用机制。方法将30只SD大鼠随机分为对照组、肥胖型糖尿病组、FOXO1激活组,每组10只。观察记录各组大鼠的一般状态,葡萄糖检测试剂盒检测各组大鼠血糖水平,ELISA试剂盒、透射电镜检测并观察各组大鼠胰岛素水平,RT-qPCR、Western blot检测各组大鼠胰脏组织中自噬通路相关蛋白FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ及衰老相关蛋白p16、p21、Rb mRNA及蛋白水平。结果与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠胰脏组织中FOXO1、PINK1、Parkin、LC3ⅡmRNA、蛋白水平减少(P<0.05)。与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠每日摄食量、饮水量及尿量均增加(P<0.05);与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠每日摄食量、饮水量及尿量均减少(P<0.05)。与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素含量增加,胰岛素敏感指数减少(P<0.05);与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素含量减少,胰岛素敏感指数增加(P<0.05)。透射电镜结果显示,与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠胰岛β细胞中胰岛素颗粒数量显著增加;与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠胰岛β细胞中胰岛素颗粒数量显著减少。与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠胰脏组织中FOXO1、PINK1、Parkin、LC3ⅡmRNA水平减少(P<0.05);与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠FOXO1、PINK1、Parkin、LC3ⅡmRNA水平增加(P<0.05)。与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠胰脏组织中衰老相关基因p16、p21、Rb mRNA、蛋白水平增加(P<0.05);与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠p16、p21、Rb mRNA、蛋白水平减少(P<0.05)。结论激活FOXO1可激活肥胖型糖尿病大鼠胰腺组织中的线粒体自噬,下调胰岛细胞衰老相关基因,改善大鼠的一般状态肌血糖指标,这可能与FOXO1/PINK1信号通路介导的线粒体自噬相关。

针刺对抑郁大鼠海马PINK1-Parkin信号通路介导线粒体自噬表达的影响

目的:通过观察针刺“上星”“风府”穴对慢性不可预测性轻度应激(CUMS)抑郁模型大鼠海马PINK1-Parkin信号通路介导线粒体自噬表达的影响,探讨针刺抗抑郁的潜在机制。方法:40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、针刺组和氟西汀组,每组10只。采用CUMS结合孤养制备抑郁模型,共28 d。对照组常规饲养,针刺组于造模前1 h取“上星”“风府”穴针刺治疗,留针20 min,隔日针刺,共14次。氟西汀组于造模前1 h灌胃给予氟西汀(0.21 mg/mL)治疗,每日1次,持续28 d。记录大鼠每周体质量,并通过旷场实验和强迫游泳实验评估其抑郁样行为;Western Blot和RT-PCR分别检测大鼠海马PINK1-Parkin通路蛋白和m RNA的表达。免疫荧光检测大鼠海马中线粒体外膜转位酶复合体20(TOM20)和细胞色素氧化酶(COXⅣ)的表达。结果:与模型组比较,针刺组与氟西汀组大鼠不动时间显著减少(P<0.01),LC3蛋白与mRNA表达显著降低(P<0.05),TOM20和COXⅣ的表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论:针刺可能通过PINK1-Parkin信号通路介导线粒体自噬起到抗抑郁作用。

清肾颗粒对大鼠NRK-52E细胞转分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影响

目的 探讨TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型中miR-23b对PINK1/Parkin通路的靶向调节机制,并阐明清肾颗粒含药血清对NRK-52E细胞转分化的干预机理。方法 采用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱法对清肾颗粒进行全指纹图谱分析。构建TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型,转染siRNA后分为模拟物空载对照组、miR-23b-5p模拟物组、抑制剂空载对照组、miR-23b-5p抑制剂组,观察miR-23b-5p对PINK1表达量的影响。再将NRK-52E细胞分组为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组,Western blot法检测NRK-52E细胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表达,RT-qPCR法检测NRK-52E细胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与PINK1的靶向关系。结果 UPLC指纹图谱法鉴定出清肾颗粒中11个活性成分。miR-23b-5p过表达后,PINK1 mRNA表达量也显著增加(P<0.05);而miR-23b-5p表达沉默后,PINK1 mRNA表达量也显著减少(P<0.05)。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-PINK1-WT荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-PINK1-mut荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清干预实验发现,TGF-β1组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显低于正常组,P62和α-SMA表达明显高于正常组(P<0.05)。清肾颗粒组和miR-23b-mimic组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显高于TGF-β1组,P62和α-SMA表达明显低于TGF-β1组(P<0.05)。miR-23b-mimic+清肾颗粒组的表现更优于miR-23b-mimic组(P<0.05)。结论 清肾颗粒能够上调NRK-52E细胞内miR-23b-5p表达,并通过增强PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬活性,抑制NRK-52E细胞转分化进程。

