积雪草苷调控SIRT1-FOXO3-PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬保护肾缺血再灌注损伤的机制研究

目的探讨积雪草苷(AC)调控沉默信息调节因子1(SIRT1)-叉头盒转录因子O3(FOXO3)-PTEN诱导性激酶蛋白1(PINK1)-E3泛素连接酶(Parkin)通路介导线粒体自噬对肾缺血再灌注损伤(RIRI)的保护作用及机制。方法采用随机数字表法将50只雄性SD大鼠分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、AC组、AC+SIRT1抑制剂(EX-527)组、EX-527组,每组10只。构建RIRI模型;AC组造模前予以AC混悬液80 mg/(kg·d)连续灌胃4周;AC+EX-527组造模前3 d予以含EX-527(5 mg/kg)的1%DMSO溶液腹腔注射,术中再灌注前20 min腹腔注射1次,余处理同AC组;EX-527组仅予以等量含EX-527的1%DMSO溶液腹腔注射。造模24 h后取材,检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平,HE染色观察肾组织病理改变及评分,Western blot检测组织SIRT1、FOXO3、PINK1、Parkin通路蛋白和自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)A/B-Ⅰ、LC3A/B-Ⅱ表达水平,并计算(LC3A/B-Ⅱ)/(LC3A/B-Ⅰ);紫外分光光度法检测组织ATP含量;JC染色法检测线粒体膜电位变化。结果与Sham组比较,Model组Scr、BUN水平升高,肾组织发生病理损伤,通路及自噬相关蛋白表达量出现不同程度升高,ATP含量减少,线粒体膜电位水平下降(P<0.05);相比Model组,AC组Scr、BUN水平明显降低,肾组织病理损伤减轻,通路及自噬相关蛋白表达水平升高,ATP含量增高,线粒体膜电位升高(P<0.05);与AC组比较,经EX-527干预的AC+EX-527、EX-527组Scr、BUN水平出现不同程度升高,组织病理损伤加重现象,通路及自噬相关蛋白表达量均减少,ATP含量减少,线粒体膜电位水平下降(P<0.05),EX-527组程度较为明显。结论AC通过上调SIRT1-FOXO3-PINK1-Parkin信号通路蛋白表达,促进线粒体自噬来改善肾组织细胞线粒体功能,抑制细胞凋亡,对RIRI起到保护作用。

基于PINK1-Parkin线粒体自噬通路探讨海昆肾喜含药血清对N2a/APP695细胞的神经保护作用

目的研究海昆肾喜(haikun shenxi,HKSX)含药血清对N2a/APP695细胞的神经保护作用及机制。方法制备HKSX含药血清,高效薄层色谱(high performance thin layer chromatography,HPTLC)对其成分进行分析。应用含药血清干预N2a/APP695细胞,MTT检测HKSX含药血清的细胞毒性;ELISA检测Aβ_(1-42)含量;JC-1法检测线粒体膜电位、DCFH-DA法检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)、ATP检测试剂盒检测三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)评价线粒体功能;免疫印迹法(Western blot)检测PTEN诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)、Parkin、p62、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated-proteinlight chain-3,LC3)及p-Tau S396蛋白的表达;设置线粒体自噬抑制剂Mdivi-1干预组,Western blot检测PINK1、Parkin、p-Tau S396蛋白表达,ELISA检测Aβ_(1-42)含量,验证HKSX的神经保护作用是否与线粒体自噬密切相关。结果与模型对照组(MC)相比,HKSX低、中、高剂量组Aβ_(1-42)含量明显降低,高剂量组尤为明显(P<0.01);线粒体膜电位及ROS含量明显降低(P<0.01)、ATP含量升高(P<0.01);PINK1、Parkin(P<0.01)及LC3Ⅱ(P<0.01)的表达增加,而p62的表达降低(P<0.01),p-Tau S396蛋白亦降低(P<0.01);而Mdivi-1的干预,在很大程度上抑制了HKSX对PINK1、Parkin蛋白的活化(P<0.01)及对p-Tau S396和Aβ_(1-42)的清除(P<0.01),表明HKSX的神经保护作用依赖于PINK1-Parkin信号通路。结论HKSX能够提高线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin蛋白的表达,激活线粒体自噬,提高线粒体功能,抑制Aβ及p-Tau S396蛋白在神经细胞中的沉积,发挥神经保护作用,从而起到防治AD的效果。

