猪圆环病毒1型阴性PK-15细胞的单细胞克隆与鉴定

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）属圆环病毒科圆环病毒属，是目前为止已知的最小的动物病毒之一。根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，可将PCV分为PCV-1及PCV-2两个型。PCV1为非致病性的病毒，由德国学者Tischer于1974年从多株连续传代的PK-15细胞中最先发现。PCV2为致病性的病毒，来源于制备PK-15细胞的猪肾组织。

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码基质蛋白 (p1 5 )的基因 ,并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白 ,其氨基端带有 6个组氨酸的标签 ,因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接ELISA和免疫印迹试验中 ,重组的基质蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应 ,而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体内免疫应答的研究中。

β2m基因在猪肾细胞系PK-15中的表达研究

为研究猪肾细胞系PK-15中Beta 2微球蛋白(Beta 2 microglobulin,β2m)基因的表达情况,提取细胞总RNA,经RT-PCR扩增β2m。回收后的基因克隆至pMD18-T载体,获得重组质粒,经Eco RⅠ和Hin dⅢ双酶切筛选后,阳性克隆送生物公司测序。序列经GENETYX version 9.0编辑分析,通过DNAMAN version 5.2.2与其他猪β2m基因进行序列比对分析,利用Mega 5.0的NJ法进一步分析其与其他物种β2m的分子进化关系,并在此基础上利用SWISS-MODEL和PDBsum预测该基因编码的成熟肽二级结构和三级结构。提取PK-15总蛋白,Western blotting检测和分析细胞中β2m的表达。结果显示,经RT-PCR扩增,成功获得β2m条带,大小约360 bp。经测序发现PK-15-β2m基因为364 bp,共编码118个氨基酸,其中成熟肽为98个氨基酸,N端信号肽含有20个氨基酸。序列分析证实PK-15细胞中β2m基因未发生突变;分子进化分析显示,PK-15-β2m与牛的亲缘关系最近,其次为羊、马等。多重序列比对发现,PK-15-β2m与牛、羊、马β2m成熟肽均为98个氨基酸,而其他物种β2m成熟肽为99个氨基酸;二级结构预测显示,PK-15-β2m成熟肽主要以β-折叠、β-转角和γ-转角为主,不含有α-螺旋。三级结构预测显示,PK-15-β2m成熟肽主要由7条β-折叠条带构成。Western blotting分析显示β2m在细胞中成功表达。本研究证实了猪肾细胞系PK-15中β2m在核酸和蛋白质水平均稳定表达,为下一步研究PK-15细胞的抗原递呈功能奠定了基础。

益于猪圆环病毒2型增殖的PK-15细胞系的克隆筛选与应用

通过有限稀释法对被猪圆环病毒2型（PCV2）感染的PK-15细胞进行2轮细胞克隆筛选,得到1株对PCV2高度易感且稳定的同源性PK-15细胞克隆株,以提高PCV2在PK-15细胞系中的感染效价。结果显示,利用间接免疫荧光试验（IFA）从成功获得的7株PK-15细胞克隆株中筛选得到3株荧光反应较强的PK-15细胞克隆株。通过IFA、半定量PCR和Western-blot等方法确定PCV2可以在PK-15细胞克隆株2中高效克隆并表达PCV2 Cap蛋白。QPCR结果表明,PCV2感染该PK-15细胞克隆株后第48小时病毒表达量达到最高。这证实,获得的高敏感性PK-15细胞克隆株2可用于持续产出高效价的PCV2以便于相关疫苗和诊断制剂的研制。

猪伪狂犬病病毒多克隆抗体的制备及免疫学活性研究

本研究旨在获得抗猪伪狂犬病病毒(PRV)闽A株的多克隆抗体,为PRV的治疗与检测提供理论基础。本研究在PK-15细胞上进行PRV的增殖,测定其TCID50为10-7.372,粗提蛋白后,测定PRV蛋白浓度为3.6mg/mL。试验选用25只健康、雄性、体重为2.5kg±0.2kg的新西兰大白兔为试验动物,用获得的PRV为抗原免疫后,获得抗PRV多克隆抗体。测定其抗血清效价为1∶32 000,抗原包被稀释度为1∶40,最佳包被条件为4℃12h,最佳封闭时间为1h,酶标二抗最佳工作稀释度为1∶8 000。细胞病变中和试验结果表明,本研究制备的PRV抗血清在1∶16的稀释情况下能保护50%的PK-15细胞免受PRV的攻击,而阴性血清不能保护PK-15细胞免受PRV的感染。结果表明本研究成功制备了PRV多克隆抗体。

构建猪瘟病毒致细胞病变的PK-15细胞模型

猪瘟病毒在离体细胞培养条件下不引起宿主细胞病变,病毒与宿主细胞之间相互作用的研究一直没有合适的模型.以猪瘟病毒中国标准强毒石门株为材料,通过基因工程的手段,在构建全基因组感染性克隆的基础上,对全基因组进行部分缺失,获得了7.5 kb的亚基因组,以携带野生型猪瘟病毒的PK-15细胞为宿主,用亚基因组进行转染,得到了能够诱导PK-15细胞产生CPE的亚基因组病毒,检测显示产生CPE的细胞培养物中野生型基因组和亚基因组共同存在.猪瘟病毒致细胞病变模型的构建,为进一步研究其致病的分子机制开辟了新的方向.

Construction of cytopathic PK-15 cell model of classical swine fever virus

No cytopathic effect (CPE) can be observed on classical swine fever virus (CSFV) infected cell culture in vitro. This brings an obstacle to the researches on reciprocity between CSFV and host cells. Based on the construction of full-length genomic infectious Cdna clone of Chinese CSFV standard virulent Shimen strain, partial deletion is intro- duced into genomic Cdna to obtain a 7.5 kb subgenomic Cdna. A new subgenomic CSFV is derived from transfection with the subgenomic Cdna on PK-15 cells pre-infected by CSFV Shimen virus. Typical CPE induced by this subgenomic virus is observed on PK-15 cells. Coexistence of wild- type and subgenomic virus in cytopathic cell culture is dem- onstrated by RT-PCR detection in cytopathic cells. For conclusion, the construction of cytopathic cell model exploited a new way for researches on the molecular mechanism of CSFV pathogenesis.

一株新的类猪圆环病毒因子的核苷酸全序列和体外感染性

在中国猪血清中分离到一新因子，命名为P2．P2为闭合环状基因组，全长993个核苷酸．序列分析表明其与猪圆环病毒密切相关．随后对构建的P2因子分子克隆的体外感染性进行了研究．结果表明，在转染PK-15细胞后，只有P2因子的双拷贝串联分子克隆具有感染性，表现为可在细胞的胞浆和胞核中形成包涵体，胞浆包涵体为圆形或不规则形，直径0．1～0．4gm；胞核包涵体有两种类型，一种为小而圆、直径约0．1μm的包涵体，另一种为大而呈六角性的包涵体，直径约为0．5～1．4μm．胞浆包涵体和胞核包涵体都没有外膜，相比较而言，后者有更高的电子密度．将转染后的细胞连续传代，对第5代细胞培养物抽提DNA，进行PCR，结果也只有在转染P2因子双拷贝串联分子克隆的细胞培养物中检测到P2的DNA．而转染空载体、P2因子单分子克隆和未转染的PK-15细胞微观结构未见变化，在第5代细胞培养物中也未能检测到P2的DNA．同样，只有在转染P2因子双拷贝串联分子克隆的细胞和随后传代的细胞中能检测到P2抗原．这是首次报道如此小基因组的类猪圆环病毒P2的全序列和其在体外具有感染性．