血清循环游离DNA联合HE4、CA15-3、CYFRA21-1对卵巢癌诊断和分期评估的价值

目的探讨血清循环游离DNA(cf-DNA)联合人附睾蛋白4(HE4)、糖蛋白抗原15-3(CA15-3)、细胞角蛋白21-1片段抗原(CYFRA21-1)对卵巢癌诊断和分期评估的价值。方法纳入91例卵巢癌患者(卵巢癌组)、88例卵巢良性肿瘤患者(卵巢良性肿瘤组)、90例健康体检女性(对照组),其中卵巢癌患者包括国际妇产科协会分期Ⅰ~Ⅱ期患者37例(早期组)、Ⅲ~Ⅳ期患者54例(中晚期组)。采用ELISA检测血清HE4、CYFRA21-1水平,化学发光法检测血清CA15-3水平,实时荧光定量PCR检测血清cf-DNA水平。比较卵巢癌组、卵巢良性肿瘤组、对照组之间,以及早期组和中晚期组之间的血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平。采用受试者工作特征曲线分析上述4个指标单独诊断和联合诊断卵巢癌、评估卵巢癌分期的价值。结果对照组、卵巢良性肿瘤组、卵巢癌组的血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平依次升高(均P<0.05)。与早期组比较,中晚期组患者的血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高(均P<0.05)。血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1联合诊断卵巢癌和评估卵巢癌分期的曲线下面积均>0.95,且四者联合诊断卵巢癌的曲线下面积、敏感度和特异度大于或高于单一指标诊断,四者联合诊断早期卵巢癌的曲线下面积、特异度大于或高于单一指标诊断(均P<0.05)。结论血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1联合检测对卵巢癌的诊断和分期评估均有较好的效能。

呕吐毒素体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞对炎性因子和m^(6)A甲基化相关基因表达的影响

本实验构建了呕吐毒素(DON)体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞模型,研究DON刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞对炎性因子IL-6、IL-8和m^(6)A甲基化修饰相关基因METTL3、METTL14、FTO、WTAP和YTHDF2表达的影响。利用2μmol/L的DON刺激细胞24h和48h,收集不同时间点细胞样品的总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量PCR检测炎性因子和m^(6)A修饰相关基因表达水平的变化,并利用蛋白免疫印迹法(WB)检测METTL3和FTO蛋白的表达水平变化。结果表明:2μmol/L的DON刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞24 h和48 h后,炎性细胞因子IL-6、IL-8的相对表达量均上调(P<0.01);与对照组相比,METTL3基因的mRNA转录水平均上调(P<0.05),FTO基因的mRNA转录水平均下调(P<0.05),METTL14基因仅在24 h后上调(P<0.05),而WTAP和YTHDF2基因在DON刺激细胞24 h和48 h后均无显著变化。蛋白免疫印迹分析结果显示,METTL3蛋白在48 h后上调(P<0.05),而FTO蛋白在24 h和48 h均下调(P<0.05)。以上结果表明,DON刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞可引起细胞内炎性因子的表达增加,且m^(6)A甲基化修饰相关基因METTL3的上调和FTO的下调可能与细胞炎症相关。此外,对DON组小鼠腹腔注射5 mg/kg BW DON,对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液。3 h后检测小鼠肺脏组织中m^(6)A甲基化修饰相关基因的表达情况,与对照组相比,肺脏组织中m^(6)A甲基化相关基因METTTL3、METTL14、WTAP、YTHDF2均无显著差异;FTO下调(P<0.001)。蛋白免疫印迹分析结果显示:在DON刺激小鼠3h后FTO蛋白下调(P<0.01),表明DON在动物体内也表现出相似的效应。

