木糖醇通过调节PI3K/Akt/FoxO1/NF-κB通路改善2型糖尿病小鼠肾损伤

目的探究木糖醇改善2型糖尿病(T2DM)肾损伤的作用机制。方法将小鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病对照组(DC组)、10%木糖醇组(DX10组)、20%木糖醇组(DX20组),每组6只。除NC组外,其余各组小鼠均用链脲佐菌素(40 mg/kg)构建T2DM模型。造模成功后,在正常饲料中加入不同比例的木糖醇连续喂养8周。通过试剂盒检测小鼠空腹血糖(FBG);采用ELISA法测定血清中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;比色法检测肾组织过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC);苏木精-伊红(H-E)染色观察肾组织的形态学变化;Western-blot法检测小鼠肾组织p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-FoxO1、FoxO1、NF-κB、ICAM-1、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果(1)与NC组比较,DC组FBG升高(P<0.01),木糖醇干预后下降,且DX20组下降更显著(P<0.05);(2)与NC组比较,DC组IL-6和TNF-α分泌增加(P<0.0001),木糖醇干预后均下降,且DX20组下降更显著(P<0.0001);(3)与NC组比较,DC组CAT和T-AOC活性下降、MDA含量升高(P<0.01),木糖醇干预后,CAT和T-AOC活性升高而MDA含量降低(P<0.05),且DX20组变化更显著(P<0.05);(4)H-E染色显示,木糖醇干预可改善小鼠糖尿病肾损伤,且DX20组效果更佳(P<0.05);(5)Western-blot检测显示,与NC组比较,DC组小鼠肾组织中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1和Bcl-2/Bax均降低(P<0.0001,P<0.001,P<0.01,P<0.001)、NF-κB入核增多(P<0.0001)、ICAM-1升高(P<0.01);与DC组比较,木糖醇干预可逆转相关蛋白的变化,且DX20组变化更显著(P<0.05)。结论木糖醇可通过活化PI3K/Akt/FoxO1及抑制NF-κB通路改善T2DM小鼠肾损伤。

PI3K/Akt/FoxO1信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响

目的探究磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞(hPASMC)及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响。方法细胞实验部分,将hPASMC分为4组:(1)空白对照组;(2)血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)组;(3)PDGF-BB+LY294002组;(4)PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)组。采用TUNEL检测细胞凋亡,采用蛋白质印迹法检测Bcl-2、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。动物实验部分,将12只SD大鼠随机分为4组:(1)空白对照组;(2)野百合碱(MCT)组;(3)MCT+LY294002组;(4)MCT+paclitaxel组。采用Western blot检测Bcl-2、cleaved caspase-3和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。结果细胞实验部分:相比于PDGF-BB组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的Bcl-2表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3表达水平上升(P<0.01);相比于空白对照组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的凋亡率增加(P<0.01)。动物实验部分:相比于MCT组,MCT+LY294002组与MCT+paclitaxel组Bcl-2、磷酸化Akt与磷酸化FoxO1表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3与FoxO1表达水平上升(P<0.01)。各组之间PI3K表达水平无显著差异。结论PI3K/Akt/FoxO1信号通路抑制hPASMC与肺动脉高压大鼠肺组织的细胞凋亡。

槲皮素调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路抑制C2C12细胞凋亡

目的:基于AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路探讨槲皮素对C2C12细胞增殖、成肌分化和凋亡的影响。方法:体外培养C2C12细胞进行成肌诱导,分别采用CCK8法(Cell Counting Kit-8)、ATP染色法及TUNEL法检测槲皮素对C2C12细胞增殖活力、成肌能力和凋亡的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,筛选合适浓度。再采用合适浓度的槲皮素或AKT1通路抑制剂(LY294002)干预成肌诱导后的C2C12细胞,ATP法和TUNEL法分别检测C2C12细胞成肌能力和凋亡水平,Western blot检测p-AKT1、p-AMPK和p-Foxo3a蛋白表达水平。结果:①在一定范围内,槲皮素呈浓度依赖性促进C2C12增殖,12.5μmol/L的槲皮素显著促进C2C12细胞成肌分化,能显著提高成肌标志物MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,因此本研究选择12.5μmol/L的槲皮素用于后续研究。②10μmol/L LY294002显著抑制C2C12细胞成肌分化,促进细胞凋亡,抑制p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,促进p-Foxo3a蛋白表达;12.5μmol/L槲皮素联合10μmol/L LY294002显著促进C2C12细胞成肌分化,抑制细胞凋亡,促进p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,抑制p-Foxo3a蛋白表达。结论:槲皮素通过调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路的磷酸化促进C2C12细胞增殖和分化,抑制细胞凋亡。

阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1—3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。待细胞汇合至70%—80%时,将培养基换成含50 nmol·L-1渥曼青霉素(wortmannin,WM)的分化培养基,分别于细胞分化第0天、第4天和第8天收集细胞,提取总RNA和总蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁,呈梭形。第4天细胞数量增加,部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化(P>0.05),非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组(P<0.05),而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降(P<0.05)。WM处理组的细胞在分化第8天,虽然也出现了蜂窝状生长,但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示,WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化,抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化,延迟肌管的形成,并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之,阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。

AKT/FOXOs/Atrogin-1/MuRF1信号通路在慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌萎缩中的作用

目的探讨AKT/FOXOs/Atrogin-1/MuRF1信号通路在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠骨骼肌萎缩中的作用。方法采用单纯熏香烟法复制COPD大鼠动物模型。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot技术检测COPD大鼠伸趾长肌内E3连接酶的两个肌肉萎缩特异性指标Atrogin-1和MuRF1,以及其上游FOXOs转录因子的基因与蛋白表达的变化;对伸趾长肌中磷酸化AKT(p-AKT)的蛋白表达及其与总AKT(t-AKT)的蛋白表达比率进行测定。结果 RT-PCR分析结果显示,COPD大鼠伸趾长肌组织中的Atrogin-1的mRNA表达明显上调(P<0.01);MuRF1和FOXO-1的mRNA表达与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot分析结果显示,伸趾长肌组织中Atrogin-1的蛋白相对表达量COPD组较对照组明显增加(P<0.01);MuRF1的蛋白表达COPD组较对照组增加(P<0.05);FOXO-1的蛋白表达两组比较无明显差异(P>0.05)。COPD组大鼠伸趾长肌中p-AKT的蛋白表达较对照组增加(P<0.05),p-AKT/t-AKT COPD组明显高于对照组(P<0.01)。结论 AKT/FOXOs/Atrogin-1/MuRF1信号通路参与COPD骨骼肌萎缩机制并发挥重要作用。

淋巴细胞微粒刺激AKT/Foxo1阻滞气道上皮细胞周期的研究

目的研究淋巴细胞微粒(lymphocyte microparticles,LMPs)作用于气道上皮细胞引起周期阻滞在G1期的机制通路。方法将人类正常气道上皮细胞培养到对数生长期时,20μg/ml的LMPs按照不同的时间0、4、8、16、20、24 h刺激气道上皮细胞,用RT-PCR方法检测P21、P27在mRNA水平的表达情况。20μg/ml的LMPs按照不同的时间0、4、8、16、24 h刺激气道上皮细胞,用Western blot方法检测P21、P27、Foxo1、p-Foxo1、AKT、p-AKT的蛋白表达情况。用免疫细胞化学技术检测Foxo1的核定位情况。结果与0 h对比,20μg/ml的LMPs作用于气道上皮细胞能使P21、P27的mRNA、蛋白水平显著升高(P<0.01),Foxo1蛋白水平无明显变化(P>0.05),p-Foxo1的蛋白水平表达减弱(P<0.01),AKT蛋白水平无明显变化(P>0.05),p-AKT蛋白水平表达减弱(P<0.01)。结论 LMPs作用于气道上皮细胞上调P21、P27蛋白的表达引起周期阻滞G1期,可能是通过AKT/Foxo1信号通路调节。

