赤水乌骨鸡PITX1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】克隆赤水乌骨鸡成对样同源结构域转录因子1(paired-like homeodomain transcription factor 1,PITX1)基因并进行生物信息学分析,检测PITX 1基因在赤水乌骨鸡不同组织中的表达水平,为探究PITX 1基因在鸡肌肉生长发育中的生物学功能提供材料。【方法】以赤水乌骨鸡胸肌组织cDNA为模板,克隆PITX 1基因CDS区序列并测序,利用在线软件对所获序列进行比对及生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测PITX 1基因在赤水乌骨鸡心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胸肌和腿肌组织中的表达量。【结果】赤水乌骨鸡PITX 1基因CDS区长909 bp,存在5处同义突变,编码302个氨基酸。赤水乌骨鸡PITX 1基因氨基酸序列与原鸡、绿头鸭、日本鹌鹑、兔、小鼠的相似性分别为100%、99.7%、99.0%、85.0%和84.4%,与人、牛和野猪的相似性均为85.7%。系统进化树分析表明,赤水乌骨鸡和原鸡的亲缘关系最近,与人的亲缘关系最远。赤水乌骨鸡PITX1蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽,有47个潜在磷酸化位点、1个N-糖基化修饰位点和15个O-糖基化修饰位点,主要分布在细胞核中。PITX1蛋白二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,三级结构预测结果与其一致。蛋白互作分析结果显示,PITX1蛋白可能与BARX1、NKX2-8、POU1F1、EGR1、NR5A1、CTNNB1、TBX5和TBX4蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,PITX 1基因在赤水乌骨鸡各组织中均有表达,其中在肺脏中的表达量最高,其次是肝脏和腿肌,在胸肌中的表达量最低。【结论】赤水乌骨鸡PITX 1基因CDS区长909 bp,编码302个氨基酸,为亲水性蛋白,主要分布在细胞核中。PITX 1基因在赤水乌骨鸡各组织中均有表达,且在肺脏中表达量最高。试验结果为进一步研究鸡PITX 1基因功能提供参考。

卵巢上皮性癌组织中PITX2和β-catenin蛋白的表达

目的:探讨卵巢上皮性癌组织中PITX2和β-catenin蛋白的表达及意义。方法:采用免疫组化法检测80例卵巢上皮性癌组织、40例卵巢上皮性良性肿瘤组织和40例正常卵巢组织中PITX2与β-catenin蛋白的表达。采用ELISA检测40例卵巢上皮性癌患者术前和术后(7 d)血清中PITX2蛋白的含量。结果:不同类型卵巢组织中PITX2、β-catenin蛋白的表达差异有统计学意义(χ2=85.380和80.200,P<0.001),卵巢上皮性癌组织中PITX2蛋白的阳性表达率与β-catenin蛋白的异位阳性表达率高于卵巢上皮性良性肿瘤组织和正常卵巢组织,而两者在卵巢上皮性良性肿瘤组织和正常卵巢组织中低表达或不表达。PITX2蛋白的阳性表达率及β-catenin蛋白的异位阳性表达率与卵巢上皮性癌的组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。卵巢上皮性癌组织中PITX2表达与β-catenin的异位表达呈正关联(rP=0.411,P<0.001)。卵巢上皮性癌患者术前血清中PITX2的含量高于术后血清中的含量(t配对=16.582,P<0.001)。结论:卵巢上皮性癌组织中β-catenin的激活可能引起细胞中PITX2的上调,从而进一步引起细胞异常增殖、分化及肿瘤的发生发展。

