基于PKCβ/Erk1/2/NF-κB信号通路探讨补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎小鼠的影响

目的观察补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠PKCβ/Erk1/2/NF-κB信号通路的影响,探讨其治疗AIT的作用机制。方法80只8周龄NOD.H-2^(h4)小鼠随机分为对照组、模型组、中药组和硒酵母片组,每组20只。对照组饮用蒸馏水,其余各组予0.05%碘化钠溶液自由饮用8周建立AIT小鼠模型。各给药组灌胃给予相应药物给药8周。HE染色观察甲状腺组织形态,ELISA测定血清甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)含量,RT-qPCR检测甲状腺组织蛋白激酶Cβ(PKCβ)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Erk1/2)、核因子(NF)-κBp65、维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)和白细胞介素(IL)-17 mRNA表达,Western blot检测甲状腺组织PKCβ、Erk1/2、NF-κBp65、RORγt、IL-17蛋白表达。结果与对照组比较,模型组小鼠甲状腺组织出现大量淋巴细胞浸润,血清TGAb、TPOAb含量明显升高(P<0.001),甲状腺组织PKCβ、Erk1/2、NF-κBp65、RORγt、IL-17 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.001);与模型组比较,中药组和硒酵母片组小鼠甲状腺组织淋巴细胞浸润减轻,血清TGAb、TPOAb含量明显降低(P<0.001),甲状腺组织PKCβ、Erk1/2、NF-κBp65、RORγt、IL-17 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.001),中药组与硒酵母片组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论补中益气汤可能通过调控PKCβ/Erk1/2/NF-κB信号通路减轻AIT小鼠炎症反应,改善甲状腺组织淋巴细胞浸润状态。

脱氧佛波醇乙酸酯通过激活PKC/ERK通路诱导急性髓系白血病细胞分化

目的研究脱氧佛波醇乙酸酯(12-deoxyphorbol 13-acetate,Prostratin,DPA)对人急性髓系白血病(AML)细胞株HL-60、NB4和U937细胞分化的影响,并证明其通过激活蛋白激酶C/胞外信号调节激酶(PKC/ERK)通路诱导细胞分化。方法 1μmol/L DPA作用HL-60细胞3 d后观察细胞形态的改变;不同剂量的DPA作用HL-60、NB4、U937细胞24 h后,流式细胞仪检测细胞分化表面标志变化;Western印迹检测ERK蛋白磷酸化的改变;流式细胞仪检测丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂和PKC抑制剂对细胞分化表面标志的影响;Western印迹检测MEK抑制剂和PKC抑制剂对ERK蛋白磷酸化的影响。结果 DPA可诱导HL-60细胞出现白血病细胞分化的形态。DPA剂量依赖性地诱导AML细胞CD11b表达。DPA在诱导分化剂量范围内可剂量依赖性地引起ERK磷酸化。MEK化学小分子抑制剂U0126可完全抑制DPA引起的ERK磷酸化和CD11b表达;PKC非选择性抑制剂GFX可完全抑制DPA引起的ERK磷酸化和CD11b表达。结论 DPA其通过激活PKC/ERK通路能够明显诱导白血病细胞分化。

“疏肝调神”法针刺对创伤后应激障碍大鼠焦虑样行为及终纹床核PKC/ERK/CREB通路的影响

目的:观察“疏肝调神”法针刺对创伤后应激障碍(PTSD)大鼠终纹床核(BNST)蛋白激酶C/细胞外信号调节蛋白激酶/cAMP反应元件结合蛋白(PKC/ERK/CREB)信号通路的影响,探讨针刺改善PTSD焦虑与恐惧的作用机制。方法:从50只SPF级雄性SD大鼠中随机选出10只作为空白组,剩余40只大鼠采用幽闭电击法联合负重力竭式游泳法制备PTSD大鼠模型。随机选取30只模型制备成功的大鼠,分为模型组、西药组与针刺组,各10只。西药组予盐酸帕罗西汀溶液灌胃,每日1次,连续12d;针刺组针刺“百会”及双侧“内关”“神门”“太冲”,“百会”每日均针刺,其余穴位单日针刺左侧,双日针刺右侧,每日1次,连续12d。采用旷场实验和高架十字迷宫实验检测大鼠焦虑与恐惧的行为学变化;利用HE染色及尼氏染色观察大鼠BNST组织形态;Western blot法检测大鼠BNST组织PKC、磷酸化蛋白激酶C(p-PKC)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化CAMP反应元件结合蛋白(p-CREB)蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠在旷场中央区域停留时间及停留总距离缩短、在高架十字迷宫开放臂停留时间及活动总距离缩短(P<0.05);BNST组织神经细胞数量减少,排列不规律,存在细胞皱缩及核固缩,神经元结构异常,尼氏体染色不均匀,数量减少;BNST组织p-PKC蛋白表达及p-PKC/PKC值升高(P<0.05),p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达及p-ERK1/2/ERK1/2值降低(P<0.05)。与模型组比较,西药组、针刺组大鼠在旷场中央区域停留时间及停留总距离增加、在高架十字迷宫开放臂停留时间及活动总距离增加(P<0.05);BNST组织神经细胞数量较模型组增多,细胞排列尚整齐,尼氏体数量增加,神经元结构、尼氏体形态改善;BNST组织p-PKC蛋白表达及p-PKC/PKC值降低(P<0.05),p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达及p-ERK1/2/ERK1/2值升高(P<0.05)。结论:“疏肝调神”法针刺可减轻PTSD大鼠的焦虑与恐惧样行为,改善BNST组织神经损伤,其机制可能与调节BNST组织PKC/ERK/CREB信号通路有关。