单月桂酸甘油酯对PEDV感染3D4/21巨噬细胞基因表达的影响

试验旨在研究单月桂酸甘油酯(ML)对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染3D4/21巨噬细胞基因表达的影响。通过ML对3D4/21细胞活力试验和PEDV在3D4/21细胞中的生长曲线确定最适浓度和最佳时间后,将3D4/21细胞随机分为3组(control组、PEDV组、PEDV+ML组),各组分别以全时添加10µmol/L ML和PEDV感染细胞后添加10µmol/L ML两种方式进行处理,并检测相关基因相对表达量。结果表明:添加10µmol/L的ML对3D4/21细胞生长具有显著的促进作用(P<0.05),病毒感染3D4/21细胞的48 h内PEDV-S、M、N基因相对表达量呈现先增加再降低的趋势,12 h时处于最高;与PEDV组相比,PEDV+ML组全时添加ML处理12 h使PEDV-S、M、N、IL-8、IFN-β、IFITM3基因相对表达量显著下调(P<0.05),处理24 h使PEDV-S、M、N、IL-8、IFN-β、MX1、ISG15、IFIT1和IFITM1基因相对表达量显著下调(P<0.05),KCNJ13基因相对表达量显著上调(P<0.05)。与PEDV组相比,PEDV+ML组在感染后添加ML处理12 h使MMP13基因相对表达量显著下调(P<0.05),PEDV-M基因相对表达量显著上调(P<0.05),处理24 h使IL-6、IL-8、IFN-β、MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1、IFITM3基因相对表达量显著下调(P<0.05),PEDV-S、M、N、KCNJ13基因相对表达量显著上调(P<0.05)。综上所述,PEDV感染前ML预处理具有一定的抗病毒效果;PEDV感染使细胞处于免疫应激状态,ML有一定的缓解作用。

1,25-(OH)_2D_3对胰腺癌细胞诱导分化的研究

目的研究1,25-(OH)2D3对胰腺癌细胞的诱导分化作用。方法经1,25-(OH)2D3处理人胰腺癌细胞株Bxpc-3,采用电镜观察形态学;流式细胞仪测定细胞周期动力学;免疫组化法检测p21、DPC-4/Smad4蛋白的表达。结果10-7mol/L1,25-(OH)2D3能使Bxpc-3细胞形态发生变化,细胞周期时相分布出现G0/G1期阻滞,细胞周期有关蛋白p21及DPC-4/Smad4蛋白表达上调。结论10-7mol/L1,25-(OH)2D3具有明显诱导胰腺癌细胞良性分化的作用。

伪狂犬病病毒感染猪肺泡巨噬细胞和小肠上皮细胞的转录组动态分析

为探究伪狂犬病病毒(pseudorbies virus,PRV)与猪肺泡巨噬细胞及小肠上皮细胞的相互作用,将PRV感染猪肺泡巨噬细胞株3D4/21及小肠上皮细胞株IPEC-J2,测定其感染后病毒滴度及0~48 h内各时间点病毒gE基因拷贝数,观察细胞病变(CPE)和免疫荧光,采用荧光定量PCR(RT-qPCR)、ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6),对PRV感染后0、6、12、18 h样本进行转录组测序(RNA-seq)分析。结果显示:PRV感染3D4/21细胞及IPEC-J2细胞96 h时,病毒滴度分别为10^(-8.16)TCID_(50)/0.1 mL、10^(-7.76)TCID_(50)/0.1 mL,病毒gE基因拷贝数分别在18、24 h达到最大,CPE分别在10、12 h开始出现,病毒蛋白表达随感染时间延长逐渐增加;TNF-α、IL-6和IL-1β表达量在PRV感染后均逐渐升高;PRV感染3D4/21细胞及IPEC-J2细胞后,经RNA-seq联合分析,在0、6、12、18 h的4个时间点筛出2种细胞共有差异表达基因分别为8313、6999、6693、5714个,其中Ras关联域家族成员6(RASSF6)、锌指蛋白667(ZNF667)、激肽超家族蛋白3C(KIF3C)、早期应答基因3(IER3)显著变化基因可能与细胞炎症反应有关,且RT-qPCR验证与RNA-seq分析结果一致。基因本体论(GO)分析显示差异基因富集到细胞过程、生物调控、细胞代谢调节等;京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集显示差异基因主要涉及癌症通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、Toll样受体(TLRs)信号通路等,其中参与炎症的Toll样受体4(TLR4)-髓样分化因子88(MYD88)-核转录因子кB(NF-кB)通路验证结果与KEGG通路分析数据变化趋势总体一致。提示:PRV感染会影响3D4/21细胞及IPEC-J2细胞的炎症反应。本研究为进一步探索PRV的致病机制提供了参考。