清肾颗粒对大鼠NRK-52E细胞转分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影响

目的 探讨TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型中miR-23b对PINK1/Parkin通路的靶向调节机制,并阐明清肾颗粒含药血清对NRK-52E细胞转分化的干预机理。方法 采用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱法对清肾颗粒进行全指纹图谱分析。构建TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型,转染siRNA后分为模拟物空载对照组、miR-23b-5p模拟物组、抑制剂空载对照组、miR-23b-5p抑制剂组,观察miR-23b-5p对PINK1表达量的影响。再将NRK-52E细胞分组为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组,Western blot法检测NRK-52E细胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表达,RT-qPCR法检测NRK-52E细胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与PINK1的靶向关系。结果 UPLC指纹图谱法鉴定出清肾颗粒中11个活性成分。miR-23b-5p过表达后,PINK1 mRNA表达量也显著增加(P<0.05);而miR-23b-5p表达沉默后,PINK1 mRNA表达量也显著减少(P<0.05)。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-PINK1-WT荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-PINK1-mut荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清干预实验发现,TGF-β1组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显低于正常组,P62和α-SMA表达明显高于正常组(P<0.05)。清肾颗粒组和miR-23b-mimic组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显高于TGF-β1组,P62和α-SMA表达明显低于TGF-β1组(P<0.05)。miR-23b-mimic+清肾颗粒组的表现更优于miR-23b-mimic组(P<0.05)。结论 清肾颗粒能够上调NRK-52E细胞内miR-23b-5p表达,并通过增强PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬活性,抑制NRK-52E细胞转分化进程。

麝香保心丸调节PINK1/Parkin信号通路对糖尿病视网膜病变大鼠的影响

[目的]探讨麝香保心丸(SBP)对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠线粒体自噬及PTEN诱导激酶蛋白1(PINK1)/细胞质E3-泛素连接酶(Parkin)信号通路的影响。[方法]建立DR大鼠模型,将大鼠随机分为正常组(Control组)、模型组(DR组)、麝香保心丸低剂量组(SBP-L组)、麝香保心丸高剂量组(SBP-H组)、麝香保心丸高剂量+雷帕霉素组(SBP-H+RAP组)。检测各组大鼠空腹血糖(FPG)及总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠DR情况;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组大鼠血管内皮生长因子(VEGF)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)水平;透射电镜观察各组大鼠细胞线粒体形态;免疫组化检测线粒体自噬相关蛋白选择性自噬接头蛋白sequestosome-1(SQSTM1/P62)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)的表达;蛋白免疫印迹法检测各组大鼠PINK1、Parkin蛋白表达。[结果]与Control组比较,DR组视网膜结构破坏严重,细胞排列紊乱,水肿明显,细胞间隙变宽,线粒体损伤、肿胀明显,形态异常,FPG、TC、TG、LDL-C、VEGF、HMGB1、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平显著升高,SQSTM1/P62表达水平显著降低(P<0.05);与DR组比较,SBP-L组、SBP-H组视网膜细胞结构改善,细胞排列逐渐整齐,细胞水肿减轻,细胞、线粒体形态均趋于正常,线粒体肿胀减轻,FPG、TC、TG、LDL-C、VEGF、HMGB1、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平显著降低,SQSTM1/P62表达水平显著升高(P<0.05);与SBP-H组相比,SBP-H+RAP组视网膜细胞结构破坏加重,细胞排列紊乱,水肿明显,线粒体肿胀加重,形态异常,FPG、TC、TG、LDL-C、VEGF、HMGB1、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平显著升高,SQSTM1/P62表达水平显著降低(P<0.05)。[结论]麝香保心丸通过抑制PINK1/Parkin信号通路抑制DR大鼠线粒体自噬。