PKC/ERK信号通路在百草枯致人胚胎神经干细胞增殖过程中的作用

[目的]探讨蛋白激酶C(PKC)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路在百草枯(PQ)调控人胚胎神经干细胞增殖中的作用。[方法]以永生化的人胚胎神经干细胞系(Re Ncell CX)为细胞模型,以终浓度为0、5、25、50、100μmol/L的百草枯处理细胞24 h,采用间接免疫荧光法检测巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白III(β-tubulin III)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP);采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率;分光光度法检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性;5-溴-2-脱氧尿嘧啶(Brd U)掺入法检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测荧光强度,以此反映细胞内钙离子浓度,免疫印迹法检测细胞膜PKCα和细胞p ERK1/2蛋白表达。[结果]与对照组比较,25、50、100μmol/L百草枯染毒组的细胞活力出现明显抑制作用,且细胞存活率与百草枯浓度对数值呈负相关(r=-0.96,P<0.05);50、100μmol/L百草枯染毒组的细胞上清中LDH水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);免疫荧光染色显示,随着百草枯染毒浓度的增加,Brd U阳性细胞数逐渐减少。其中25、50、100μmol/L百草枯染毒能明显抑制神经干细胞的增殖(P<0.05);流式细胞仪检测细胞内Ca^(2+)荧光强度,25、50、100μmol/L百草枯染毒组细胞的峰值钙离子浓度明显降低,随染毒浓度增加,Ca^(2+)荧光强度降低(r=-0.97,P<0.05);各浓度百草枯染毒均能够下调人神经干细胞的PKCα、p ERK1/2蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]百草枯通过降低细胞内钙离子浓度,进而抑制Ca^(2+)依赖的PKCα活性,减少细胞ERK1/2的磷酸化。Ca^(2+)/PKCα/ERK1/2信号通路可能是介导百草枯抑制神经干细胞增殖的途径之一。

PLCE1基因对胃癌细胞侵袭转移的影响

目的探讨干扰磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon 1,PLCE1)基因对胃癌细胞侵袭转移的影响及相关机制。方法采用免疫组化SP法检测63例胃癌组织中PLCE1的表达,分析PLCE1表达与胃癌临床病理特征的关系;将胃癌SGC7901细胞株随机分为SiPLCE1组和对照组,分别转染PLCE1基因干扰慢病毒和阴性对照空载体慢病毒,采用细胞划痕实验和Transwell实验观察细胞侵袭迁移能力;采用qPCR和Western blot法检测细胞PLCE1 mRNA和蛋白表达情况;采用Western blot法检测细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、vimentin)以及PKC/ERK信号通路蛋白的表达情况。结果PLCE1高表达组胃癌患者的淋巴结转移率为37.93%、远处转移率为20.69%、Ⅲ~Ⅳ期患者占41.38%,均高于PLCE1低表达组(P<0.05)。细胞实验结果显示,Sh-PLCE1组24 h细胞迁移距离为(36.81±2.77)μm,细胞迁移数为(291.15±20.47)个,细胞侵袭数为(142.94±19.05)个,均明显低于对照组和ShRNA-NC组(P<0.05),PLCE1 mRNA和蛋白表达、N-cadherin、vimentin蛋白表达水平均低于对照组和ShRNA-NC组(P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平高于对照组和ShRNA-NC组(P<0.05);Sh-PLCE1组PKCα、p-ERK/ERK蛋白表达水平均低于对照组和ShRNA-NC组(P<0.05)。结论PLCE1高表达可能与胃癌淋巴结转移、远处转移相关,抑制PLCE1基因可降低胃癌SGC7901细胞侵袭、迁移能力,其作用机制可能是通过抑制PKC/ERK信号通路进而抑制EMT。