运用CFSE和PKH26双染法快速鉴定细胞外囊泡

目的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)称为细胞间“信使”,通过传递物质和信息调控受体细胞的功能和表型,在生理状态维持及疾病进程中发挥重要作用。然而,亚微米直径、高异质性、低折射率等特性使EVs的分析鉴定严重受阻。本研究旨在探索一种准确、高效的EVs流式检测方案,为EVs的功能研究提供技术支撑。方法首先采用差速离心法分离获得EVs,用已知直径的聚苯乙烯微球作为标尺,对流式细胞仪检测EVs的各项参数进行调试和优化以达到最佳信噪比;梯度稀释EVs样本,优化其上样浓度以降低群检测效应(swarming effect),在此基础上进一步用PKH26和CFSE两种荧光染料对EVs脂膜和蛋白进行双荧光标记,从而实现对EVs物理和生化特性的多参数分析,最后通过特异性抗体标记、电镜观察、纳米颗粒跟踪分析对EVs样本进行验证分析。结果参数优化后的流式细胞仪在散色光通道能将80 nm的微球信号与仪器背景噪音信号清楚分开;通过对样本的梯度稀释建立的浓度与稀释倍数之间的标准工作曲线的相关系数达0.99以上,说明仪器可以对EVs进行定量分析;荧光染色显示EVs呈CFSE及PKH26双阳性,占比约5.46%,与抗体标记的结果相近;电镜和纳米颗粒跟踪分析验证其粒径及群体分布与流式结果一致。结论联合散射光与脂膜荧光染料标记是一种经济、高效的EVs流式检测方案,有利于EVs流式分析的标准化。

骨髓骨片法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞和PKH26标记

目的 旨在建立一种高效的方法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的方法,并应用PKH26进行体外标记,探讨PKH26标记对BMSCs生物学特性的影响,以及体外示踪情况。方法 将大鼠5 d乳鼠双后肢骨进行分离,去除周围的肌肉和筋膜,并将其剪成小块进行培养,利用换液、传代提纯BMSCs,应用流式细胞仪测定第3代细胞表面抗原。在培养条件相同的情况下,取第3代BMSCs应用PKH26进行标记,标记组与未标记组在荧光显微镜下对细胞形态学、增殖状态进行观察,比较标记组与未标记组成骨成脂诱导特点及鉴定。结果 骨髓骨片法分离乳鼠双后肢骨,培养BMSCs呈细长梭形,形态均一,短时间内可迅速获得大量BMSCs;经流式细胞仪鉴定结果表明,表达CD29为(91.18±1.29)%,表达CD90为(95.04±0.11)%,表达CD45为(1.74±0.36)%;PHK26标记对BMSCs细胞形态,增殖无明显影响(P>0.05),对成骨成脂诱导无影响。结论 采用大鼠5 d乳鼠骨髓骨片法能够快速培养出大量高纯度的BMSCs,该细胞可作为种子细胞用于骨组织工程;PKH26可对体外大鼠BMSCs进行标记。

PKH26荧光示踪剂在小鼠骨髓单个核细胞肝内迁移过程中标记作用的研究

目的探讨PKH26荧光示踪剂在小鼠骨髓单个核细胞肝内迁移过程中的标记作用。方法以红色荧光染料PKH26标记从小鼠骨髓中分离出的骨髓单个核细胞,从小鼠的尾静脉注入CCL4-AAF造成肝损伤的同种异体的小鼠体内,移植2周后取肝组织,通过荧光显微镜观察实验组小鼠骨髓干细胞向肝脏迁移的情况。结果受体组小鼠的肝小叶中央静脉及汇管区均可见新生的PKH26标记阳性的肝细胞。结论PKH26可用于标记向急性肝损伤小鼠肝脏迁移的骨髓单个核细胞。

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景:要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。目的:采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。方法:通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。结果与结论:全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。

大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪

背景:骨髓间充质干细胞标记是体内迁移分化研究的重要环节。目的:对大鼠骨髓间充质干细胞进行PKH26标记,探讨PKH26标记对骨髓间充质干细胞的生长特征、分化的影响及体内示踪情况。方法:培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞,第2代细胞按PKH26标记程序进行细胞标记,观察标记组和未标记组细胞的增殖、周期和凋亡情况,对标记组细胞行成骨成脂体外诱导分化。尾静脉移植PKH26标记细胞,6周后荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在子宫内膜的分布情况。结果与结论:PKH26标记对细胞增殖、凋亡和周期无明显影响,不影响成骨成脂诱导分化。子宫内膜组织中PKH26标记阳性的细胞分布于腺上皮和间质细胞。PKH26标记技术可用于示踪骨髓间充质迁移转归和干细胞移植方面的实验研究。

