鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率

【目的】针对禽类干细胞研究中,存在转染效率与干涉效率低下的问题,通过比较不同干涉方式对鸡原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)中Piwi基因的干涉效果,探讨提高禽类生殖干细胞干涉效率的有效方法。为进一步研究Piwi基因参与干细胞自我更新、RNA沉默以及转录后调控过程等生物学功能研究奠定基础。【方法】根据已建立的原代细胞分离技术,分别从健康鸡群的10日龄和4日龄鸡胚中分离成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)与生殖脊,其中CEF作为PGCs细胞的饲养层,生殖脊经Trypsin-EDTA室温下消化获得PGCs细胞,并通过形态学、化学方法(PAS糖原染色、AKP活性检测)和免疫学方法(TERT抗体、SSEA-1抗体)对其进行鉴定。根据Genbank公布的鸡Piwi基因的m RNA序列(NM_001098852),利用在线软件分别靶向不同位点设计合成得到3个小片段的stealth si RNAs,并将通用无义序列BLOCK-i T^(TM) Alexa Fluor&#174;Red Fluorescent Oligo作为荧光素标记的阴性对照si RNA。同时,在线设计三条干扰序列和一条非特异性阴性对照序列,将其插入线性化空载体p RNA-U6.1,构建不同的sh RNA干涉载体。分别采用不同类型的转染试剂将构建好的si RNA和sh RNA转染PGCs细胞。首先利用通用无义si RNA以及仅带有GFP荧光标记基因的sh RNA载体作为阴性对照,检测si RNA和sh RNA转染效率,确定最佳转染条件。其次,将试验组si RNA和sh RNA在优化条件下转染PGCs细胞,分别收集转染了24、48、72和144 h这4个时间点的细胞,提取各个时间段的总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测Piwi基因m RNA表达水平,并用SPSS软件分析不同处理组的差异。【结果】在对原代分离的PGCs细胞进行了形态学、化学以及免疫学方法鉴定后,确认其所获得的细胞为PGCs细胞且状态良好。根据不同的转染试剂量与si RNA或sh RNA载体量的配比,得出si RNA转染最优条件为si RNA﹕Lipofectamine TM 2000=50 pmol﹕2μL;sh RNA转染最优条件为sh RNA﹕X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng﹕1.5μL。在以上最优转染条件下,将试验组si RNA和sh RNA分别转染第二代PGCs细胞。发现在si RNA干涉组中,阴性si RNA组和空白组相比,Piwi基因表达量在24、48、72和144 h差异均不显著(P>0.05);而3个试验组si RNA与阴性对照组相比,在24、48和72 h的Piwi基因表达量均呈现显著下降(P<0.05),但在144 h时表达差异不显著(P>0.05)。在sh RNA干涉组中,空白组和阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上差异均不显著(P>0.05);而3个试验组与阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上均显著下降(P<0.05)。与si RNA干涉试验组相比,sh RNA载体表现出更强及更长时间的稳定抑制Piwi基因的效果。【结论】si RNA与sh RNA均能较好抑制目的基因的m RNA表达,不同干涉效果表明采用sh RNA载体具有更好及更长时间的抑制作用,这为RNAi技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提供基础资料。