苍术素调节PINK1/Parkin信号通路对膝骨关节炎大鼠线粒体自噬的影响

目的:探讨苍术素对膝骨关节炎(KOA)大鼠线粒体自噬的影响以及PINK1/Parkin信号通路在此过程中的作用。方法:采用关节腔内注射碘乙酸钠法构建KOA模型。将SD大鼠按随机数表法分为对照组、模型组、(低、高)剂量苍术素组(KOA模型建模成功后腹腔分别注射3mg/kg、6mg/kg苍术素)和高剂量苍术素+自噬抑制剂(3-MA)组(KOA模型建模成功后腹腔注射6mg/kg苍术素+15mg/kg 3-MA),每组16只。ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、软骨寡聚基质蛋白(COMP)水平;番红O-固绿染色检测大鼠膝关节软骨组织病理学改变,并进行Mankin’s评分;TUNEL染色检测大鼠膝关节软骨细胞凋亡率;DHE荧光探针检测大鼠膝关节软骨组织中ROS水平;免疫组化检测大鼠膝关节软骨组织中cleaved Caspase-3、LC3阳性表达;Western Blot检测大鼠膝关节软骨组织中自噬以及PINK1/Parkin通路相关蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平、膝关节软骨组织中Mankin’s评分、细胞凋亡率、ROS水平、cleaved Caspase-3和LC3阳性细胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平均升高(P<0.05),且存在明显的膝关节软骨病理损伤;与模型组比较,(低、高)剂量苍术素组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平以及膝关节软骨组织中Mankin’s评分、细胞凋亡率、ROS水平、cleaved Caspase-3阳性细胞比例降低(P<0.05),而LC3阳性细胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平进一步升高(P<0.05),且膝关节软骨病理损伤有所减轻;与高剂量苍术素组比较,高剂量苍术素+3-MA组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平以及膝关节软骨组织中Mankin’s评分、细胞凋亡率、ROS水平、cleaved Caspase-3阳性细胞比例升高(P<0.05),而LC3阳性细胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平降低(P<0.05),且膝关节软骨病理损伤加重。结论:苍术素可能通过激活PINK1/Parkin信号通路增强KOA大鼠膝关节软骨线粒体自噬,并减少软骨细胞凋亡,从而改善膝关节软骨退变。

葫芦巴碱通过Pink1/Parkin信号通路介导线粒体自噬对OGD/R诱导的神经元凋亡的影响

目的:探究葫芦巴碱通过PTEN诱导性激酶蛋白1(Pink1)/E3泛素连接酶(Parkin)信号通路介导线粒体自噬对氧-糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的神经元凋亡的影响。方法:原代培养大鼠海马神经元,经下调Pink1或葫芦巴碱预处理后通过OGD/R诱导神经元损伤,实验分组包括对照组、OGD/R组、葫芦巴碱组、pLKO空载体组(转染pLKO空载体)、pLKO-Pink1组(转染连接Pink1 shRNA干扰质粒的pLKO载体)、葫芦巴碱+pLKO-Pink1组。Annexin V-FITC/PI双染法测定神经元凋亡率;JC-1法测定线粒体膜电位(MMP);Calcein-AM法测定线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放程度;透射电镜观察自噬小体数量;Western Blot检测线粒体自噬相关蛋白(微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Pink1、Parkin)表达。结果:与对照组相比,OGD/R组神经元凋亡率、MPTP开放程度增加,MMP下降,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达增加(P<0.05);与OGD/R组相比,葫芦巴碱组神经元凋亡率、MPTP开放程度减少,MMP升高,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达增加(P<0.05),pLKO-Pink1组与葫芦巴碱组趋势相反;与葫芦巴碱组相比,葫芦巴碱+pLKO-Pink1组神经元凋亡率、MPTP开放程度增加,MMP下降,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达减少(P<0.05)。结论:葫芦巴碱可抑制OGD/R诱导的神经元凋亡,可能通过激活Pink1/Parkin信号通路上调线粒体自噬而实现。