PKH26标记的人脐带间充质干细胞在大鼠化疗性卵巢早衰模型中的卵巢迁移

目的:人脐带间充质干细胞用PKH26标记,探讨人脐带间充质干细胞在大鼠化疗性卵巢早衰模型中的卵巢迁移示踪。方法:提取并培养人脐带间充质干细胞,按PKH26标记程序进行细胞标记,透射电镜观察标记组和未标记组细胞的超微结构,测定细胞增殖、周期、凋亡情况。荧光显微镜下观察PKH26标记的人脐带间充质干细胞移植后的卵巢情况。结果:标记后细胞的形态无明显差别,均为成纤维细胞样,细胞增殖未见明显影响,细胞生长状态良好,PKH26标记阳性的细胞主要存在卵巢血管中。结论:PKH标记技术可用于人脐带间充质干细胞移植治疗化疗所致卵巢早衰中的归巢、分化、增殖的研究。

PKH26和DAPI联合示踪骨髓干细胞在脑缺血模型小鼠脑内迁移的实验研究

目的探讨PKH26和DAPI联合标记骨髓干细胞在脑内迁移过程中的示踪作用。方法用PKH26和DAPI联合标记从Balb/c小鼠骨髓中分离出的骨髓单个核细胞(BMMCs),用改良电凝法制备局灶性脑缺血模型后,将标记的BMMCs经尾静脉移植入脑缺血小鼠体内,对照组经尾静脉注入PBS。移植2w后取脑组织,通过激光共聚焦荧光显微镜观察BMMCs向脑内迁移的情况。结果实验组小鼠脑组织内可发现PKH26和DAPI双标的神经样细胞。结论 PKH26和DAPI可以联合标记向脑缺血模型小鼠脑组织迁移的骨髓干细胞,为体内示踪骨髓干细胞脑内迁移提供更加准确的实验方法。

PKH26标记大鼠骨髓间质干细胞的实验研究

目的建立PKH26标记大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的方法,并探讨标记MSCs的基本生物学活性。方法大鼠MSCs按PKH26标记程序进行标记后培养,采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析仪等观察细胞生长状态和荧光标记活性变化;应用RT-PCR检测标记后MSCs的GAPDH、nucleostemin及Bmi-1基因的表达;选用碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及骨形成蛋白3(BMP3)基因表达分析等技术,观察标记后MSCs体外分化成骨细胞的特性。结果PKH26标记后细胞呈红色荧光,荧光的强度随着PKH26浓度的增加而递增,并与传代时间和代数相关;标记后细胞生长状态良好,基本生长特性如传代培养和生长曲线无明显改变;细胞GAPDH、nucleostemin及Bmi-1基因表达未见改变;标记MSCs诱导后ALP、Von Kossa染色阳性,呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征,并表达BMP3基因。结论PKH26可稳定标记大鼠骨髓MSCs并能传代培养,标记后细胞形态、生长活力及多向分化潜能等无明显影响,该技术可用于追踪MSCs转归、可塑性及干细胞移植方面的实验研究。

PKH26标记UMSC示踪技术在细胞移植治疗卵巢癌中的应用

目的:探讨PKH26荧光染料作为脐血间充质干细胞(UMSC)示踪剂在移植治疗卵巢癌中应用的可行性。方法:从脐血单个核细胞(MNC)中培养获得传至第3代贴壁细胞,流式细胞仪(FCM)检测其表面分子表达,茜素红及油红O染色观察其向成骨、成脂细胞诱导分化状况。用PKH26标记经鉴定的UMSC,荧光显微镜观察其标记率,再用标记的2×106个UM-SC经尾静脉移植给荷卵巢癌裸鼠,14天后观察标记细胞的迁移和转归。结果:从脐血MNC培养获得传至第3代贴壁细胞,其低表达CD34和CD133而高表达CD44、CD29及CD90特征性分子,并能诱导分化为成骨、成脂细胞。经鉴定表明:从脐血MNC中可培养出UMSC。PKH26标记的UMSC呈长梭形或纺锤形,标记阳性率达98.63%。标记的UMSC在裸鼠经14天迁移后,在裸鼠脾脏及肿瘤组织中均可见发出红色荧光的标记细胞。结论:PKH26标记的UMSC可作为体内示踪细胞移植治疗卵巢癌的有效方法。