PITX2 R62H突变导致角膜环状皮样瘤的分子基础

角膜环状皮样瘤(RDC)是一种呈常染色体显性遗传的角膜良性肿瘤,前期研究证明,PITX2基因的G185A突变(R62H)是导致RDC发生的原因.为了进一步探讨R62H导致RDC的分子基础,将PITX2构建至原核表达载体,诱导表达后纯化融合蛋白进行EMSA实验,显示R62H与DNA的结合能力并未明显下降.筛选稳定表达PITX2WT和R62H的HeLa细胞克隆,用流式细胞仪分析细胞周期,并用Quantitative Real-time PCR来检测细胞克隆的β-catenin和Cyclin D1的表达水平,结果发现稳定表达PITX2R62H的HeLa细胞的增殖活性低于PITX2WT,且β-catenin和CyclinD1的mRNA水平均比PITX2WT明显下降.由此推测,R62H突变使Wnt/β-catenin→PITX2信号途径发生改变,促使基因表达异常,导致细胞异常增生和角膜环状皮样瘤的形成.

转录因子PITX2的研究进展

PITX2是属于Bicoid家族的转录因子,并且与另外两个高度同源的蛋白PITX1和PITX3构成了PTX亚家族。本文对PITX2基因和蛋白质的结构,表达与功能,与Wnt/β-catenin信号途径的关系以及突变所致遗传性疾病及其分子机制等进行了综述。

胶质细胞源性神经营养因子对培养的胚鼠脑室下区神经干细胞表达Pitx3及酪氨酸羟化酶的影响

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对培养的胚鼠脑室下区(SVZ)神经干细胞(NSCs)表达Pitx3、酪氨酸羟化酶(TH)的影响。方法:取胚鼠SVZ组织,进行细胞培养。分为GDNF+NSCs共培养组和NSCs单独培养对照组。用Pitx3、TH、Pitx3/TH免疫荧光单标和双标及Nestin免疫组化法进行检测。结果:共培养组5 d时形成神经球,10 d时球体积不断增大,12 d后开始贴壁生长,并向四周伸出突起并开始分化。对照组神经球明显少于共培养组。14 d共培养组Pitx3、TH、Pitx3/TH阳性细胞明显高于对照组。结论:GDNF能上调SVZ区NSCs表达Pitx3和TH,诱导NSCs向多巴胺(DA)能神经元分化。

Pitx2基因在斑马鱼牙齿发育过程中早期表达的研究

目的研究Pitx2基因在斑马鱼牙齿早期发育阶段的表达。方法利用RT-PCR技术直接克隆Pitx2特异性基因片段,制作针对Pitx2的基因探针,选取斑马鱼发育早期多个时段的胚胎进行整胚原位杂交。结果成功克隆Pitx2基因,合成针对Pitx2的基因探针,获得Pitx2基因在斑马鱼早期发育阶段的表达情况。结论了解Pitx2基因在斑马鱼早期发育阶段中的表达情况。

Pitx3在中脑多巴胺能神经元发育及帕金森病中的作用研究进展

中脑多巴胺能神经元主要包括3个不同的亚群：腹侧被盖区、黑质和红核后区，其控制自主运动、行为及认知，与临床高度相关，如黑质中脑多巴胺能神经元的退行性改变会引起帕金森病。中脑多巴胺能神经元的发育成熟可大致经历4个阶段：前体细胞期一多巴胺能神经元前体细胞期一多巴胺能神经元早期一多巴胺能神经元成熟期。已知多巴胺能神经元的发育是一个有多种转录因子和生长因子参与而受到严格控制的过程。其中。Pitx3特异表达于大脑DA能神经元。对中脑多巴胺能神经元的分化与成熟起着关键性作用，被认为是中脑多巴胺能神经元特异性发育所必需的转录因子。

中国人群pitx3基因多态性与晚发散发性帕金森病的相关研究

目的分析pitx3基因多态性与晚发散发性帕金森病的遗传关联。方法使用连接酶检测反应(LDR)法,分析509例晚发散发性帕金森病(Parkinson's disease,PD)患者和494例正常对照者中pitx3基因单核苷酸多态性(SNPs)位点rs2281983、rs4919621和rs3758549。随机选取10%样品直接测序进行验证。结果 pitx3基因SNP位点rs2281983、rs4919621和rs3758549的基因频率在晚发散发性帕金森病患者和正常对照组间差异无统计学意义。3个SNP位点与晚发散发性PD无关联。结论中国人群中,pitx3不是晚发散发性帕金森病的易感因素。