副猪嗜血杆菌体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞对炎性因子和m^(6)A相关基因表达的影响

为了研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)血清5型刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞对炎性因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-8(IL-8),以及m^(6)A甲基化修饰相关基因METTL3、METTL14、WTAP、YTHDF2和FTO表达的影响,试验构建了Hps感染3D4/21猪肺泡巨噬细胞模型,利用不同浓度的Hps(MOI分别为10∶1和100∶1)分别感染细胞0,6,12,24 h,收集各时间点细胞样品的总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量PCR方法检测炎性因子及m^(6)A修饰关键基因表达水平的变化情况。结果表明:当MOI为10∶1和100∶1时,TNF-α和IL-8基因总体呈上调表达,在Hps刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞24小时时均达到显著水平(P<0.05);在12小时时,除MOI为100∶1时的TNF-α基因外均达到显著水平(P<0.05),即Hps感染3D4/21猪肺泡巨噬细胞模型构建成功。在Hps刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞后m^(6)A修饰关键基因METTL3、METTL14、WTAP、YTHDF2和FTO基因均呈下调表达,当MOI为10∶1时,在刺激6,12,24小时时METTL3、WTAP、YTHDF2基因达到显著水平(P<0.05),在刺激12,24小时时METTL14基因达到显著水平(P<0.05),FTO基因在刺激6,24小时时达到显著水平(P<0.05);当MOI为100∶1时,在刺激6,12,24小时时METTL3、METTL14、WTAP、YTHDF2和FTO基因均达到显著水平(P<0.05)。说明Hps刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞系能够抑制m^(6)A甲基化修饰相关基因的表达,并可能在m^(6)A甲基化修饰过程中起到调控作用。

猪肺泡巨噬细胞中长链非编码RNA在副猪嗜血杆菌感染中的作用

[目的]副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是猪上呼吸道中常见的革兰氏阴性胞外菌,能在应激条件下引起猪格拉瑟氏病,本试验旨在探索副猪嗜血杆菌与宿主之间的相互作用。[方法]用标准血清型5型副猪嗜血杆菌(Hps5)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21),通过RNA-Seq检测长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA的表达。[结果]共鉴定出2654个lncRNA,其中包含2439个基因间lncRNA(lincRNA)和159个反义lncRNA(anti-sense lncRNA)。与对照组相比,感染细胞中有110个lncRNA上调,216个lncRNA下调。RT-qPCR结果证明RNA-Seq鉴定的10个上调的lncRNA在Hps5感染的3D4/21细胞中稳定上调。在12、24和36 h时,有4个lncRNA持续上调。特别是lncRNA 165和3304的上调与细胞对活细菌的吞噬作用有关,但未发现lncRNA 165、3304的表达与细菌毒力之间的关系。RNA干扰和过表达试验表明,lncRNA 165能够通过调节TGF-β1的表达来影响副猪嗜血杆菌的吞噬作用。[结论]lncRNA 165在3D4/21细胞中通过TGF-β通路调控对副猪嗜血杆菌的吞噬中起重要作用。

猪CD151基因的克隆及过表达细胞系的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）主要感染猪肺泡巨噬细胞，但对猪源的其他细胞系不易感。本试验通过构建PK15-CD151和3D4／21-CD151过表达细胞系，为深入研究PRRSV感染宿主细胞的机制奠定基础。应用分子生物学方法、实时荧光定量PCR和荧光显微镜技术，对基因CD151在组织中的分布情况进行检测、基因克隆、真核表达载体的构建、对CD151在PK15和3D4／21细胞内的过表达情况，以及对细胞生长增殖的影响进行了研究。结果显示：CD151基因在不同组织内均有表达，但表达量有差异；PB真核表达载体构建成功，荧光显微镜下可见转染PB载体和CD151基因共转染的PK15和3D4／21细胞表达强烈的绿色荧光，实时荧光定量PCR分析结果进一步证实，CD151在转染后的细胞中获得超表达，并且对细胞的生长增殖无影响。本试验成功构建了PK15-CD151和3D4／21-CD151过表达细胞系，过表达细胞系的成功构建为进一步探索CD151在PRRSV感染细胞过程中的协同作用提供了细胞模型，特别是对深入研究PRRSV的入侵及宿主识别具有重要意义。