温针灸干预慢性疲劳综合征大鼠骨骼肌PINK1/Parkin通路的变化

背景:研究发现慢性疲劳综合征患者线粒体的功能异常,给予辅酶后可改善症状,温针灸是治疗该病的重要方法之一,但其作用机制尚不明确。目的:采用温针灸干预慢性疲劳综合征大鼠骨骼肌PINK1/Parkin通路,明确温针灸对慢性疲劳综合征的治疗机制。方法:将32只雄性SD大鼠适应性喂养3 d后随机分为正常组、模型组、温针灸组和辅酶组,每组各8只,除正常组外,其余各组大鼠以游泳力竭、慢性束缚及禁食多因素方法制备慢性疲劳综合征模型。造模成功后正常组、模型组大鼠采取相同固定及灌胃操作,温针灸组大鼠选用关元、中脘、足三里(双)穴进行治疗,1次/d,进针后将艾柱置于针柄点燃,每次治疗3壮,共15 min;辅酶组按照1 mg/kg进行灌胃,1次/d,共治疗14 d。记录实验期间各组大鼠体质量、力竭游泳时间及治疗期间的食物利用率。治疗结束后,取各组大鼠双侧腓肠肌,苏木精-伊红染色法观察各组大鼠腓肠肌病理形态,透射电镜观察各组大鼠腓肠肌线粒体形态结构及自噬体,免疫组化法检测各组大鼠骨骼肌中微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅱ蛋白表达水平,Western blot法检测各组骨骼肌中PINK1、Parkin、LC3蛋白的表达。结果与结论:①与正常组相比,模型组腓肠肌细胞核固缩、凝聚,数目增多,细胞排列紊乱,腓肠肌纤维排列紧密;温针灸组和辅酶组腓肠肌纤维排列间隙较模型组增加,细胞核减少,细胞排列较模型组整齐。②与正常组比较,模型组骨骼肌线粒体肿胀、融合及空泡化,线粒体膜断裂,基质较多溶解,嵴断裂、消失;存在自噬现象。与模型组比较,温针灸组及辅酶组线粒体数量增多,排列相对整齐,线粒体空泡化及线粒体嵴断裂情况改善,膜结构相对完整;存在自噬现象。③与正常组相比,模型组骨骼肌中PINK1蛋白表达上调(P<0.05)、而Parkin、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达稍有上调(P>0.05);与模型组相比,温针灸组和辅酶组骨骼肌中PINK1、Parkin、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显上调(P<0.05),温针灸组蛋白表达上调更为显著。④结果说明,温针灸可能通过激活PINK1/Parkin通路,上调LC3Ⅱ表达,形成线粒体自噬体,促进降解受损线粒体的相关内容物,改善线粒体质量,从而发挥治疗慢性疲劳综合征的作用。

基于FOXO1/PINK1信号通路探讨线粒体自噬在胰岛细胞衰老促进肥胖型糖尿病中的机制

目的基于FOXO1/PINK1信号通路介导的线粒体自噬,探究胰岛细胞衰老在肥胖型糖尿病中的可能作用机制。方法将30只SD大鼠随机分为对照组、肥胖型糖尿病组、FOXO1激活组,每组10只。观察记录各组大鼠的一般状态,葡萄糖检测试剂盒检测各组大鼠血糖水平,ELISA试剂盒、透射电镜检测并观察各组大鼠胰岛素水平,RT-qPCR、Western blot检测各组大鼠胰脏组织中自噬通路相关蛋白FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ及衰老相关蛋白p16、p21、Rb mRNA及蛋白水平。结果与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠胰脏组织中FOXO1、PINK1、Parkin、LC3ⅡmRNA、蛋白水平减少(P<0.05)。与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠每日摄食量、饮水量及尿量均增加(P<0.05);与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠每日摄食量、饮水量及尿量均减少(P<0.05)。与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素含量增加,胰岛素敏感指数减少(P<0.05);与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素含量减少,胰岛素敏感指数增加(P<0.05)。透射电镜结果显示,与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠胰岛β细胞中胰岛素颗粒数量显著增加;与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠胰岛β细胞中胰岛素颗粒数量显著减少。与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠胰脏组织中FOXO1、PINK1、Parkin、LC3ⅡmRNA水平减少(P<0.05);与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠FOXO1、PINK1、Parkin、LC3ⅡmRNA水平增加(P<0.05)。与对照组相比,肥胖型糖尿病组大鼠胰脏组织中衰老相关基因p16、p21、Rb mRNA、蛋白水平增加(P<0.05);与肥胖型糖尿病组大鼠相比,FOXO1激活组大鼠p16、p21、Rb mRNA、蛋白水平减少(P<0.05)。结论激活FOXO1可激活肥胖型糖尿病大鼠胰腺组织中的线粒体自噬,下调胰岛细胞衰老相关基因,改善大鼠的一般状态肌血糖指标,这可能与FOXO1/PINK1信号通路介导的线粒体自噬相关。

基于PINK1/Parkin通路研究天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠线粒体自噬的影响