PITX1和Pan-ras在肝癌细胞中的表达及意义

目的研究抑癌基因PITX1和其下游癌基因Pan-ras在正常胚肝细胞株L02,肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721中的表达,探讨其在肝癌发生发展中的作用和关系。方法应用SABC免疫组织化学染色技术和western blot蛋白质印迹以及半定量RT-PCR检测L02、HepG2和SMMC-7721细胞株中PITX1和Pan-ras基因的表达情况,并分析其意义。结果PITX1在肝癌细胞(HepG2、SMMC-7721)中表达比正常肝细胞L02显著降低,Pan-ras在肝癌细胞(HepG2、SMMC-7721)中的表达与正常肝细胞L02相比显著升高。结论PITX1在肝癌细胞中的低表达,以及Pan-ras的高表达,可能导致肝癌无限增殖,构成了肝癌细胞信号传导网络中的重要一环。

PITX2 shRNA对卵巢癌细胞H08910裸鼠移植瘤凋亡的影响

目的探讨PITX2基因沉默对人卵巢癌细胞株H08910裸鼠移植瘤凋亡的影响。方法将重组PITX2 shRNA plasmid转染人卵巢癌细胞株H08910细胞,通过裸鼠移植瘤实验观察PITX2基因沉默对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,同时,利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测PITX2基因沉默对caspase-3、cytochrome-c和caspase-9表达的影响。结果与对照组(空载体组和未转染组)相比,PITX2 shRNA plasmid转染组人卵巢癌细胞株H08910细胞生长速度减慢,肿瘤体积缩小(P<0.05),而且caspase-3、cytochrome-c和caspase-9的表达明显升高(P<0.05)。结论 PITX2基因沉默可通过促进肿瘤细胞的凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长。

牙鲆早期发育和变态期间Pitx2基因的表达(英文)

Pitx2基因被认为是脊椎动物中调节内脏器官左右不对称的关键转录因子。为进一步探讨牙鲆变态期间的左右不对称是否也受Pitx2的左特异活性调节,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),拟在变态的牙鲆的头部组织中克隆编码Pitx2基因的部分cDNA序列,并通过以18s rRNA为内标的半定量RT-PCR研究其在牙鲆早期发育和变态期间的表达情况。克隆和测序的结果表明Pitx2在牙鲆早期发育和变态期间也存在基因表达;而半定量的结果表明它的左特异性功能很可能在变态的早期阶段发挥作用。但是,牙鲆变态期间的右眼移动是否受Pitx2的左特异活性调控,以及变态期间的左右不对称和内脏器官的左右不对称是否拥有相同的分子机制,仍需进一步研究。

左右不对称信号分子Pitx2

同型框基因Ｐｉｔｘ２在鸡、小鼠和爪蟾胚胎中不对称地表达在左侧板中胚层和衍生器官（如心脏、肠等）中．转录因子Ｐｉｔｘ２看来是Ｓｈｈ和Ｎｏｄａｌ等信号分子的下游效应子．Ｐｉｔｘ２的错误表达足以产生器官逆位和身体旋转逆向，人类若有Ｐｉｔｘ２表达缺陷就可能导致Ｒｉｅｇｅｒ综合征．Ｐｉｔｘ２看来是脊椎动物介导左右不对称的关键且保守的信号分子．