基于PI3K/Akt/FoxO1通路探讨大黄酸对2型糖尿病大鼠肾损伤的作用

目的 通过PI3K/Akt/FoxO1信号传导通路探讨大黄酸对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠肾脏损伤的作用。方法 通过高脂饮食+小剂量STZ(35 mg/kg)造模,将2型糖尿病大鼠随机分为大黄酸低、高(75、150 mg/kg)剂量组,二甲双胍组(300 mg/kg),模型组,另设正常对照组。连续给药12周后,检测各组大鼠的血糖、体质量、肾脏指数、MDA水平、SOD和GSH-Px活性,HE染色观察各组大鼠肾组织病理形态学改变,Masson三色染色观察胶原表达,免疫组化法与Western blot法检测大鼠肾脏PI3K、Akt与FoxO1蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠体质量、SOD和GSH-Px活性、FoxO1蛋白表达降低(P<0.05),血糖、肾脏指数、肾组织MDA水平和PI3K、Akt蛋白表达升高(P<0.05),肾脏有明显病变损伤;与模型组比较,大黄酸各剂量组体质量、SOD和GSH-Px活性、FoxO1蛋白表达升高(P<0.05),血糖、肾脏指数、肾组织MDA水平和PI3K、Akt蛋白表达降低(P<0.05),肾脏病理损伤得到改善。结论 大黄酸对2型糖尿病大鼠肾脏有保护作用,其机制可能与减轻肾脏氧化应激及调节肾脏PI3K/Akt/FoxO1信号转导通路有关。

IRS1、Akt、FOXO1在少肌症发生及其运动性缓解中的作用

目的:探索IRS1、Akt、FOXO1在少肌症的发生及运动缓解中的作用。方法:24只雄性SD大鼠分为3组,C组(青年安静组)、S组(40d D-半乳糖注射致衰组)、E组(40d D-半乳糖注射衰老+6wk跑台运动组)。检测C、S、E组大鼠体重、腓肠肌的质量、Phospho-IRS1(Ser307)、IRS1、Phospho-Akt(Ser473)、Akt、核内FOXO1、MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA、MyoD mRNA、MyoG mR-NA。结果:与C组相比,S组大鼠腓肠肌/体重降低、Phospho-IRS1(Ser307)升高、IRS1、Phospho-Akt(Ser473)、Akt下降,FOXO1、MAFbx mRNA、MuRF1mRNA、MyoD mRNA、MyoG mRNA升高,与S组相比,E组大鼠上述除MyoD mRNA、MyoG mRNA(均上调)外的指标均发生相反变化。结论:衰老肌肉IRS1/Akt/FOXO1通路的生肌信号抑制、分解信号增强,通路可能通过提高(泛素蛋白酶体途径)分解代谢而非降低(生肌因子途径)合成代谢介导了少肌症发生,长期规律运动引起衰老肌肉IRS1/Akt/FOXO1通路生肌信号增强、分解信号抑制,通路可能通过抑制(泛素蛋白酶体途径)分解代谢及提高(生肌因子途径)合成代谢拮抗少肌症,缓解肌肉流失。

PI3K/Akt/FoxO3a信号通路对人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨FoxO3a对体外培养的人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞增殖及凋亡的影响是否是通过PI3K/Akt信号通路。方法通过使用LY294002特异性抑制PI3K的活性,免疫印迹法检测FoxO3a及p-Akt蛋白在人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞的表达,免疫荧光化学检测FoxO3a在鼻咽癌细胞中的亚细胞定位,实时荧光定量PCR检测FoxO3a的mRNA表达水平,MTT法检测鼻咽癌细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测鼻咽癌细胞的凋亡率。结果通过使用PI3K特异性抑制剂LY294002,FoxO3a在实验组人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞中的蛋白和mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05),且在CNE-1(P=0.004)、CNE-2(P=0.001)细胞核内的表达量高于对照组,FoxO3a的上调可抑制人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞的增殖(P<0.05),促进其凋亡(P<0.01)。结论通过抑制PI3K/Akt信号通路的活性可上调人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞FoxO3a基因的表达,抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与其对FoxO3a的调控有关。

