猪PKM2基因的序列分析与组织表达及亚细胞定位

运用RT–PCR技术克隆猪PKM2基因的编码区序列,对该序列进行生物信息学分析,研究PKM2基因的组织表达及亚细胞定位。结果显示:猪PKM2基因CDS全长1 596 bp,编码531个氨基酸;预测其蛋白相对分子质量为5.79×104,等电点为7.96,含有多个磷酸化位点,为稳定蛋白;PKM2蛋白含有丙酮酸激酶家族的barreldomain和alpha/beta domain 2个结构域,其蛋白二级结构中α–螺旋和无规则卷曲占主要类型;猪PKM2蛋白序列在物种间非常保守,系统进化树分析表明,该蛋白与兔的亲缘关系最近;组织表达显示,猪PKM2基因在肾、小肠中相对高表达,而在肝脏与肌肉中相对低表达;亚细胞定位显示,PKM2蛋白在猪3D4/21和PK15细胞中表达于细胞质,而不表达于细胞核。

猪PKM2基因在肺炎支原体感染3D4/21细胞后的互作蛋白质鉴定与分析

通过构建含有HA标签的PKM2过表达质粒转染3D4/21细胞,利用免疫共沉淀(Co-IP)与液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术分析与鉴定猪PKM2基因在肺炎支原体感染猪肺泡巨噬细胞3D4/21后的互作蛋白质,并对这些互作蛋白质进行GO与KEGG通路分析。结果显示肺炎支原体感染3D4/21细胞后,PKM2在mRNA水平和蛋白质水平上表达上调,其表达水平呈现剂量与时间依懒性。免疫共沉淀反应结果显示IP与IgG组共鉴定到72个蛋白质,这2组鉴定到的蛋白质数分别为60和19,其中7个蛋白质在2组中同时鉴定到。GO分析结果表明IP组的互作蛋白质主要参与了NAD代谢过程、NADH代谢过程、肌原纤维组装、NADH再生和葡萄糖代谢丙酮酸等生物过程,其中大多数与能量代谢有关。KEGG pathway分析结果表明互作蛋白质参与了致病性大肠杆菌感染、军团杆菌病、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和癌症中的中枢碳代谢等通路,这些通路与细菌感染和能量代谢有关。

PKM2基因对胆管细胞癌迁移、侵袭及增殖的影响

目的 :检测M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)在胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)组织中的表达情况,探讨PKM2下调对胆管癌细胞迁移、侵袭及增殖的影响。方法:实时定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色分别检测胆管癌及对应癌旁组织标本中PKM2的m RNA和蛋白表达水平。利用慢病毒表达载体系统在胆管癌细胞株Hu CCT-1、HCCC-9810中下调PKM2,分别用划痕实验、Transwell细胞侵袭实验和CCK-8比色法检测细胞迁移、侵袭及增殖能力。结果:胆管癌组织中PKM2的m RNA和蛋白表达水平明显高于对应癌旁组织。经q RT-PCR和Western blot方法证实稳定转染PKM2 sh RNA的胆管癌细胞中PKM2的m RNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P<0.05),与空载对照组(PKM2-NC)和正常对照组(PKM2)相比,实验组细胞(PKM2-sh RNA)的迁移、侵袭及增殖能力明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:胆管癌组织中PKM2表达明显高于癌旁组织,PKM2 sh RNA能有效地降低胆管癌细胞中PKM2基因的表达,PKM2基因沉默可以抑制Hu CCT-1、HCCC-9810细胞的迁移、侵袭及增殖。