DACT2、PITX2在结肠癌、腺瘤组织中的表达及意义

目的检测DACT2和PITX2基因在正常结肠黏膜、结肠腺瘤及结肠癌组织中的表达水平,探讨二者在结肠癌发生、进展中的作用及其相互关系。方法采用qRT-PCR法检测DACT2和PITX2在不同结肠组织中的表达水平。结果DACT2在三组中的表达呈逐渐下降趋势,差异有统计学意义(P<0.001),PITX2表达在三组中呈逐渐上升趋势,差异有统计学意义(P<0.001),DACT2与PITX2在三组中的表达均呈负相关。结论DACT2在结肠癌进展过程中可能发挥抑癌基因的作用,PITX2在结肠腺瘤-结肠癌过程中可能起到促进其发展的作用,二者之间的相互作用可能在结肠黏膜癌变过程中起到一定作用,联合检测可能为提高结肠癌早期诊断率及后续的治疗拓展了新思路。

Pitx2对缺氧诱导的心肌细胞H9c2凋亡的影响

目的观察Pitx2对缺氧诱导的心肌细胞H9c2凋亡的影响。方法将心肌细胞H9c2分为对照组、模型组(缺氧处理)、Vector组(转染阴性对照载体,缺氧处理)、Pitx2组(转染Pitx2过表达载体,缺氧处理)。采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-qPCR)和免疫印迹法分别测定细胞Pitx2 mRNA和蛋白表达变化,四唑盐(MTT)法测定细胞增殖能力,流式细胞术测定细胞凋亡情况,免疫印迹法测定细胞C-Caspase-3、C-Caspase-12和C/EBP同源蛋白(CHOP)表达变化。将CHOP和Pitx2过表达载体共转染到心肌细胞H9c2中,测定细胞增殖、凋亡和C-Caspase-3、C-Caspase-12、CHOP表达变化。结果与对照组比较,模型组心肌细胞Pitx2 mRNA和蛋白表达水平下降,细胞增殖能力降低,细胞凋亡水平增加,细胞C-Caspase-3、C-Caspase-12和CHOP蛋白表达水平增加(P<0.05)。与Vector组比较,Pitx2组心肌细胞Pitx2mRNA和蛋白表达水平均升高,细胞增殖能力升高,细胞凋亡水平降低,细胞C-Caspase-3、C-Caspase-12和CHOP蛋白表达水平降低(P<0.05)。CHOP过表达载体可抑制Pitx2缺氧心肌细胞增殖,诱导细胞凋亡。结论上调Pitx2可抑制缺氧诱导的心肌细胞H9c2凋亡,其作用机制与调控CHOP影响内质网应激有关。

斑马鱼心脏标记基因pitx2的多克隆抗体的制备

pitx2基因是一类bicoid相关的同源异型框因子成员,介导心脏左右不对称发育和内脏器官的偏侧化.pitx2基因位于Nodal信号途径的下游,直接由Nodal信号分子控制.用PCR技术扩增斑马鱼pitx2基因的部分编码区,并将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和测序鉴定后,将重组质粒(pGEX-4T-1-pitx2)转入BL21感受态细胞,通过IPTG诱导表达融合蛋白,用GST珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体.获得了pitx2原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗pitx2多克隆抗体.提取斑马鱼不同器官和组织蛋白,用自制的多克隆抗体检测pitx2基因在斑马鱼中的表达情况,发现pitx2基因特异性地在心脏、脑、肌肉、小肠和肝脏表达,尤其在心脏中有很高的表达,表明制备的抗体特异性非常好.

Peters异常PITX2及PAX6基因型表型分析

目的:分析中国人Peters异常(PA)患者的临床特征,研究Peters异常患者PITX2及PAX6基因变异情况。方法:选取2016/2019年在常州市第二人民医院及第三人民医院眼科就诊的15例Peters异常患者,并收集详细的相关临床资料。征得患者及其家系成员的同意后抽血制备基因组DNA,用聚合酶链反应(PCR)对致病基因PITX2及PAX6的编码区及其临接内含子进行扩增后,直接测序筛查中国人群Peters异常患者PITX2及PAX6基因变异,异源双链-单链构象多态性分析(HA-SSCP)的方法对突变患者及其家系成员及80例正常对照进行验证;分析比较国内已报道的Peters异常患者PITX2及PAX6基因突变并研究其相关表型。结果:Peters异常患者15例PITX2基因突变筛查结果发现了1种新PITX2的突变c.296delG(P.R99fsx56),导致该基因的功能异常,分析突变患者临床特征,该患者右眼诊断为Axenfeld-Rieger综合征(ARS),左眼诊断为Peters异常。而家系成员中该患者父母及无亲缘关系的正常对照者均未发现相同突变,故此突变为新生突变。PAX6基因突变筛查未能发现突变。结论:PA患者15例中检测到1个新PITX2基因突变,丰富了PITX2基因突变频谱,进一步明确了PA合并ARS眼病的临床特点,为该种少见眼病的临床诊断和发病原因提供了依据。