目的观察天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠线粒体自噬的影响,探讨其作用机制。方法将30只自发性高血压大鼠随机分为模型组、西药组和中药组,每组10只,将10只正常血压大鼠(Wistar-Kyoto)作为正常组。中药组予天麻芎苓止眩片1.0 g/kg灌胃,西药组予卡托普利7.6 mg/kg灌胃,正常组和模型组灌胃蒸馏水(10 mL/kg),每日1次,连续6周。给药前及给药各周测量大鼠收缩压,HE染色观察胸主动脉组织病理变化,透射电镜观察线粒体结构及自噬体形成,ELISA检测血清活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量,免疫组化染色、Western blot、RT-qPCR分别检测胸主动脉组织PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、E3泛素连接酶(Parkin)、Beclin1蛋白及mRNA表达。结果与正常组比较,模型组大鼠收缩压显著升高(P<0.05),血清ROS、MDA含量显著升高(P<0.05),CAT、SOD、GSH含量显著降低(P<0.05),胸主动脉平滑肌细胞增生、血管壁增厚,线粒体结构破坏,出现大量自噬泡和自噬体,胸主动脉组织PINK1、Parkin、Beclin1蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,西药组和中药组大鼠收缩压显著降低(P<0.05),血清ROS、MDA含量显著降低(P<0.05),CAT、SOD、GSH含量显著升高(P<0.05),胸主动脉平滑肌细胞增生减少,血管壁增厚不明显,自噬泡和自噬体数目显著减少,胸主动脉组织PINK1、Parkin、Beclin1蛋白和m RNA表达显著降低(P<0.05)。结论天麻芎苓止眩片可能通过调节PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬逆转血管内皮氧化应激损伤,维持血管内皮功能稳态,从而发挥降压作用。

苍术素调节PINK1/Parkin信号通路对膝骨关节炎大鼠线粒体自噬的影响

目的:探讨苍术素对膝骨关节炎(KOA)大鼠线粒体自噬的影响以及PINK1/Parkin信号通路在此过程中的作用。方法:采用关节腔内注射碘乙酸钠法构建KOA模型。将SD大鼠按随机数表法分为对照组、模型组、(低、高)剂量苍术素组(KOA模型建模成功后腹腔分别注射3mg/kg、6mg/kg苍术素)和高剂量苍术素+自噬抑制剂(3-MA)组(KOA模型建模成功后腹腔注射6mg/kg苍术素+15mg/kg 3-MA),每组16只。ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、软骨寡聚基质蛋白(COMP)水平;番红O-固绿染色检测大鼠膝关节软骨组织病理学改变,并进行Mankin’s评分;TUNEL染色检测大鼠膝关节软骨细胞凋亡率;DHE荧光探针检测大鼠膝关节软骨组织中ROS水平;免疫组化检测大鼠膝关节软骨组织中cleaved Caspase-3、LC3阳性表达;Western Blot检测大鼠膝关节软骨组织中自噬以及PINK1/Parkin通路相关蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平、膝关节软骨组织中Mankin’s评分、细胞凋亡率、ROS水平、cleaved Caspase-3和LC3阳性细胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平均升高(P<0.05),且存在明显的膝关节软骨病理损伤;与模型组比较,(低、高)剂量苍术素组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平以及膝关节软骨组织中Mankin’s评分、细胞凋亡率、ROS水平、cleaved Caspase-3阳性细胞比例降低(P<0.05),而LC3阳性细胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平进一步升高(P<0.05),且膝关节软骨病理损伤有所减轻;与高剂量苍术素组比较,高剂量苍术素+3-MA组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平以及膝关节软骨组织中Mankin’s评分、细胞凋亡率、ROS水平、cleaved Caspase-3阳性细胞比例升高(P<0.05),而LC3阳性细胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平降低(P<0.05),且膝关节软骨病理损伤加重。结论:苍术素可能通过激活PINK1/Parkin信号通路增强KOA大鼠膝关节软骨线粒体自噬,并减少软骨细胞凋亡,从而改善膝关节软骨退变。

细叶远志皂苷通过Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤对PINK1-Parkin介导的线粒体自噬的影响

目的 探讨细叶远志皂苷(tenuifolin, TEN)对Aβ_(25-35)(淀粉样蛋白片段)诱导PC12细胞损伤对线粒体自噬的影响。方法 设立不同浓度TEN组,干预Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤模型,MTT及流式细胞术检测确立细胞保护浓度。实验分为空白组、模型组、TEN组。JC-1测线粒体膜电位,Western Blot检测PINK1、Parkin、LC3II/I、p62蛋白的表达。结果 与空白组比较,模型组线粒体膜电位下降,PINK1、Parkin、 LC3II/I和蛋白表达升高,P62蛋白表达下降;与模型组比较,TEN组细胞线粒体膜电位上调,PINK1、Parkin和LC3II/I蛋白表达降低,P62蛋白表达升高。结论 细叶远志皂苷能减轻Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞损伤,其机制可能与调控PINK1-Parkin介导的粒体自噬途径相关。