Piwi基因参与两性卤虫(Artemia franciscana)的生殖调控研究

Piwi(P-element induced wimpy testis)基因编码Piwi蛋白,在生殖干细胞的自我更新、减数分裂过程、RNA沉默和转录调控中起重要作用。为探究Piwi基因参与两性卤虫生殖发育的作用,从两性卤虫Artemia franciscana转录组中筛选获得Piwi基因开放阅读框,进行序列分析和结构域预测等生物信息学分析,采用qPCR技术研究该基因在A.franciscana生殖腺发育不同时期表达特征,并利用RNAi显微注射技术探究其功能。生物信息学分析表明,A.franciscana Piwi基因的开放阅读框长2619 bp,编码872个氨基酸;Piwi基因编码的蛋白分子量为98.11 kDa,等电点为9.50,为碱性亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构;存在Piwi和PAZ结构域及ArgoL1结构域,二级结构以α-螺旋为主,三级结构与之对应;系统进化树显示A.franciscana与蚤状溞和大型溞的Piwi序列相似性最高。qPCR结果表明,Piwi基因在卵巢的卵黄发生晚期和晚期胚胎表达量最高,显著高于卵黄发生早期和早期胚胎(P<0.01);Piwi基因在精巢的未成熟期表达量最高,显著高于成熟早期、成熟中期和成熟晚期(P<0.01)。RNAi结果显示,该方法能显著降低Piwi基因的表达水平(P<0.01),并导致A.franciscana所产后代均为休眠卵,说明Piwi基因不但在A.franciscana生殖发育调控起重要作用,而且可能在其繁殖方式决定过程中起关键作用。研究结果为两性卤虫Piwi/piRNA功能和分子机制调控的研究提供了基础信息,将有助于揭示Piwi基因参与调控两性卤虫生殖发育机制。

人乳腺癌干细胞中PIWI基因及piRNAs的表达分析

piRNAs是一类与Piwi蛋白家族相互作用的非编码小RNA。Piwi-piRNA通路的主要功能是调控生殖干细胞内转座子沉默,且该通路从果蝇到哺乳动物高度保守。然而,人乳腺癌干细胞中PIWI基因和piRNA的表达尚不明了。本研究采用流式细胞仪分选乳腺癌MCF-7细胞中的侧群细胞(SP)和非侧群的乳腺癌细胞(NSP),采用RT-PCR法及软琼脂克隆形成实验鉴定SP细胞的干细胞特性,采用实时荧光定量PCR法检测SP及NSP细胞中3种PIWI基因(HIWI,HILI和HIWI2)以及4种piRNA(piR-4987,piR-20365,piR-20485和piR-20582)的表达水平。结果显示:SP细胞亚群富含肿瘤干细胞样细胞;HIWI和HIWI2在SP细胞中的水平显著高于NSP细胞(p<0.05);piR-4987、piR-20365和piR-20582在SP细胞中的表达显著高于NSP细胞(p<0.01)。结果提示乳腺癌干细胞内可能存在类似生殖干细胞内的Piwi-piRNA通路,HIWI、HIWI2、piR-4987、piR-20365、piR-20485和piR-20582可能参与调控乳腺癌干细胞的生物学特性。

果蝇脂肪体中Piwi影响生长发育的新功能鉴定

Piwi(P-element induced wimpy testis)是一类与生殖相关的蛋白,主要在生殖系统中表达,对生殖细胞的形成和维持DNA的完整性及稳定性十分重要,但其在其他器官和组织中的功能尚不清楚。文章利用模式生物果蝇进行研究,发现降低Piwi在脂肪体中的表达导致果蝇的羽化率、生长周期和寿命出现问题,并且脂肪体的功能受到严重影响,说明脂肪体内表达的Piwi蛋白对于果蝇生长发育是必须的。进一步的研究表明,在脂肪体细胞内敲低Piwi基因引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量产生,干扰脂肪体细胞的储存功能,进而影响果蝇的生长发育。该研究为鉴定Piwi在脂肪体的新功能提供了新思路,并且对相关疾病的治疗具有重要价值。

利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统在BmN细胞中可溶性表达PRG-1蛋白(英文)

杆状病毒Bac-to-Bac表达系统由于操作简便等优点,被广泛应用于外源蛋白的表达。利用新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac系统可溶性表达一个大分子质量的融合蛋白———piwi相关基因编码蛋白PRG-1。为了提高目的蛋白的表达量,对重组病毒感染剂量及产物收获时间进行优化,并利用GST亲和层析纯化融合蛋白。结果表明在家蚕卵巢培养细胞BmN中表达的重组GST-PRG-1是可溶性蛋白;最佳的感染条件是病毒粒子对BmN细胞的感染复数(MOI)=1,并在感染后96 h收获细胞。试验结果表明,新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统可用于大分子蛋白的可溶性表达。