AKT/FOXO1信号通路在限热卡高脂饮食改善肥胖小鼠肝脏胰岛素抵抗中的作用

目的研究AKT/FOXO1信号通路介导限热卡高脂饮食干预后的肥胖小鼠肝脏胰岛素抵抗中的作用。方法4周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为高脂喂养组(HFD组)及对照组(CON组),12周后,将HFD组小鼠随机分为继续高脂组(CHFD)、低热卡高脂组(LCHFD)和极低热卡高脂组(VLCHFD),继续喂养12周。观察喂养24周后各组小鼠总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等生化指标,磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酯酶(G6Pase)及叉头框蛋白O1(FOXO1)的基因表达,磷酸化与非磷酸化AKT、FOXO1的蛋白定量。结果喂养24周后,CHFD组小鼠肝组织FOXO1、PEPCK和G6Pase的mRNA表达水平显著高于CON组,而随着饮食热卡的减少,CHFD组、LCHFD组及VLCHFD组FOXO1、PEPCK和G6Pase基因表达逐渐下降。同时,CHFD组小鼠p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1蛋白定量比值显著低于CON组,随着饮食热卡的减少,CHFD组、LCHFD组及VLCHFD组则逐渐增高。结论限热卡高脂饮食不仅能有效的控制肥胖小鼠的体质量、血糖及血脂,也能有效地逆转肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝,而AKT/FOXO1信号通路在这一过程中起到了重要作用。

肉桂酸对db/db小鼠肝脏PI3K/AKT/FoxO1信号通路的影响

目的通过研究肉桂酸对db/db小鼠肝脏PI3K/AKT/FoxO1信号通路的影响,探讨其在肝脏胰岛素抵抗方面的作用机制。方法连续两日同一时间测空腹血糖,并参考体重用随机分层抽样法将18只db/db小鼠分为模型组、吡格列酮组和肉桂酸组,正常组为同周龄db/m+小鼠,每组6只,分别给予肉桂酸溶液与等量DMSO灌胃4周。Elisa法检测血清胰岛素水平,全自动生化分析仪检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和游离脂肪酸(FFA),Western blot法检测肝脏组织PI3K、AKT、FoxO1的蛋白表达。结果肉桂酸可降低db/db小鼠空腹血糖水平及血清ALT、AST、TG、TC和FFA的水平;其亦可上调肝脏组织PI3K、p-FoxO1、p-AKT蛋白表达水平,下调FoxO1蛋白表达水平。结论肉桂酸可以改善db/db小鼠的空腹葡萄糖水平,调节血脂及改善胰岛素抵抗,其作用机制可能是通过激活PI3K/AKT/FoxO1信号通路来实现的。

基于PI3K/Akt/FoxO1信号通路研究中药益糖康对2型糖尿病大鼠糖脂代谢异常的影响

目的通过观察中药益糖康对2型糖尿病(T2DM)大鼠血糖、血脂水平,以及肝脏中PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白和肝脏糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)、葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase)蛋白表达情况的影响,探究中药益糖康调节T2DM大鼠糖脂代谢异常的机制。方法从60只Wistar大鼠中随机选取8只入组正常组,其余大鼠均腹腔注射链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,采用随机数字表法随机分为模型组、益糖康组及二甲双胍组。益糖康组及二甲双胍组分别选用益糖康及二甲双胍进行灌胃,正常组及模型组选用生理盐水进行灌胃。连续给药6周后观察4组大鼠血糖、血脂、肝脏组织形态及肝脏组织中PI3K/Akt/FoxO1信号通路蛋白及糖异生关键酶PEPCK、G6Pase蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组T2DM大鼠的空腹血糖(FBG)、胰岛素水平(FINS)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平明显增高(均P<0.05);p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1的蛋白表达比例显著降低,p-PI3K/PI3K蛋白表达比例增加,PEPCK和G6Pase蛋白表达水平升高(均P<0.05);与模型组比较,益糖康组和二甲双胍组T2DM大鼠FBG、FINS、HbA1c、TC、TG水平均显著降低(均P<0.05),p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1表达比例显著提高,p-PI3K/PI3K表达比例降低,PEPCK和G6Pase蛋白表达水平降低(均P<0.05)。结论益糖康能够调控PI3K/Akt/FoxO1信号通路,上调p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平,下调FoxO1、PEPCK和G6Pase的蛋白表达水平,抑制T2DM大鼠肝脏糖异生,从而改善T2DM大鼠糖脂代谢异常。