基于PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬探讨泛酸对糖尿病肾病小鼠的影响

目的探讨泛酸是否通过PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬延缓糖尿病肾病(Diabatic kidney disease,DKD)的发展。方法12只雄性糖尿病肾病db/db小鼠适应性喂养2周后,随机分为模型组和泛酸组,各6只;同周龄近交式C57BL/6J小鼠为对照组。泛酸组按照130 mg·kg^(-1)·d^(-1)给予泛酸灌胃,对照组和模型组给予等体积蒸馏水,连续给药8周。实验结束后,采集各组血清、尿液进行生化检测。HE染色和PAS染色观察肾脏病理变化。RT-qPCR和Western-blot分别检测叉头框转录因子O1(FoxO1)、磷酸化叉头框转录因子O1(p-FoxO1)、同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(PINK1)、帕金蛋白(Parkin)mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组空腹血糖、尿微量白蛋白肌酐比值(ACR)水平显著升高,肾小球扩张,糖原沉积;p-FoxO1蛋白表达水平显著升高,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,泛酸组空腹血糖、尿ACR水平显著降低,肾小球扩张、糖原沉积减轻,p-FoxO1蛋白表达水平显著降低,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。结论泛酸有助于降低DKD db/db小鼠尿ACR水平,改善肾脏病理变化,可能是通过调控PINK1/Parkin通路,激活线粒体保护性自噬,延缓糖尿病肾病进展。

蛇床子素通过PINK1/Parkin通路诱导HeLa细胞自噬

目的探讨蛇床子素促进宫颈癌HeLa细胞发生自噬的潜在作用机制。方法不同浓度蛇床子素(0、10、20、40、80、160、240、320 mg·L^(-1))作用于HeLa细胞,MTT法检测蛇床子素对HeLa细胞增殖的抑制作用;透射电镜观察经蛇床子素干预的HeLa细胞形态;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色检测自噬水平;流式细胞术检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;Western blot分析线粒体相关蛋白MFN1、DPR1表达水平;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化;建立裸鼠宫颈癌体内移植瘤模型探讨蛇床子素对宫颈癌的抑制作用;Western blot检测PINK1、Parkin和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平。结果蛇床子素能明显抑制HeLa细胞增殖;通过透射电镜观察,经蛇床子素干预的HeLa细胞有典型的自噬小体形成;MDC染色荧光强度增强,细胞发生自噬;线粒体融合蛋白MFN1表达下调,分裂蛋白DRP1表达上调;JC-1显示线粒体膜电位下降;流式细胞术检测结果显示细胞内ROS水平升高,且能被自噬抑制剂3-MA逆转;裸鼠瘤质量被蛇床子素明显抑制;Western blot结果显示,线粒体自噬关键因子PINK1、Parkin蛋白表达增加,LC3Ⅱ/Ⅰ的比值也增加。结论蛇床子素能诱导HeLa细胞发生自噬,其机制可能与促进HeLa细胞ROS产生和PINK1/Parkin通路有关。

葛根素调节PINK1/parkin信号通路对横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤的影响

目的 探讨葛根素是否可通过调节PTEN诱导激酶1/帕金森病相关基因(PINK1/parkin)信号通路影响横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠线粒体自噬。方法 将60只SPF级成年雄性SD大鼠分为正常组(等量生理盐水)、模型组(50%甘油10 mL/kg)、葛根素低剂量组(葛根素50 mg/kg)、葛根素中剂量组(葛根素100 mg/kg)、葛根素高剂量组(葛根素200 mg/kg)、3-MA组(腹腔注射3-MA 15 mg/kg),每组10只。3-MA组灌胃葛根素200 mg/kg同时腹腔注射15 mg/kg自噬抑制剂3-MA,各给药组连续灌胃给药7 d后,除正常组外其余各组大鼠在双侧后肢肌肉一次性注射50%甘油10 mL/kg,建立横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠模型。血清生化分析血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)和肌酐磷酸激酶(CK)水平;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)水平;HE染色法观察大鼠肾组织病理变化;试剂盒法测量大鼠肾脏组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平;透射电子显微镜观察大鼠线粒体和自噬小体变化;免疫荧光法检测肾脏组织LC3和线粒体的共定位信号变化;Western Blot检测大鼠肾组织LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表达。结果 与正常组相比,模型组大鼠血清SCr、BUN、CK、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高,肾脏组织可见明显肾小球、肾小管扩张,出现空泡化、间质水肿以及炎性细胞浸润,肾脏组织病理学损伤评分、MDA、ROS水平,LC3标记的自噬小体与COX4标记的线粒体共定位信号以及LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表达升高,SOD、GSH水平降低(均P<0.05),并可观察到大鼠肾脏明显的线粒体肿胀,线粒体脊紊乱、断裂或消失,伴有明显的空泡变性,并有少量自噬小体形成;与模型组相比,葛根素低、中、高剂量组血清SCr、BUN、CK、TNF-α、IL-1β、IL-6水平,肾脏组织病理学损伤评分、MDA、ROS水平明显降低,SOD、GSH水平升高,LC3标记的自噬小体与COX4标记的线粒体共定位信号以及LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表达进一步升高(均P<0.05),并且大鼠肾损伤和线粒体损伤明显减轻,自噬小体数量显著增加;与葛根素高剂量组相比,自噬抑制剂3-MA明显增加横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠炎症反应和氧化应激反应,加重大鼠肾损伤和线粒体损伤,减少自噬。结论 葛根素可通过PINK1/Parkin通路增强横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠线粒体自噬,进而减轻大鼠肾损伤。

