蛋白激酶C激活的荧光共振能量转移分析

目的当前,检测蛋白激酶C(PKC)激活的方法尚缺乏灵敏性或直接性,这里我们提供了一种新的直接而灵敏的方法——利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术来构建检测PKC激活的方法。方法将表达PKC激活的报告分子(CKAR)的质粒单独转染或与表达甲状旁腺素1型受体(PTHR1)的质粒共转染HEK293细胞,培养72 h后用激光共聚焦显微镜检测FRET的变化,并以此判断甲状旁腺素或佛波酯是否激活PKC。结果在只转染CKAR质粒的HEK293细胞,佛波酯降低了CKAR分子的FRET效率,并使青色荧光与黄色荧光的比值(C/Y)增加,而PTH(1-34)未能改变C/Y的值。在共转染了CKAR和PTHR1质粒的HEK293细胞,PTH(1-34)则使C/Y增加。结论PKC激活报告分子可用于检测PKC的激活,该方法也可作为PKC相关信号转导的实验平台。

甲状旁腺素通过磷脂酶C非依赖途径激活蛋白激酶C

目的利用基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术的检测PKC激活或PKC-delta激活的报告分子来确定PTH是否可以通过PLC非依赖途径激活PKC和PKC-delta。方法将表达PKC激活报告分子(CKAR)的质粒和表达PKC-delta激活报告分子的质粒转染HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜检测FRET的改变,并以此判断佛波酯(TPA)是否激活PKC和PKC-delta。将表达甲状旁腺素1型受体(PTHR1)的质粒与CKAR质粒或PKC-delta质粒共转染HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜检测FRET的改变,并判断PTH(1-34)、G1R19(1-34)和0.1%的三氟乙酸(TFA)对PKC和PKC-delta的作用。结果在转染CKAR质粒或PKC-delta质粒的HEK293细胞,TPA均使青色荧光与黄色荧光的强度之比(C/Y)增加。在共转染PTH1R质粒与CKAR质粒或PKC-delta质粒的HEK293细胞,PTH(1-34)和G1R19(1-34)均增加了C/Y的值,而0.1%TFA未引起C/Y的改变。结论 PTH与PTHR1结合后通过PLC非依赖途径激活PKC/PKC-delta。

蛋白激酶C抑制剂及激活剂对鸭肠炎病毒增殖的影响

为进一步探究鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)的致病机理,试验采用鸭蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的抑制剂星形孢菌素(staurosporine,SP)和激活剂佛波醇(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)研究PKC/PKCI能否对DEV的增殖产生影响,为阐述DEV致病机理提供新的思路。用SP/PMA处理正常鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblast,DEF)后,实时荧光定量PCR方法检测不同时间段PKC/PKCI基因表达;用DEV病毒液感染SP/PMA处理的DEF后,收集不同时间段培养物,以Reed-Muench法计算DEV半数组织培养感染量(TCID50)值,实时荧光定量PCR方法检测分析DEV NP基因转录水平。结果显示,SP处理对宿主细胞PKC/PKCI基因表达水平无显著影响(P>0.05);而PMA处理可极显著提高宿主细胞PKC基因表达(P<0.01),但对PKCI基因表达水平无显著影响(P>0.05);SP/PMA处理对DEV复制能力影响显著(P<0.05;P<0.01),且在感染前期可显著或极显著降低DEV NP基因的转录水平(P<0.05;P<0.01)。综上所述,SP和PMA对PKC、PKCI基因表达水平的影响效果不同,且都能有效抑制DEV增殖,本试验结果可为DEV的防控及其致病机理的研究提供基础资料。

水牛卵母细胞成熟过程中激活蛋白激酶C对受精后原核形成的影响

为了研究成熟过程中激活蛋白激酶C(PKC)对水牛卵母细胞受精后原核形成的影响,试验采用水牛卵丘-卵母细胞复合体在不同成熟培养液(即添加PVA、FCS、PMA和PVA的基础成熟液或添加4α-PDD和PVA的基础成熟液)中成熟24 h后,将水牛卵母细胞随机分为5组进行体外受精。结果表明:20小时时检查原核的形成,PMA成熟培养处理的卵母细胞受精后的原核形成率为(66.7±2.3)%,与PVA和FCS阴性对照组[分别为(51.4±3.6)%、(46.8±5.1)%]相比差异不显著(P>0.05),但激活PKC后受精形成原核的卵母细胞数比添加4α-PDD的对照组高且差异显著(P<0.05)。说明在水牛卵母细胞成熟过程中激活PKC有利于提高两原核的形成率。

蛋白激酶C与糖尿病肾病

众所周知，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）参与信号转导途径、细胞增殖、分化和凋亡，但其在肾脏疾病中的作用尚未完全阐明。正常肾组织中可见多种PKC同工酶。当肾脏出现病变时部分PKC激活或缺失而发生表达的改变，如高糖使1，2-二酯酰甘油（DAG）水平或PKCβ升高，引起肾脏大血管和微血管病变，从而导致糖尿病肾病、IgA肾病等疾病的发生。