胃癌细胞株BGC-823中miR-138-5p负性调控Sirt1基因的表达

目的在胃癌细胞中筛选并鉴定靶向Sirt1基因的micorRNA。方法生物信息学软件预测特异性靶向Sirt1基因3’端非编码区域(3′-UTR)的microRNA;分别构建野生型和突变型与目的 microRNA匹配的Sirt1基因3′-UTR序列双荧光素酶报告基因载体;将miR-138-5p过表达质粒分别与野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体共转染入胃癌细胞株BGC-823中,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。miR-138-5p过表达质粒转染BGC-823细胞,荧光定量PCR检测转染细胞miR-138-5p与Sirt1 mRNA的表达,Western blot检测SIRT1蛋白的表达。结果生物信息学软件预测显示miR-138-5p为靶向调控Sirt1的候选micro RNA;成功构建野生型和突变型Sirt1基因3′-UTR双荧光素酶报告基因载体;荧光素酶活性实验表明,miR-138-5p可以下调野生型质粒的荧光素酶活性,不影响突变型质粒的荧光素酶。miR-138-5p过表达质粒转染后的BGC-823细胞中,miR-138-5p表达显著上调,Sirt1基因mRNA和蛋白的表达水平明显下调。结论在胃癌细胞中miR-138-5p靶向作用于Sirt1基因3′-UTR,并负性调控Sirt1基因。

蛋白激酶D1甲基化对胃癌细胞株BGC-823增殖侵袭的影响

目的:检测蛋白激酶D1(PKD1)在胃癌细胞中的表达,并探讨其对胃癌细胞增殖侵袭的影响。方法:体外培养胃癌细胞系BGC-823,使用PKD1甲基化特异性阻断剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理胃癌细胞,Western Blot法检测胃癌细胞中PKD1蛋白的表达情况,MTT法检测胃癌细胞的增殖,Transwell实验检测胃癌细胞的侵袭力。结果:5-Aza-CdR作用后,胃癌细胞中PKD1蛋白表达明显增加(P<0.05),细胞增殖速度减慢,侵袭能力减弱(P<0.05)。结论:胃癌细胞中PKD1表达的下调在胃癌的发病过程中可能起重要作用,并可能与胃癌细胞增殖侵袭能力改变有关。

二氢青蒿素通过抑制SIRT1的表达而增强5-氟尿嘧啶对胃癌的抗肿瘤活性

目的:探讨二氢青蒿素对5-氟尿嘧啶治疗胃癌的辅助作用并研究其机制。方法:实验分为对照组、二氢青蒿素组、5-氟尿嘧啶组、5-氟尿嘧啶联合二氢青蒿素组和5-氟尿嘧啶+二氢青蒿素+SIRT1质粒组。MTT法检测胃癌细胞系BGC-823在5-氟尿嘧啶联合二氢青蒿素处理下的细胞活力。Western blot实验检测5-氟尿嘧啶联合二氢青蒿素对BGC-823细胞SIRT1和NADPH氧化酶表达水平,caspase-9和caspase-3活化水平及凋亡信号调节激酶1(ASK1)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白磷酸化水平的影响。流式细胞术检测BGC-823细胞在5-氟尿嘧啶和二氢青蒿素联合处理下的活性氧簇(ROS)生成水平和细胞凋亡率。结果:二氢青蒿素处理能显著抑制BGC-823细胞SIRT1的表达并增加NADPH氧化酶的蛋白水平,明显提高BGC-823细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性,降低5-氟尿嘧啶的半数抑制浓度;转染SIRT1表达质粒后,二氢青蒿素联合5-氟尿嘧啶对BGC-823细胞的杀伤活性受到显著抑制(P<0.05)。二氢青蒿素能明显促进5-氟尿嘧啶对BGC-823细胞生成ROS的诱导效应和ASK1及JNK的磷酸化(P<0.05)。用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或JNK特异性抑制剂SP600125处理后,二氢青蒿素联合5-氟尿嘧啶对BGC-823细胞的杀伤活性和caspase-9及caspase-3的活化均受到明显抑制(P<0.05)。另外,NAC能显著抑制二氢青蒿素联合5-氟尿嘧啶对JNK磷酸化的促进作用,而SP600125却不能影响BGC-823细胞ROS的产生,表明JNK是ROS的下游分子。结论:二氢青蒿素联合5-氟尿嘧啶通过SIRT1/NADPH氧化酶/ROS/JNK通路诱导胃癌细胞发生caspase依赖的凋亡。