先天性心脏病相关PITX2c基因新突变研究

目的:研究先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)相关PITX2c基因的新突变。方法:收集150例CHD患者和200名正常对照者的外周静脉血标本,使用DNA纯化试剂盒分离基因组DNA。使用DNA聚合酶扩增PITX2c基因的编码区和剪接位点,应用DNA测序试剂盒在DNA分析仪上对扩增片段进行测序。将所测序列与GenBank数据库中的PITX2c基因序列进行比对以发现PITX2c基因突变。使用在线程序MUSCLE分析突变氨基酸的保守性,分别应用MutationTaster和PolyPhen-2分析突变氨基酸的致病性。结果:在1例散发性CHD患者发现了1个新的PITX2c基因杂合错义突变,即p.S101G突变,突变率约为0.67%。该错义突变不存在于200名正常对照者。跨物种PITX2c蛋白之氨基酸序列对比显示第101位的丝氨酸在进化上完全保守,致病性预测显示所发现的PITX2c基因变异是致病性突变。结论:本研究揭示了CHD相关PITX2c基因新突变,对于制定新的CHD防治策略具有潜在的意义。

PITX2突变导致非综合征型先天缺牙的遗传研究

目的:研究1例非综合征型先天缺牙(non-syndromic tooth agenesis,NSTA)患者家系的遗传学病因。方法:采集先证者及家庭成员的外周血,利用全外显子组测序技术和生物信息学工具进行变异检测及分析。锁定先证者候选基因后,通过Sanger测序技术验证变异位点。运用Protean、I-TASSER软件分别分析突变蛋白的二级结构和三维(3D)模型,并与野生型进行比较分析。结果:先证者及母亲均携带同一PITX2新发杂合移码突变(c.176delT,p.I59fsX149)。该突变改变同源结构域和OAR结构域,影响DNA结合活性及对下游基因的激活诱导能力。二级结构预测显示突变蛋白α螺旋数量减少,3D模型空间构象变化显著。结论:PITX2移码突变(c.176delT)可能是先证者患有NSTA的病因之一。本研究扩展了PITX2基因突变谱,为进一步探讨PITX2与NSTA之间的相关性提供临床与遗传学证据。

PITX3基因多态性与帕金森病相关性的研究进展

PITX3基因是垂体同源盒基因家族的成员之一,其表达产物在中脑黑质多巴胺(DA)能神经元终末分化和生存维持中起关键作用。诸多研究表明PITX3单核苷酸多态性(SNP)与帕金森病(PD)有关。已经报道的PITX3基因有三个SNP位点,分别为rs2281983、rs4919621和rs3758549,有学者认为PITX3基因rs3758549基因的多态可能是PD的危险因素,但也有研究认为两者并无关联。而多项研究证实PITX3基因rs2281983和rs4919621的基因多态性不是PD的危险因素。

PITX2在牙齿早期发育中的作用

PITX2作为转录因子,在生物的早期发育中有很重要的作用。它与多个器官的发生发育都有着密切的联系,如心脏、血管、脑、肌肉、骨骼、眼睛等。而Pitx2对牙齿的影响则是通过Axenfeld-Rieger综合征发现的。本文就Pitx2与牙齿早期发育的某些相关基因之间相互作用进行综述。