葛根素调节PINK1/parkin信号通路对横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤的影响

目的 探讨葛根素是否可通过调节PTEN诱导激酶1/帕金森病相关基因(PINK1/parkin)信号通路影响横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠线粒体自噬。方法 将60只SPF级成年雄性SD大鼠分为正常组(等量生理盐水)、模型组(50%甘油10 mL/kg)、葛根素低剂量组(葛根素50 mg/kg)、葛根素中剂量组(葛根素100 mg/kg)、葛根素高剂量组(葛根素200 mg/kg)、3-MA组(腹腔注射3-MA 15 mg/kg),每组10只。3-MA组灌胃葛根素200 mg/kg同时腹腔注射15 mg/kg自噬抑制剂3-MA,各给药组连续灌胃给药7 d后,除正常组外其余各组大鼠在双侧后肢肌肉一次性注射50%甘油10 mL/kg,建立横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠模型。血清生化分析血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)和肌酐磷酸激酶(CK)水平;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)水平;HE染色法观察大鼠肾组织病理变化;试剂盒法测量大鼠肾脏组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平;透射电子显微镜观察大鼠线粒体和自噬小体变化;免疫荧光法检测肾脏组织LC3和线粒体的共定位信号变化;Western Blot检测大鼠肾组织LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表达。结果 与正常组相比,模型组大鼠血清SCr、BUN、CK、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高,肾脏组织可见明显肾小球、肾小管扩张,出现空泡化、间质水肿以及炎性细胞浸润,肾脏组织病理学损伤评分、MDA、ROS水平,LC3标记的自噬小体与COX4标记的线粒体共定位信号以及LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表达升高,SOD、GSH水平降低(均P<0.05),并可观察到大鼠肾脏明显的线粒体肿胀,线粒体脊紊乱、断裂或消失,伴有明显的空泡变性,并有少量自噬小体形成;与模型组相比,葛根素低、中、高剂量组血清SCr、BUN、CK、TNF-α、IL-1β、IL-6水平,肾脏组织病理学损伤评分、MDA、ROS水平明显降低,SOD、GSH水平升高,LC3标记的自噬小体与COX4标记的线粒体共定位信号以及LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表达进一步升高(均P<0.05),并且大鼠肾损伤和线粒体损伤明显减轻,自噬小体数量显著增加;与葛根素高剂量组相比,自噬抑制剂3-MA明显增加横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠炎症反应和氧化应激反应,加重大鼠肾损伤和线粒体损伤,减少自噬。结论 葛根素可通过PINK1/Parkin通路增强横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠线粒体自噬,进而减轻大鼠肾损伤。

健肝消脂方调控PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬治疗非酒精性脂肪肝

[目的]探究健肝消脂方(Jian’gan Xiaozhi Decoction,JGXZ)对非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型小鼠的药效作用,并从人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素-蛋白连接酶(Parkin)信号通路介导的线粒体自噬角度探究其作用机制。[方法]60只C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后,随机分为6组,包括正常组(Control),模型组(NAFLD),多烯磷脂酰胆碱胶囊组(polyene phosphatidyl choline,PPC)和JGXZ低、中、高剂量组。除正常组外,另外5组均给予高脂饮食。治疗过程持续8周,每周统计小鼠体质量,8周后采集小鼠血液,分离血清,测定丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平;小鼠肝脏称重后固定,取同一部位进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)与油红O染色,观察肝组织病理学变化;采用试剂盒检测肝组织中的甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,以评估JGXZ对NAFLD小鼠炎症反应及氧化应激的影响;免疫印迹法检测电压依赖性阴离子通道蛋白1(voltage dependent anion channel 1,VDAC1)、线粒体外膜转位酶20(translocase of outer mitochondrial membrane 20,TOM20)、细胞色素C氧化酶Ⅳ亚型(cytochrome c oxidase subunitⅣ,COXⅣ)、PINK1、Parkin、苄氯素1(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(light chain 3,LC3)以及选择性自噬接头蛋白P62(prostacyclin 62,P62)蛋白表达,以评估JGXZ对NAFLD模型小鼠线粒体自噬的影响。[结果]与模型组比较,JGXZ干预明显提升NAFLD模型小鼠体质量,降低肝指数,缓解NAFLD模型小鼠肝组织病变,降低TC、TG、ALT、AST水平,降低IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA的水平,提高了GSH-Px、SOD活性,下调VDAC1、TOM20、COXⅣ以及P62蛋白表达,上调PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达。[结论]JGXZ可以通过促进PINK1/Parkin信号通路,介导线粒体自噬激活,缓解NAFLD小鼠肝损伤。