miR-199b-5p调控C1GALT1对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的 C1GALT1已被报道在多种癌症中呈现高表达,miR-199b-5p对肿瘤的发生有抑制作用,但在胃癌中的作用机制尚不明确。文章旨在探讨miR-199b-5p通过调控C1GALT1对胃癌BGC-823细胞增殖、迁移和侵袭影响。方法 利用生物信息学分析C1GALT1在胃癌中的表达情况。细胞进行分组(1)SiRNA转染:空白对照组1、Si-NC组、Si组(3、5、8μM);(2)双荧光素酶实验分组:MI-NC+h-C1GALT1-3UTR-wt组、MI+h-C1GALT1-3UTR-wt组、MI-NC+h-C1GALT1-3UTR-mu组、MI+h-C1GALT1-3UTR-mu组;(3)miRNA转染:MI组、 MI-NC组、空白对照组2;IN组、IN-NC组,空白对照组3;(4)共转染:空载体组、Si-C1GALT1组、Si-C1GALT1+miR-199b-5p inhibitor。Western blot检测SiRNA抑制C1GALT1的表达,CCK8法、细胞划痕和Transwell实验分别检测SiRNA干扰C1GALT1对胃癌BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力。预测能与其存在负向调控的miRNAs,双荧光素酶报告基因实验验证C1GALT1与miR-199b-5p之间的靶向关系。转染miR-199b-5pmimics/inhibitor后用Western blot检测转染后C1GALT1的表达情况,CCK8法、细胞划痕和Transwell实验分别检测miR-199b-5p对胃癌BGC823细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过Si-C1GALT1和miR-199b-5p inhibitor共转染检测其对胃癌BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力影响。结果 生物信息学提示C1GALT1在胃癌中存在高表达,通过SiRNA抑制C1GALT1表达后,发现C1GALT1低表达会使胃癌BGC-823细胞增殖、迁移和侵袭能力[(0.270±0.005)%、(534.0±24.1)个、(156.0±42.5)个]低于空白对照组1[(0.519±0.012)%、(783.0±12.8)个、(460.0±19.4)个]与Si-NC组[(0.523±0.001)%、(744.0±8.6)个、(477.0±26.9)个],差异具有统计学意义(P<0.05)。双荧光素报告显示,miR-199b-5p能靶向结合C1GALT1。miR-199b-5p mimics降低BGC-823细胞中C1GALT1表达水平(P<0.01);miR-199b-5p inhibitor提高BGC-823细胞中C1GALT1表达水平(P<0.05)。miR-199b-5p mimics组BGC-823细胞的增殖,迁移和侵袭能力[(0.256±0.002)%、(145±5.7)个、(368±57.6)个]与空白对照组2[(0.529±0.003)%、(651.0±35.7)个、(668.0±21.5)个]和miR-199b-5p mimic NC组[(0.514±0.004)%、(641.0±17.3)个、(662.0±36.1)个]相比均降低(P<0.05);miR-199b-5p inhibitor组BGC-823细胞的增殖,迁移和侵袭能力[(0.984±0.001)%、(1 089.0±114.4)个、(894.0±15.4)个]与空白对照组3[(0.529±0.003)%、(651.0±35.7)个、(668.0±21.5)个]和miR-199b-5p inhibitor NC[(0.532±0.011)%、(630.0±17.7)个、(672.0±48.5)个]相比均提高(P<0.05)。Si-C1GALT1和miR-199b-5p inhibitor共转染可部分逆转Si-C1GALT1对胃癌BGC-823细胞增殖、迁移和侵袭抑制作用。结论 miR-199b-5p可能通过调控C1GALT1抑制胃癌BGC-823细胞的增殖,迁移和侵袭。

去甲基化药物对胃癌细胞中KAI1基因表达水平影响初探

目的分别检测正常胃黏膜、低分化胃癌细胞株BGC-823及使用去甲基化药物后胃癌细胞株BGC-823中KAI1基因的表达情况,对胃癌细胞中KAI1基因甲基化对KAI1基因mRNA表达水平的影响做一个初步的探讨。方法首先采用BSP法分别检测了正常胃黏膜与去甲基化药物使用前后胃癌细胞株BGC-823中KAI1基因甲基化的水平。其次,采用RT-PCR法分别检测正常胃黏膜与去甲基化药物使用前后胃癌细胞株BGC-823中KAI1基因mRNA量的变化。结果 BSP法检测结果显示BGC-823细胞中KAI1基因出现明显甲基化,正常胃黏膜组织中KAI1基因则未见甲基化;RT-PCR结果显示正常胃黏膜中KAI1基因mRNA表达量达66.68%,而未使用去甲基化药物的BGC-823细胞中KAI1基因mRNA表达量与使用去甲基化药物的胃癌细胞株BGC-823组比较提高了3倍。结论 KAI1基因在胃癌细胞中表现出明显去甲基化,使用去甲基化药物可使胃癌细胞中KAI1的mRNA表达水平明显提高。