基于PINK1/Parkin信号通路探讨丹黄散在糖尿病小鼠溃疡创面愈合中的作用

目的:基于同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(PINK1)/帕金森蛋白(Parkin)信号通路探讨丹黄散在糖尿病小鼠溃疡创面愈合中的作用。方法:选取18只SPF级雄性db/db小鼠,随机分为模型组、生长因子组、丹黄散组,每组6只,另选取6只SPF级雄性db/m小鼠作为空白组,各组小鼠均构建糖尿病溃疡模型。空白组与模型组小鼠以0.9%氯化钠溶液清创并用无菌纱布覆盖创面,生长因子组与丹黄散组小鼠在其基础上分别外敷表皮生长因子凝胶和丹黄散。观察比较各组小鼠溃疡创面愈合情况及PINK1/Parkin信号通路关键蛋白表达水平。结果:模型组第7、14、21天的创面愈合率明显低于丹黄散组、生长因子组(均P<0.05);HE染色和电镜观察创面组织,相较于模型组,生长因子组、丹黄散组创面肉芽组织病理改变明显减轻,大量成纤维细胞增生,致密分布,出现少量新生毛细血管,PINK1、Pakin和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平均明显增加(均P<0.05)。结论:丹黄散可促进糖尿病小鼠溃疡创面愈合,可能通过调节PINK1/Pakrin信号通路进而调控线粒体自噬,保护线粒体功能,促进血管新生和肉芽组织生长,加快创面愈合。

葫芦巴碱通过Pink1/Parkin信号通路介导线粒体自噬对OGD/R诱导的神经元凋亡的影响

目的:探究葫芦巴碱通过PTEN诱导性激酶蛋白1(Pink1)/E3泛素连接酶(Parkin)信号通路介导线粒体自噬对氧-糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的神经元凋亡的影响。方法:原代培养大鼠海马神经元,经下调Pink1或葫芦巴碱预处理后通过OGD/R诱导神经元损伤,实验分组包括对照组、OGD/R组、葫芦巴碱组、pLKO空载体组(转染pLKO空载体)、pLKO-Pink1组(转染连接Pink1 shRNA干扰质粒的pLKO载体)、葫芦巴碱+pLKO-Pink1组。Annexin V-FITC/PI双染法测定神经元凋亡率;JC-1法测定线粒体膜电位(MMP);Calcein-AM法测定线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放程度;透射电镜观察自噬小体数量;Western Blot检测线粒体自噬相关蛋白(微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Pink1、Parkin)表达。结果:与对照组相比,OGD/R组神经元凋亡率、MPTP开放程度增加,MMP下降,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达增加(P<0.05);与OGD/R组相比,葫芦巴碱组神经元凋亡率、MPTP开放程度减少,MMP升高,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达增加(P<0.05),pLKO-Pink1组与葫芦巴碱组趋势相反;与葫芦巴碱组相比,葫芦巴碱+pLKO-Pink1组神经元凋亡率、MPTP开放程度增加,MMP下降,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达减少(P<0.05)。结论:葫芦巴碱可抑制OGD/R诱导的神经元凋亡,可能通过激活Pink1/Parkin信号通路上调线粒体自噬而实现。

PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在力学失衡诱导终板软骨退变中的作用

目的 检测脊柱失稳诱导终板软骨退变模型大鼠中线粒体自噬水平的变化,探讨PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在终板软骨以及椎间盘退变中的作用。方法 通过手术切除大鼠L2~L5棘上、棘间韧带,咬除L2~L5两侧关节突,构建大鼠脊柱失稳模型。18只SD大鼠分为正常组、退变组及羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)组,每组6只。正常组大鼠无特殊处理,退变组大鼠构建大鼠脊柱失稳模型,CCCP组大鼠在构建大鼠脊柱失稳模型后于椎间盘注射5μL CCCP (10μmol/L)。利用HE染色观察终板软骨及椎间盘形态变化,番红-固绿染色观察终板软骨细胞外基质变化。RT-PCR检测各组大鼠终板软骨组织中Ⅱ型胶原(COL-2A)、蛋白聚糖(ACAN)、PINK1、Parkin mRNA表达水平;Western blot检测COL-2A、ACAN、PINK1、Parkin及线粒体膜蛋白Tomm20、Timm23蛋白表达水平变化。结果 与正常组比较,退变组大鼠椎间盘髓核破坏明显,终板软骨细胞外基质分泌减少;CCCP组大鼠椎间盘结构较完整,终板软骨细胞外基质分泌较退变组明显增多。与正常组比较,退变组大鼠终板软骨组织COL-2A、ACAN表达均明显下调(P<0.05),线粒体自噬相关基因PINK1和Parkin表达显著降低(P<0.05),线粒体膜蛋白Tomm20及Timm23表达增高(P<0.05);CCCP组大鼠终板软骨组织COL-2A、ACAN、PINKI及Parkin表达较退变组均明显上调(P<0.05),Tomm20及Timm23蛋白水平较退变组明显下调(P<0.05)。结论 大鼠脊柱失稳导致终板软骨PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬水平降低,从而诱导终板软骨及椎间盘退变,激活线粒体自噬能够明显减轻终板软骨及椎间盘退变。

PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬对大鼠急性心肌梗死细胞的影响研究

目的 探讨大鼠急性心肌梗死发生后3、6 h内通过激动PINK1/Parkin通路对心肌细胞的影响。方法 将36只大鼠随机分为假手术组、模型组、PINK1激动组,每组12只;建模后按第3、6 h分为2个亚组,每组6只。模型组、PINK1激动组采用冠状动脉结扎法制备大鼠心肌梗死模型,动物模型实验结束后,摘取大鼠心脏制成切片,光镜下观察各组急性心肌梗死大鼠组织细胞的病理结构。结果 假手术组大鼠心肌细胞排列整齐,未见明显炎性细胞浸润。模型组大鼠在3、6 h时间点均观察到大量心肌细胞坏死。在3 h时间点PINK1激动组与3 h时间点模型组相比,炎性细胞减少,心肌细胞排列相对整齐,症状有所改善;6 h时间点PINK1激动组与6 h时间点模型组相比无明显差别。3 h时间点的PINK1激动组损伤程度小于同时间点模型组(P<0.05),而6 h时间点的PINK1激动组损伤程度与同时间点模型组比较无显著性差异(P>0.05)结论 大鼠发生急性心肌梗死后3 h内激动PINK1/Parkin通路可减轻大鼠心肌细胞损伤。

丹黄散激活PINK 1/Parkin信号通路对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的影响

目的基于PINK 1/Parkin信号通路探究丹黄散对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的作用,并探讨其具体的作用机制。方法将人脐静脉血管内皮细胞进行体外培养,随机分为对照组、生长因子组、丹黄散组、高糖组、高糖+生长因子组、高糖+丹黄散组,每组3例,干预48 h;细胞划痕实验检测细胞转移率,Transwell实验检测细胞侵袭率;免疫荧光法测定抗凋亡蛋白Bcl-2、Beclin-1、促凋亡蛋白Bax的表达水平;Western blot技术测定假定激酶(PINK 1)、帕金森病蛋白(Parkin)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC 3-Ⅱ)的蛋白表达水平。结果细胞划痕实验、Transwell实验结果显示,在正常环境下及高糖处理后,丹黄散均可降低细胞的细胞转移率和侵袭率(P<0.05);荧光免疫法结果显示,在正常环境下及高糖处理后,丹黄散均可上调细胞中的Bcl-2、Beclin-1蛋白表达水平(P<0.05);Western blot结果显示,在正常环境下及高糖处理后,丹黄散均可下调Bax的蛋白表达水平(P<0.05),升高细胞中的PINK 1、Parkin和LC 3-Ⅱ蛋白表达水平(P<0.05),且丹黄散效果均明显优于空白血清和生长因子(P<0.05)。结论丹黄散可通过激活PINK 1/Parkin通路,减缓高糖诱导的血管内皮细胞损伤,其机制可能与丹黄散促进线粒体自噬进而增强损伤修复有关。