DAPI联合PKH26标记骨髓干细胞在急性肝脏损伤模型小鼠肝内迁移的示踪作用

目的探讨PKH26和DAPI联合标记骨髓干细胞在肝脏组织内迁移过程中的示踪作用。方法用PKH26和DAPI联合标记从Balb/c小鼠骨髓中分离出骨髓干细胞,用CCl4腹腔注射的方法制备小鼠急性肝脏损伤模型后,将标记的BMMC经尾静脉移植入急性肝脏损伤模型小鼠体内,对照组经尾静脉注入磷酸盐缓冲液(PBS)。移植2周后取肝脏组织,通过激光共聚焦荧光显微镜观察骨髓干细胞向肝脏内迁移的情况。结果接受骨髓干细胞移植组小鼠肝脏组织内可发现DAPI和PKH26双重标记的骨髓干细胞。结论 PKH26和DAPI可以联合标记向急性肝损伤模型肝组织迁移的骨髓干细胞,为体内示踪骨髓干细胞脑内迁移提供更加准确的实验方法。

PKH26标记人脂肪间充质干细胞及眼内示踪的可行性研究

目的评估PKH26对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)进行体外标记及眼内标记的可行性。方法体外培养hADSCs,使用PKH26对hADSCs进行体外标记并观察标记结果。采用抽签法将C57BL/6J小鼠18只分为正常对照组(6只)、标记细胞组(9只)和未标记细胞组(3只),标记细胞组和未标记细胞组C57BL/6J小鼠玻璃体腔分别注射2×10^5/ml标记细胞和未标记细胞各1μl,注射后1个月分别行视网膜铺片观察荧光标记结果。取正常对照组及标记细胞组小鼠视网膜进行苏木精-伊红染色及电子显微镜检查判定毒性反应。结果hADSCs经PKH26体外标记后细胞膜呈红色荧光,标记细胞组小鼠玻璃体腔注射标记细胞后1个月可见视网膜血管前红色强荧光,标记细胞组小鼠视网膜苏木精-伊红染色及电子显微镜检查均未见细胞变性坏死及增生。hADSCs体外、体内标记显影结果显示,未标记细胞组均无荧光显色,显色阳性率均为0,标记细胞组均出现红色荧光,显色阳性率均为100%。结论PKH26可用于标记hADSCs及眼内示踪,形态学评估显示其无毒性反应。

PKH26荧光示踪剂在神经干细胞移植大鼠创伤性脑损伤中的应用

目的探讨神经干细胞移植创伤性脑损伤(TBI)过程中有效的示踪剂,并进一步观察移植后NSCs的自然存活与分化情况。方法 Feeney法制备大鼠TBI模型;将体外培养的NSCs进行PKH26荧光示踪剂标记,并于损伤后第3天移植入脑损伤灶区,对照组注射等量生理盐水。分别于移植后1天、4天、7天及2周、3周、4周、8周取材,行全脑冷冻切片,观察PKH26标记的NSC的自然存活及分布情况;Nestin、βⅢ-微管蛋白和GFAP免疫细胞化学染色观察移植后NSCs的分化。同时,于取材前采用Corner试验进行神经行为学检测。结果 PKH26标记NSCs的阳性率>95%。移植后第1天、4天,NSCs主要分别于注射部位周围,细胞胞体较小,分布均匀,大部分仍为Nestin阳性表达细胞。移植后第7天,移植NSCs可迁移至嗅球、额叶及枕叶皮质等区域。针道及周围组织NSCs分化为神经元和神经胶质细胞的比例分别为12.3%±2.1%和37.2%±7.6%。移植后第2周,海马、脑桥、小脑普肯耶细胞层等广泛区域均可见移植细胞。移植后第4～8周,移植细胞存活数量呈减少趋势。移植细胞的PKH26染色未见明显减弱。同一时间段内,与对照组相比,NSCs移植组动物的感觉运动功能均有明显改善。结论 PKH26荧光示踪剂可用于体外培养的NSCs脑内移植示踪观察。移植NSC于损伤灶区,可自然分化为神经元和神经胶质细胞,并可迁移至脑内多处远距离部位,能明显改善TBI动物的感觉运动功能。