基于PINK1/Parkin信号通路探讨丹黄散在糖尿病小鼠溃疡创面愈合中的作用

目的:基于同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(PINK1)/帕金森蛋白(Parkin)信号通路探讨丹黄散在糖尿病小鼠溃疡创面愈合中的作用。方法:选取18只SPF级雄性db/db小鼠,随机分为模型组、生长因子组、丹黄散组,每组6只,另选取6只SPF级雄性db/m小鼠作为空白组,各组小鼠均构建糖尿病溃疡模型。空白组与模型组小鼠以0.9%氯化钠溶液清创并用无菌纱布覆盖创面,生长因子组与丹黄散组小鼠在其基础上分别外敷表皮生长因子凝胶和丹黄散。观察比较各组小鼠溃疡创面愈合情况及PINK1/Parkin信号通路关键蛋白表达水平。结果:模型组第7、14、21天的创面愈合率明显低于丹黄散组、生长因子组(均P<0.05);HE染色和电镜观察创面组织,相较于模型组,生长因子组、丹黄散组创面肉芽组织病理改变明显减轻,大量成纤维细胞增生,致密分布,出现少量新生毛细血管,PINK1、Pakin和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平均明显增加(均P<0.05)。结论:丹黄散可促进糖尿病小鼠溃疡创面愈合,可能通过调节PINK1/Pakrin信号通路进而调控线粒体自噬,保护线粒体功能,促进血管新生和肉芽组织生长,加快创面愈合。

丹黄散激活PINK 1/Parkin信号通路对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的影响

目的基于PINK 1/Parkin信号通路探究丹黄散对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的作用,并探讨其具体的作用机制。方法将人脐静脉血管内皮细胞进行体外培养,随机分为对照组、生长因子组、丹黄散组、高糖组、高糖+生长因子组、高糖+丹黄散组,每组3例,干预48 h;细胞划痕实验检测细胞转移率,Transwell实验检测细胞侵袭率;免疫荧光法测定抗凋亡蛋白Bcl-2、Beclin-1、促凋亡蛋白Bax的表达水平;Western blot技术测定假定激酶(PINK 1)、帕金森病蛋白(Parkin)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC 3-Ⅱ)的蛋白表达水平。结果细胞划痕实验、Transwell实验结果显示,在正常环境下及高糖处理后,丹黄散均可降低细胞的细胞转移率和侵袭率(P<0.05);荧光免疫法结果显示,在正常环境下及高糖处理后,丹黄散均可上调细胞中的Bcl-2、Beclin-1蛋白表达水平(P<0.05);Western blot结果显示,在正常环境下及高糖处理后,丹黄散均可下调Bax的蛋白表达水平(P<0.05),升高细胞中的PINK 1、Parkin和LC 3-Ⅱ蛋白表达水平(P<0.05),且丹黄散效果均明显优于空白血清和生长因子(P<0.05)。结论丹黄散可通过激活PINK 1/Parkin通路,减缓高糖诱导的血管内皮细胞损伤,其机制可能与丹黄散促进线粒体自噬进而增强损伤修复有关。