TCF7L2、AKT2、FOXO1基因多态性与2型糖尿病的相关性研究

目的:探讨天津地区汉族人群TCF7L2、AKT2、FOXO1基因多态性与2型糖尿病(T2DM)发生的关系。方法:选取352例T2DM患者(T2DM组)及176例健康体检者(对照组),提取基因组DNA,PCR扩增目的片段后,应用变性高效液相色谱技术检测3种基因的基因型频率,并选取不同峰型进行DNA测序。分析不同基因型频率的组间差异,并对联合基因型进行分析,Logistic回归分析影响T2DM发病的相关因素。结果:2组TCF7L2基因rs12255372、FOXO1基因rs2701891基因型及等位基因频率差异有统计学意义,2组AKT2基因rs11669332基因型及等位基因频率差异无统计学意义。TCF7L2T+/FOXO1T+、TCF7L2G+/FOXO1C+与TCF7L2G+/FOXO1T+在2组间的分布差异有统计学意义。Logistic回归分析结果示糖化血红蛋白及尿素氮升高、TCF7L2T+/FOXO1C+为T2DM的危险因素,高密度脂蛋白胆固醇水平升高为保护因素。结论:携带TCF7L2基因rs12255372位点G/T基因型与FOXO1基因rs2701891位点C/C、C/T基因型者发生T2DM的危险性增大,可能与天津地区汉族人群T2DM的发病有关,且两基因间存在一定协同作用。

降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞磷酸肌醇-3激酶/AKT/FOXO1通路的影响

目的:通过研究降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞PI3K/AKT/FOXO1通路中相关蛋白与基因表达的影响,探讨降糖消渴颗粒含药血清保护胰岛B细胞的分子机制。方法:选取FOXO1高表达INS-1稳定细胞株,分别以1%、5%、10%、15%、20%不同浓度降糖消渴颗粒含药血清干预,用MTT法计算细胞成活率以观察药物毒性,分别检测各组细胞中总FOXO1蛋白水平以确定最佳药物浓度开展后续实验。细胞用或不用PI3K抑制剂LY294002干预后,以Western blotting检测细胞中总FOXO1、p-FOXO1、Akt、p-Akt和细胞核内外的FOXO1、p-FOXO1的蛋白表达,qRT-PCR检测FOXO1mRNA和AktmRNA含量。结果:不同浓度含药血清对细胞均无毒性,其中10%为最佳药物干预浓度。10%含药血清使磷酸化FOXO1和Akt的表达升高;在胞质和胞核中,10%含药血清使FOXO1的表达降低,磷酸化表达升高,抑制剂LY294002使FOXO1和p-FOXO1表达均降低。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,Akt mRNA表达升高,FOXO1mRNA表达降低,抑制剂使FOXO1mRNA表达降低,结果与Western blotting结果一致。结论:降糖消渴颗粒含药血清可通过PI3K/AKT/FOXO1通路促进FOXO1磷酸化出核以抑制FOXO核转录实现保护胰岛B细胞的作用。

补中益气汤对PTEN/PI3K/Akt/FOXO1通路介导的盆腔脏器脱垂大鼠子宫骶韧带组织胶原代谢的影响

目的探讨正常大鼠和盆腔脏器脱垂大鼠子宫骶韧带组织中磷酸酶与张力蛋白同源基因(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/FOXO1信号通路表达差异及补中益气汤对其表达的影响。方法取健康无生育史雌性SD大鼠10只作为正常组;取20只自然分娩过3次的雌性SD大鼠制备盆腔脏器脱垂模型,造模成功后将大鼠随机分为模型组和补中益气汤组各10只。然后模型组和正常组大鼠给予生理盐水灌胃8周,补中益气汤组大鼠给予补中益气汤7 mL/(kg·d)灌胃8周。末次灌胃结束处死各组大鼠,Western blot法测定子宫骶韧带组织中PTEN、p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)、含锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、胶原蛋白Ⅰ(COL1A1)、胶原蛋白Ⅲ(COL3A1)蛋白表达情况,RT-PCR法测定子宫骶韧带组织中GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1 mRNA表达情况。结果与正常组比较,模型组大鼠子宫骶韧带组织中PTEN、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表达量及GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1 mRNA表达量均明显降低(P均<0.05),p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表达量均明显增高(P均<0.05);与模型组比较,补中益气汤组大鼠子宫骶韧带组织中PTEN、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表达量及GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA表达量均明显增高(P均<0.05),p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表达量均明显降低(P均<0.05)。结论盆腔脏器脱垂大鼠子宫骶韧带组织中PTEN表达下调,胶原蛋白COL1A1、COL3A1合成减少;补中益气汤可增加子宫骶韧带组织中COL1A1、COL3A1的合成,其作用机制可能与抑制大鼠子宫骶韧带组织中PTEN/PI3K/Akt/FOXO1通路介导的氧化应激有关,即上调抗氧化酶GPX1、Mn-SOD的表达抑制氧化应激引起的细胞凋亡、衰老和胶原蛋白的破坏。