1α,25-(OH)_2D_3对大鼠成骨细胞周期及相关蛋白表达的影响

目的研究1α,25-(OH)2D3对SD大鼠成骨细胞增殖及相关蛋白的表达的影响。方法采用流式细胞术(FCM)检测细胞周期,RT-PCR和Western blotting分别检测细胞G1期调节蛋白细胞周期素D1(cyclin D1)、细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)、p21 mRNA和蛋白的表达。结果与0 nmol·L-1组比较,各1α,25-(OH)2D3干预组细胞周期发生改变,G0/G1期细胞数递减,而S+G2/M期细胞比例升高,PI增加,差异显著(P<0.05);且1α,25-(OH)2D3可诱导细胞cyclin D1、CDK4 mRNA及蛋白表达和下调p21(P<0.05)。结论置1α,25-(OH)2D3可上调cyclin D1、CDK4表达和抑制负性调节因子p21,调节相关蛋白表达以促进成骨细胞增殖。

微RNA-224在体外对胆管癌细胞抗凋亡及促进增殖的作用

目的探讨微RNA-224（miR-224）在人胆管癌（CC）细胞凋亡与增殖中的调控机制以及在胆管癌细胞中是否存在miR-224-HOXD10-PAK4传导通路。方法利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术测定CC和癌旁正常组织中miR-224的表达量。胆管癌QBC939细胞株病毒转染分为两组：细胞转染阴性对照组（NC组），细胞转染目的基因miR-224-down组（DOWN组）。记录NC组和DOWN组中QBC939细胞凋亡率及细胞克隆形成数。利用RT—PCR和蛋白印迹（Western blotting）检测NC组和DOWN组QBC939细胞中miR-224、AP15、PAK4、HOXD10的表达。结果（1）CC组织中miR-224的表达显著高于癌旁正常组织（P〈0．05）。（2）DOWN组QBC939细胞的miR-224表达显著低于NC组。DOWN组QBC939细胞凋亡率显著高于NC组。DOWN组QBC939细胞的克隆形成率显著低于NC组。（3）RT—PCR和Western blotting实验证实DOWN组QBC939细胞中AP15、HOXD10的表达明显高于NC组。（4）DOWN组QBC939细胞中PAK4的表达显著低于NC组。结论miR-224有体外抗QBC939细胞凋亡及促进QBC939细胞增殖的作用，是细胞增殖的重要调节因子。QBC939细胞中存在miR-224-HOXD10-PAK4信号传导通路。

猪源植物乳杆菌JL01调节巨噬细胞极化抗鼠伤寒沙门菌作用的研究

为探讨猪源植物乳杆菌JL01对巨噬细胞极化的作用,本试验使用猪肺泡巨噬细胞系3D4/21作为研究对象,采用JL01体外与3D4/21共培养,通过检测M1型与M2型巨噬细胞标志蛋白i NOS、Arg-1表达及细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的分泌情况,以明确JL01调节巨噬细胞极化的方向。通过免疫荧光及涂板计数,检测巨噬细胞对鼠伤寒沙门菌的吞噬杀伤效应。结果显示,JL01可以提高i NOS和Arg-1的表达,并促进TNF-α、IL-6和IL-10的分泌,但i NOS表达增强更为显著,且能增强巨噬细胞杀伤沙门菌的能力。上述结果表明,植物乳杆菌JL01能够促进巨噬细胞的M1型极化并增强对沙门菌的抵抗能力。