祛痰活血方调控PINK1/Parkin信号通路诱导NASH大鼠肝细胞自噬的实验研究

目的:探讨祛痰活血方通过调控PINK1/Parkin信号通路诱导肝细胞自噬改善非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝损伤的作用机制。方法:雄性SD大鼠30只,随机分为对照组、模型组和祛痰活血方低、中、高剂量组,每组6只。对照组大鼠给予普通饲料,其余各组大鼠予高脂饮食,造模8周。祛痰活血方低、中、高剂量组大鼠连续给药4周后,处死各组大鼠,称量并记录大鼠体质量及肝质量,测定肝功能及血脂水平,观察各组大鼠肝组织病理变化和肝内脂质沉积情况,透射电镜下记录各组大鼠肝组织脂滴和自噬小体数量,检测各组大鼠肝组织自噬蛋白PINK1、Parkin、SQSTM1表达以及PINK1/Parkin信号通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠体重增加,行动迟缓;祛痰活血方治疗后大鼠一般情况好转,体重、肝重减轻。模型组大鼠肝功能指标和血脂水平高于对照组,祛痰活血方治疗后大鼠ALT、AST、TG、TC下降。透射电镜观察,对照组和模型组大鼠肝组织均未见明显自噬体,模型组大鼠肝组织可见大量脂滴,祛痰活血方治疗后大鼠肝组织自噬小体数量增加、脂滴数量减少且体积变小。免疫组织化学法检测,对照组大鼠肝组织SQSTM1无阳性表达,PINK1、Parkin阳性表达较低;与对照组相比,模型组大鼠肝组织PINK1、Parkin无阳性表达,SQSTM1表达较高;与模型组相比,祛痰活血方治疗后,大鼠肝组织PINK1、Parkin阳性表达增加,SQSTM1表达降低。蛋白免疫印迹分析,模型组大鼠肝组织自噬蛋白PINK1、Parkin、SQSTM1表达减低,祛痰活血方治疗后大鼠肝组织PINK1、Parkin、SQSTM1表达增加。结论:祛痰活血方可能通过调控PINK1/Parkin信号通路诱导肝细胞自噬,减轻肝细胞炎症及肝组织脂质沉积,从而发挥治疗NASH的作用。

细叶远志皂苷通过Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤对PINK1-Parkin介导的线粒体自噬的影响

目的 探讨细叶远志皂苷(tenuifolin, TEN)对Aβ_(25-35)(淀粉样蛋白片段)诱导PC12细胞损伤对线粒体自噬的影响。方法 设立不同浓度TEN组,干预Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤模型,MTT及流式细胞术检测确立细胞保护浓度。实验分为空白组、模型组、TEN组。JC-1测线粒体膜电位,Western Blot检测PINK1、Parkin、LC3II/I、p62蛋白的表达。结果 与空白组比较,模型组线粒体膜电位下降,PINK1、Parkin、 LC3II/I和蛋白表达升高,P62蛋白表达下降;与模型组比较,TEN组细胞线粒体膜电位上调,PINK1、Parkin和LC3II/I蛋白表达降低,P62蛋白表达升高。结论 细叶远志皂苷能减轻Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞损伤,其机制可能与调控PINK1-Parkin介导的粒体自噬途径相关。

PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在力学失衡诱导终板软骨退变中的作用

目的 检测脊柱失稳诱导终板软骨退变模型大鼠中线粒体自噬水平的变化,探讨PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在终板软骨以及椎间盘退变中的作用。方法 通过手术切除大鼠L2~L5棘上、棘间韧带,咬除L2~L5两侧关节突,构建大鼠脊柱失稳模型。18只SD大鼠分为正常组、退变组及羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)组,每组6只。正常组大鼠无特殊处理,退变组大鼠构建大鼠脊柱失稳模型,CCCP组大鼠在构建大鼠脊柱失稳模型后于椎间盘注射5μL CCCP (10μmol/L)。利用HE染色观察终板软骨及椎间盘形态变化,番红-固绿染色观察终板软骨细胞外基质变化。RT-PCR检测各组大鼠终板软骨组织中Ⅱ型胶原(COL-2A)、蛋白聚糖(ACAN)、PINK1、Parkin mRNA表达水平;Western blot检测COL-2A、ACAN、PINK1、Parkin及线粒体膜蛋白Tomm20、Timm23蛋白表达水平变化。结果 与正常组比较,退变组大鼠椎间盘髓核破坏明显,终板软骨细胞外基质分泌减少;CCCP组大鼠椎间盘结构较完整,终板软骨细胞外基质分泌较退变组明显增多。与正常组比较,退变组大鼠终板软骨组织COL-2A、ACAN表达均明显下调(P<0.05),线粒体自噬相关基因PINK1和Parkin表达显著降低(P<0.05),线粒体膜蛋白Tomm20及Timm23表达增高(P<0.05);CCCP组大鼠终板软骨组织COL-2A、ACAN、PINKI及Parkin表达较退变组均明显上调(P<0.05),Tomm20及Timm23蛋白水平较退变组明显下调(P<0.05)。结论 大鼠脊柱失稳导致终板软骨PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬水平降低,从而诱导终板软骨及椎间盘退变,激活线粒体自噬能够明显减轻终板软骨及椎间盘退变。