PI3K/Akt-FoxO1信号通路在烟草烟雾暴露下单核细胞炎性反应中的作用及机制

目的:通过应用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002及FoxO1-siRNA的作用,明确PI3K/Akt-FoxO1信号通路在烟草烟雾暴露下单核细胞细胞株炎性反应中的重要作用及机制。方法:以U937细胞为研究对象,分为对照组、烟草烟雾提取物(CSE)组、PI3K抑制剂组。应用Brdu法确定实验中CSE的合适浓度。PI3K抑制剂组的细胞给予LY294002预孵育2 h后给予CSE刺激过夜,之后给予TNF-α刺激过夜;CSE组不应用LY294002,其余同抑制剂组;对照组仅给予肿瘤坏死因子(TNF)-α。应用ELISA检测细胞培养上清液中IL-8的水平,应用Western印迹检测PI3K/Akt通路关键蛋白Akt、p-Akt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表达。结果:CSE组的IL-8水平明显高于PI3K抑制剂组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05);PI3K抑制剂组的p-Akt表达较CSE组减弱,但较对照组增强,p-FoxO1表达较CSE组增强,但较对照组减弱,差异有统计学意义(P<0.05),Akt及FoxO1表达无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PI3K抑制剂LY294002可明显减弱通路关键蛋白p-Akt的表达,增强p-FoxO1的表达,进而明显减弱烟草烟雾暴露下单核细胞的炎性反应,PI3K/Akt信号通路活性及其下游FoxO1蛋白的表达与烟草烟雾暴露的单核细胞炎性反应表达有关。

Akt和FoxO1在超负荷性心肌肥大时大鼠心肌的表达

目的通过检测Akt和FoxO1基因在大鼠超负荷性心肌肥大过程中的表达,探讨心肌肥大时的细胞周期调控机制。方法采用升主动脉缩窄的方法制作大鼠超负荷心肌肥大动物模型,通过三维彩色超声技术评价心肌肥大程度,采用RT-PCR技术检测心肌组织Akt和FoxO1的mRNA表达,用Westernblots方法检测Akt磷酸化水平。结果与假手术组相比,模型组的左室后壁厚度(LVPW)、室间隔厚度(IVS)增加(P<0.01),左室舒张末内径(LVDD)减小(P<0.01)。模型组心肌组织中FoxO1的mRNA表达下调(P<0.01),Akt的基因表达没有明显变化但蛋白的磷酸化水平显著增加(P<0.01)。结论大鼠超负荷性心肌肥大时Akt激活,同时FoxO1的表达下调。