PKH_(26)标记脐静脉内皮细胞的实验研究

目的建立一种体外标记脐静脉内皮细胞的方法。方法培养人脐静脉内皮细胞 ,按PHK26标记程序进行标记后培养 ,荧光显微镜观察标记效果。结果标记荧光在细胞膜上分布均匀 ,经传代后仍可观察到细胞轮廓 ,细胞生长活力无明显影响。结论用PHK26对脐静脉内皮细胞进行荧光标记 ,追踪细胞转归是一种先进的方法。

PKH26荧光标记大鼠内皮祖细胞在慢性损伤肝内迁移示踪

背景:课题组早期研究发现门静脉回输内皮祖细胞可以改善肝纤维化,但是将其应用于临床尚有很多问题需要解决,如回输路径、细胞的分布情况等。目的:探讨PKH26荧光标记的大鼠内皮祖细胞在慢性肝损伤肝内迁移过程中的示踪。设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2008-08/2009-02在北京大学人民医院肝病研究所完成。材料:SPF级健康成年SD大鼠100只,由解放军军事医学科学院动物中心提供。红色荧光染料PKH26为SIGMA公司产品。方法:取16只大鼠,贴壁法分离培养内皮祖细胞,并行PKH26体外标记。实验设立3组:正常对照组4只大鼠,不进行任何干预;二甲基亚硝胺组40只大鼠,通过腹腔注射二甲基亚硝胺10mg/kg建立肝纤维化模型;四氯化碳组40只大鼠,通过四氯化碳/橄榄油灌胃建立肝纤维化模型。造模后,二甲基亚硝胺组、四氯化碳组大鼠经尾静脉注入1mLPKH26标记的内皮祖细胞悬液(1×106个细胞)。主要观察指标:PKH26标记率和细胞存活率,通过荧光共聚焦显微镜观察大鼠损伤肝内内皮祖细胞的迁移及CD31的表达。结果:流式细胞仪检测结果显示PKH26标记的内皮祖细胞阳性率为99%,荧光显微观察发现锥虫蓝染色后PKH26标记细胞存活率均>90%。输注1d后,两种慢性肝损伤模型中的肝内均可见PKH26标记阳性的细胞出现在肝小叶内,并且随时间延长阳性细胞数增加。PKH26标记阳性的细胞主要存在于沿纤维分布的血管内皮和肝小叶内的窦内皮,且血管内皮可见CD31/PK26双阳性细胞。结论:PKH26可以在体外成功标记大鼠内皮祖细胞,并在损伤肝内示踪。

Pkh1/2-Pil1信号调节酵母细胞内吞

酵母细胞中Pkh1/2信号影响细胞内吞功能.Pil1因与Pkh1/2形成复合物并可被其磷酸化引起关注.新近发现一个大分子复合物eisosome是内吞的标志性位点,而Pil1是其主要成分.前期研究发现,Pil1的磷酸化状态对eisosome结构完整至关重要.本研究通过检测Pkh1/2突变菌的生长和萤光黄(LY)染料在空泡聚集情况,发现由于Pkh1/2突变导致的生长抑制和液相内吞功能丧失,可部分由过表达的Pil1补偿,得出结论是Pkh1/2-Pil1信号在一定程度上调节细胞内吞.

PKH26和Hoechst 33258联合示踪Uncv无毛小鼠iRhom2及其突变体蛋白

目的利用PKH26和Hoechst 33258联合示踪Uncv无毛小鼠iRhom2及其突变体蛋白在Vero细胞中的定位。方法用PKH26对细胞膜进行染色,同时用Hoechst 33258染料对细胞核进行染色,置于激光共聚焦显微镜下观察。结果通过激光共聚焦荧光显微镜观察目的蛋白,发现野生型iRhom2分布在细胞的胞浆,而iRhom2mut于细胞浆内和细胞核内都存在。结论亚细胞定位的不同推测到iRhom2的N末端缺失突变可能对其细胞内的定位有影响。