活血荣络方对脑缺血再灌注损伤大鼠PINK1/Parkin信号通路的影响

目的观察活血荣络方对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠PINK1/Parkin信号通路的影响,从线粒体自噬角度探讨其干预CIRI的作用机制。方法40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、活血荣络方(HXRLF)组和自噬激活剂(RAP)组,采用线栓法建立CIRI大鼠模型。HXRLF组于造模前36 h开始灌胃活血通络方药液11.7 g/kg,每24 h灌胃1次,共3次;RAP组于再灌注同时腹腔注射雷帕霉素1.5 mg/kg。再灌注24 h后,对大鼠神经功能进行评分,尼氏染色检测大鼠皮质区完整神经元数目,JC-1荧光探针检测皮质区线粒体膜电位(MMP),透射电镜观察大鼠皮质区超微结构,免疫组化和Western blot检测皮质区p62、LC3B、TOMM20蛋白表达,Western blot和RT-PCR分别检测皮质区PTEN诱导激酶1(PINK1)、帕金蛋白(Parkin)蛋白和mRNA水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分明显升高,神经功能缺损严重;皮质区完整神经元数量明显减少,自噬小体数目增多,MMP降低;皮质区p62、LC3B蛋白表达升高,TOMM20蛋白表达降低,PINK1、Parkin蛋白和mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,HXRLF组和RAP组大鼠神经功能评分明显降低,神经功能缺损改善;皮质区完整神经元数量明显增多,自噬小体数目增多,MMP升高;皮质区p62、TOMM20蛋白表达降低,LC3B蛋白表达升高,PINK1、Parkin蛋白和mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论活血荣络方可能通过激活PINK1/Parkin信号通路上调线粒体自噬,减轻大鼠神经功能损害,从而发挥神经保护作用。

滋肾活血方通过PINK1/Parkin信号通路增加自噬对血管性痴呆大鼠的影响

目的观察滋肾活血方对血管性痴呆(vascular dementia, VD)大鼠海马组织自噬标记蛋白LC3Ⅱ、Beclin1以及自噬调控PINK1/Parkin信号通路的影响。方法改良2-VO法建立VD大鼠模型,采用滋肾活血方进行干预,免疫组化法检测VD大鼠海马组织LC3Ⅱ、Beclin1、PINK1以及Parkin蛋白的表达。结果滋肾活血方能显著提高VD大鼠海马组织自噬标记蛋白LC3Ⅱ、Beclin1以及自噬调控PINK1/Parkin信号分子的表达(P<0.01)。结论滋肾活血方可能通过激活PINK1/Parkin信号通路,促进细胞自噬,保护VD大鼠海马神经元,改善其学习记忆能力。