miR-21靶向PTEN调控AKT/FoxO1信号通路对胃癌细胞凋亡的机制研究

目的:探究miR-21靶向PTEN调控AKT/FoxO1信号通路对胃癌细胞凋亡的影响。方法:将胃癌SGC-7901细胞分为miR-NC inhibitors组(SGC-7901细胞中转染miR-NC inhibitors质粒)、miR-21 inhibitors组(SGC-7901细胞中转染miR-21 inhibitors质粒)、miR-21 inhibitors+sh-PTEN组(SGC-7901细胞中转染miR-21 inhibitors和sh-PTEN质粒);Control组(不转染任何质粒的SGC-7901细胞)。qRT-PCR检测细胞中miR-21 mRNA表达;采用CCK-8、Transwell小室法和流式细胞仪检测细胞增殖、侵袭能力和凋亡率;蛋白质印迹检测细胞中PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、FoxO1蛋白表达;双荧光素酶报告检测miR-21和PTEN的靶向关系。结果:人正常胃黏膜上皮细胞GES-1(1.00±0.10)相比,胃癌细胞SGC-7901中miR-21(1.89±0.17)表达明显升高(P<0.05)。Control组相比,miR-21 inhibitors组细胞中miR-21表达(0.83±0.10)、增殖率(45.31±4.92)%、侵袭数目(62.34±5.83)个和p-PI3K/PI3K(0.42±0.05)、p-AKT/AKT(0.51±0.05)比值均明显降低,细胞凋亡率(23.48±3.51)%、PTEN(0.98±0.10)和FoxO1(0.76±0.08)蛋白表达明显升高(P<0.0001)。pcDNA-NC组相比,pcDNA-PTEN组细胞增殖率(48.26±5.01)、侵袭细胞数(65.37±6.02)个和细胞中p-PI3K/PI3K(0.46±0.05)、p-AKT/AKT(0.55±0.06)比值均明显降低,细胞凋亡率(25.61±3.27)%及细胞中PTEN(0.91±0.09)和FoxO1(0.70±0.08)蛋白表达升高(P<0.05)。预测发现PTEN的3'UTR端与miR-21有碱基互补结合点位。miR-NC组相比,转染野生型PTEN(PTEN-WT)时miR-21组(0.32±0.03)荧光素酶活性明显降低(P<0.05)。miR-21 inhibitors组相比,miR-21 inhibitors+sh-PTEN组细胞增殖率(90.25±9.14)%和侵袭细胞数(125.69±10.31)个和细胞中p-PI3K/PI3K(0.80±0.08)、p-AKT/AKT(0.76±0.08)比值明显增加,细胞凋亡率(6.24±1.32)和细胞中PTEN(0.30±0.04)、FoxO1(0.38±0.05)蛋白表达降低(P<0.0001)。结论:敲减miR-21可靶向负调控PTEN表达,调控AKT/FoxO1信号通路,抑制胃癌细胞的增殖和侵袭,促进凋亡。

BEZ235通过靶向作用PI3K/AKT/FoxO1改善EAE的实验探究

探讨BEZ235通过靶向作用PI3K/AKT/FoxO1治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的相关机制。取60只C57BL/6小鼠,用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)和完全弗氏佐剂(CFA)诱导建立EAE模型。小鼠免疫后分别用PBS或BEZ235(5mg穔g-1/d-1)进行灌胃治疗,随机分为EAE组和治疗组。观察小鼠的临床评分,治疗后取脊髓行H&E和LFB染色,观察小鼠脊髓中炎性细胞浸润及脱髓鞘变化。Western blotting检测IL-17、PI3K/AKT/FoxO1在小鼠脊髓中表达;流式细胞术检测T细胞增殖、活化、凋亡、Tregs、初始T细胞、效应T细胞比例。

miR-370-3p通过FOXO1/PI3K/AKT通路抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨微小RNA(miRNA/miR)-370-3p在缺氧/复氧(H/R)H9C2心肌细胞凋亡中的调控作用。方法建立H/R H9C2心肌细胞模型。正常培养的H9C2细胞记为对照组,用miR-370-3p模拟物(miR-370-3p mimic)、miR-370-3p模拟物NC(miR-370-3p mimic NC)不同处理方法处理H/R H9C2心肌细胞。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative fluorescence of reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞中miR-370-3p的表达水平,蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞中Caspase-3、FOXO1、PI3K、AKT、p-PI3K的表达水平,流式细胞术检测细胞的凋亡。结果与对照组相比,H/R组心肌细胞中miR-370-3p的表达下降,miR-370-3p的模拟转染明显增加了miR-370-3p的表达水平。H/R明显促进了H9C2心肌细胞的凋亡,转染miR-370-3p模拟物可明显减轻H9C2心肌细胞的凋亡。H/R处理后,凋亡蛋白caspase-3的水平升高,FOXO1的表达明显增加,p-AKT和p-PI3K的表达明显减少。转染miR-370-3p后,caspase-3与FOXO1的表达明显减少,p-AKT和p-PI3K的表达明显增高。结论miR-370-3p可能通过调控FOXO1/PI3K/AKT的表达抑制H/R诱导的H9C2心肌细胞的凋亡,为改善心肌I/R损伤提供一个新的治疗目标。