PKH26标记原代大鼠肝细胞的实验研究

目的建立一种简单有效的肝细胞标记方法。方法原代分离的成年大鼠肝细胞,按PHK26标记程序进行标记。标记的肝细胞与胶原凝胶复合后植入体内观察植入细胞的成活情况。采用荧光显微镜对标记的细胞进行观察。结果肝细胞经PKH26染料标记后,荧光显微镜下可见红色荧光均匀的分布在整个细胞膜上。皮下植入后1周,植入的肝细胞成活,可通过标记的荧光直接探测到。连续切片显示这些细胞在成三维立体生长,形成类肝样的组织。结论用PHK26对肝细胞进行荧光标记提供了一种追踪细胞转归的方法。

细胞膜染料PKH26在淋巴细胞及其亚群增殖中的应用

目的探讨细胞膜染料PKH26在淋巴细胞及其亚群增殖中的应用。方法利用PKH26染色、荧光抗体标记和流式细胞术,检测淋巴细胞及其亚群在多克隆刺激剂刺激作用下荧光强度的变化,应用相关软件分析其增殖情况,并与传统MTT方法进行比较。结果经不同浓度的多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)刺激72h后,两种方法均能检测淋巴细胞增殖情况,其增殖强度与刺激剂浓度呈正相关(r=0.999)。经同种细胞刺激6d后,结合CD8、CD3抗体染色,经ModFit软件拟合后,PKH26能显示的T细胞亚群与T淋巴细胞明显不同的细胞增殖动力。结论PKH26染色结合荧光抗体标记和流式细胞术,是分析淋巴细胞及其亚群增殖动力的有力工具。

PKH26荧光标记牛尾髓核细胞的实验研究

目的探讨PKH26荧光标记在牛尾髓核细胞的应用,为髓核组织工程的体内研究提供可示踪的种子细胞。方法从牛尾椎间盘中分离髓核组织,通过酶消化法获取原代细胞,倒置显微镜下观察,P1代髓核细胞进行番红O、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色,对P1代髓核细胞进行PKH26荧光染料标记,并对标记后细胞的活性、荧光强度(0、14、28 d)、增殖特性及基因表达进行评估。结果分离得到的髓核细胞数为(1.56±0.35)×106/g,倒置显微镜下,原代细胞培养4 d开始贴壁,细胞成群生长,14 d铺满瓶底,原代细胞、P1代细胞均呈类软骨样细胞形态;P1代髓核细胞甲苯胺蓝染色异染、番红O染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性;PKH26标记前后细胞活性均在95%以上,1、14、28 d呈递减趋势,但28 d时细胞仍可检测出较强的荧光,标记后的细胞增殖及基因表达(Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖)与标记前的细胞相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论牛尾髓核组织中可以分离出数量满意的髓核细胞,且具有软骨样细胞的表型,可以用作种子细胞;PKH26标记后的髓核细胞无生物学特性的变化,可以用作髓核细胞体内研究的示踪染料。

PKH26标记的骨髓间质干细胞在阿尔茨海默病大鼠中的迁移

目的:研究荧光染料PKH26标记的骨髓间质干细胞(bone-marrow derived mesenchymalstem cells,BM-MSC)在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,以下简称AD)大鼠中的迁移。方法:抽取正常人骨髓,体外分离培养BM-MSC;以PKH26标记第5代BM-MSC,采用流式细胞仪检测BM-MSC表面标记物,并在荧光显微镜下观察PKH26标记率;将PKH26标记的BM-MSC尾静脉注射到正常对照组和AD动物模型组,14天后在大鼠海马区,用荧光显微镜观察PKH26标记的BM-MSC细胞。利用Morris水迷宫实验比较AD模型组和BM-MSC移植组空间学习记忆能力。结果:流式细胞仪检测BM-MSC表面标记物CD73和CD105呈阳性,在体外BM-MSC的PKH26标记率达100%。Morris水迷宫实验比较BM-MSC移植组和AD动物组,BM-MSC移植组在第13、14天时空间学习记忆能力比AD动物组有显著改善。在移植BM-MSC的大鼠海马区可发现PKH26标记的BM-MSC阳性细胞,与DAPI吻合。PKH26阳性细胞在AD动物模型组明显多于正常对照组。结论:BM-MSC不仅能通过AD大鼠的血脑屏障,而且存活在AD大鼠的海马区,并有能够改善AD模型大鼠的学习障碍。