祛痰活血方调控PINK1/Parkin信号通路诱导NASH大鼠肝细胞自噬的实验研究

目的:探讨祛痰活血方通过调控PINK1/Parkin信号通路诱导肝细胞自噬改善非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝损伤的作用机制。方法:雄性SD大鼠30只,随机分为对照组、模型组和祛痰活血方低、中、高剂量组,每组6只。对照组大鼠给予普通饲料,其余各组大鼠予高脂饮食,造模8周。祛痰活血方低、中、高剂量组大鼠连续给药4周后,处死各组大鼠,称量并记录大鼠体质量及肝质量,测定肝功能及血脂水平,观察各组大鼠肝组织病理变化和肝内脂质沉积情况,透射电镜下记录各组大鼠肝组织脂滴和自噬小体数量,检测各组大鼠肝组织自噬蛋白PINK1、Parkin、SQSTM1表达以及PINK1/Parkin信号通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠体重增加,行动迟缓;祛痰活血方治疗后大鼠一般情况好转,体重、肝重减轻。模型组大鼠肝功能指标和血脂水平高于对照组,祛痰活血方治疗后大鼠ALT、AST、TG、TC下降。透射电镜观察,对照组和模型组大鼠肝组织均未见明显自噬体,模型组大鼠肝组织可见大量脂滴,祛痰活血方治疗后大鼠肝组织自噬小体数量增加、脂滴数量减少且体积变小。免疫组织化学法检测,对照组大鼠肝组织SQSTM1无阳性表达,PINK1、Parkin阳性表达较低;与对照组相比,模型组大鼠肝组织PINK1、Parkin无阳性表达,SQSTM1表达较高;与模型组相比,祛痰活血方治疗后,大鼠肝组织PINK1、Parkin阳性表达增加,SQSTM1表达降低。蛋白免疫印迹分析,模型组大鼠肝组织自噬蛋白PINK1、Parkin、SQSTM1表达减低,祛痰活血方治疗后大鼠肝组织PINK1、Parkin、SQSTM1表达增加。结论:祛痰活血方可能通过调控PINK1/Parkin信号通路诱导肝细胞自噬,减轻肝细胞炎症及肝组织脂质沉积,从而发挥治疗NASH的作用。

葛根素通过调节PINK1-parkin信号通路介导的线粒体自噬抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡上皮细胞凋亡

目的:建立大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型,探讨葛根素是否能够通过调控PTEN诱导假定激酶1(PINK1)-parkin信号通路介导的线粒体自噬,发挥肺保护作用。方法:气管滴注脂多糖+烟熏法建立COPD大鼠模型,建模成功后随机分为模型组、低剂量(50 mg/kg)葛根素组、中剂量(100 mg/kg)葛根素组、高剂量(200 mg/kg)葛根素组和3-甲基腺嘌呤(3-MA;10 mg/kg)组,每组15只;另取15只大鼠作为对照组。连续给药8周后进行大鼠肺功能检测;ELISA法检测大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平;HE染色观察大鼠肺组织病理变化;TUNEL染色观察大鼠肺泡上皮细胞凋亡情况;免疫组化法检测肺组织中BECN1和LC3B蛋白表达;Western blot法检测肺组织中PINK1、parkin、Bax和Bcl-2蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组大鼠肺组织病变明显,肺泡腔严重充血,炎症细胞大量浸润,肺泡间隔与肺泡壁增厚,病理评分显著升高(P<0.05),用力肺活量(FVC)、0.1 s用力呼气容积(FEV0.1)和呼气流量峰值(PEF)水平均显著下降(P<0.05),TNF-α、IL-1β和IL-6水平,肺泡上皮细胞凋亡率,肺组织中BECN1、LC3B、Bax、PINK1和parkin表达均显著升高(P<0.05),Bcl-2表达显著降低(P<0.05);与模型组比较,各剂量葛根素组和3-MA组大鼠肺组织病理评分均显著降低(P<0.05),FVC、FEV0.1和PEF水平均显著升高(P<0.05),TNF-α、IL-1β和IL-6水平,肺泡上皮细胞凋亡率,肺组织中BECN1、LC3B、Bax、PINK1和parkin表达均显著降低(P<0.05),Bcl-2表达显著升高(P<0.05),且具有剂量依赖性(P<0.05);与高剂量葛根素组比较,3-MA组大鼠上述指标无显著差异(P>0.05)。结论:葛根素可能通过调控PINK1-parkin信号通路介导的线粒体自噬,抑制肺泡上皮细胞凋亡和肺部炎症反应,从而减轻COPD大鼠肺损伤。

肾缺血再灌注损伤与线粒体自噬SIRT1-FOXO3-PINK1-Parkin调节轴的研究进展

肾缺血再灌注损伤(IRI)是导致急性排斥反应、移植肾功能延迟恢复和移植肾间质纤维化的重要原因,已成为制约移植受者和肾长期存活的瓶颈,如何减轻肾IRI是改善肾移植远期预后的关键问题。自噬与肾IRI有着密切关系,线粒体自噬在肾IRI中的作用越来越受到关注。阐明肾IRI与线粒体自噬SIRT1-FOXO3-PINK1-Parkin调节轴的调控关系,对探讨肾IRI后肾小管上皮细胞损伤修复的新机制具有重要意义。