香兰素通过抑制自噬及PINK1信号通路改善新生大鼠低氧缺血性脑损伤与炎症反应

目的探讨香兰素(vanillin,Van)对新生大鼠低氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)的影响及作用机制。方法将7日龄SD大鼠根据改良的Rice-Vannucci法构建HIBD模型,将120只新生大鼠随机分为5组:假手术(Sham)组、HIBD组、HIBD+Van(20 mg·kg^(-1))组、HIBD+Van(40mg·kg^(-1))、HIBD+Van(80 mg·kg^(-1))组,每组30只,香兰素处理组大鼠分别按照对应剂量腹腔内注射香兰素,每12h注射一次,连续注射2d,假手术组和HIBD组大鼠同时注射等量无菌生理盐水。48h后将各组大鼠麻醉后断头处死,收集脑组织计算脑组织含水量,TTC染色检测梗死面积,苏木精-伊红染色观察脑组织病理学变化,酶联免疫吸附法(enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)检测脑组织中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)及肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor,TNF-α)含量,免疫荧光染色检测脑组织微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3)表达,蛋白质印迹(Western blot)检测脑组织自噬相关蛋白表达,实时定量PCR和Western blot检测PTEN诱导假定激酶1(PTEN induced putative kinase1,PINK1)mRNA与蛋白表达。结果与Sham组比较,HIBD组大鼠脑组织含水量显著增加(P<0.05),脑梗死面积显著增加(P<0.05),炎症细胞因子TNF-α、IL-1β与IL-6含量显著增加而抗炎因子IL-10含量显著降低(P<0.05),LC3荧光表达强度增加,Beclin-1蛋白表达水平和LC3-II/LC3-I比值显著升高(P<0.05),P62蛋白表达水平显著下降(P<0.05),同时,脑组织中PINK1mRNA与蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)。与HIBD组比较,不同剂量香兰素(20 mg·kg^(-1)、40 mg·kg^(-1)、80 mg·kg^(-1))作用下,大鼠脑组织含水量显著下降(P<0.05),脑梗死面积显著减小(P<0.05),炎症细胞因子TNF-α、IL-1β与IL-6含量显著下降而抗炎因子IL-10含量显著升高(P<0.05),LC3荧光表达强度减弱,Beclin-1蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低(P<0.05),P62蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而PINK1mRNA与蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05)。结论香兰素具有改善新生大鼠低氧缺血性脑损伤、减轻炎症反应的作用,其机制可能抑制自噬及PINK1信号途径激活相关。

基于PINK1/Parkin信号通路研究细叶远志皂苷对AD模型小鼠脑组织线粒体自噬的影响

目的:探讨细叶远志皂苷(TEN)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠脑组织线粒体自噬的影响。方法:将50只雄性APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、TEN中剂量+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组[TEN 40 mg/(kg·d)+自噬抑制剂3-MA 30 mg/(kg·d)]和TEN低、中、高剂量组[20、40、80 mg/(kg·d)],每组10只;另将10只同系野生型小鼠作为正常对照组。各给药组小鼠灌胃相应药液,正常对照组和模型组小鼠灌胃0.3%羧甲基纤维素钠溶液,每天给药1次,给药体积为0.01 mL/g,连续给药3个月。末次给药后,检测神经元内微管相关蛋白1轻链3(LC3)的阳性表达水平[以积分光密度(IOD)计],脑组织线粒体中LC3、泛素结合蛋白p62、Cathepsin D、Rab7、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导的假定激酶1(PINK1)、E3泛素连接酶(Parkin)mRNA的表达量和LC3、p62、PINK1、Parkin蛋白的表达量。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠神经元内LC3的IOD值和脑组织线粒体中LC3、p62、PINK1、Parkin mRNA及其蛋白的表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01),Cathepsin D、Rab7 mRNA的表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,TEN低、中、高剂量组小鼠神经元内LC3的IOD值(除TEN低、中剂量组外)和脑组织线粒体中LC3、Cathepsin D、Rab7、PINK1(除TEN低剂量组外)、Parkin(除TEN低剂量组外)mRNA的表达量以及LC3(除TEN中剂量组外)、PINK1(除TEN高剂量组显著降低外)、Parkin(除TEN低剂量组显著降低外)蛋白的表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01),p62 mRNA(除TEN低剂量组外)及其蛋白的表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与TEN中剂量组比较,TEN中剂量+3-MA组小鼠上述指标的变化均被显著抑制(P<0.05或P<0.01)。结论:TEN可通过激活PINK1/Parkin信号通路来诱导AD模型小鼠脑组织线粒体自噬,增强溶酶体功能。

PINK1/parkin信号通路介导的线粒体自噬在心力衰竭中的作用

心力衰竭(heart failure,HF)简称心衰,是心脏功能发生障碍导致心室泵血功能受损引起的循环障碍症候群。心衰是各种心血管病程的终末期阶段,具有发病率高、住院率高和死亡率高的特点[1]。随着人口老龄化加快,各种常见心血管病发病率增高,心衰的患病率也在逐渐上升。目前,我国35岁以上的成年人心衰的患病率为1.3%,较2000年增加了44%[2]。