马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析

利用依据马铃薯Y病毒(PVY)pl基因序列设计合成的一对引物YP1,YP2,以带毒烟草总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到了0.83kb的目的条带,测序结果表明为PVY pl基因。通过对PVY P1蛋白氨基酸序列分析发现PVY不同分离物间P1蛋白氨基酸序列存在明显差异,氨基酸序列同源性在64％～94％间。依据P1蛋白氨基酸序列建立了PVY系统关系树并对PVY进行了类型分析。

山西省马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析

依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了1对引物,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到852 bp的基因片段并进行了序列测定。BLAST分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系pl基因序列相似性最高可达99%。

根癌农杆菌介导fw2.2和PL基因对Micro-Tom番茄的遗传转化研究

为了快速验证与梨果实大小、硬度相关基因fw2.2、PL是否能够通过转基因植株顺利表达。本研究利用根癌农杆菌介导Micro-Tom番茄技术,以子叶为外植体,分析不同预培养时间、菌液浓度、浸染时间、共培养时间、延迟筛选对抗性芽诱导的影响,得出最优转化体系为:子叶预培养36h,在OD600nm值为0.4菌液中浸染6min,共培养60h,在300mg/L头孢霉素(Cef)、25mg/L卡那霉素(Kan)延迟筛选14d,转入300mg/L Cef、40mg/L Kan分化培养。分别得到转基因阳性株为42株、38株,转化率为14.9%,13.1%。初步验证了fw2.2、PL基因已经整合到Micro-Tom番茄中。

PLS算法在多维数据挖掘判别分类中的研究及应用

针对高维少样本问题,利用偏最小二乘PLS模型,构造适合于小样本问题的挖掘算法。即在PLS的统一框架下,实现维数约简与分类学习,并在基因表达谱(Colon)癌数据分类问题中,实现PLS对小样本数据的挖掘与可视化。与经典算法SVMs进行比较分析,结果验证了PLS算法对高维少样本数据挖掘问题的有效性和可靠性。

pL启动子控制的人白细胞介素4表达

利用高效表达载体及人工合成的寡核苷酸接头,构建了一个新的人rIL-4表达克隆pBMhIL4,在pL启动子的控制下,于大肠杆菌中表达完整的人rIL-4蛋白分子。表达产物以包涵体形式存在于大肠杆菌胞浆,SDS-PAGE分析表明表达的人rIL-4约占总菌体蛋白的5～10%,分子量约为15KD。抽提复性后具有较高的生物学活性,以其TCGF样活性检测每升菌液含人IL-4 1×10~6 U,改良的3.5 M盐酸胍加0.25%Triton X100裂解包涵体法具有更高的回收率和生物学活性。

利用PLS-VIP方法筛选差异表达基因(英文)

提出一种基于变量权重寻找差异表达基因的新方法。该方法的最终目的是从微阵列数据中抽取出核心变量(基因)。将该种方法抽取出的差异表达基因判别样本的能力和普通的PLS方法以及判别最小二乘方法进行比较,结果表明该方法的错误率明显低于其他两种传统方法。因此,PLS-VIP方法是一种较为合适的抽取差异表达基因并判别样本的方法。

空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1基因的检测

目的应用PCR技术检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1的基因。方法从深圳和北京地区分别收集20台、10台空调过滤网上的灰尘样品,分别提取其生物总基因组DNA作PCR模板,分别设计Der f1和Der p1各两套内外扩增引物分两步进行PCR,通过扩增出目的片段来检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1基因片段,并以深层泥土DNA提取物为阴性对照和以培养的粉尘螨、屋尘螨基因组DNA提取物为阳性对照。PCR产物经电泳后切胶回收目的片段并克隆到T载体上,进行DNA序列分析并与Gen Bank进行同源性比较分析。结果深圳地区20台空调空气滤网上收集的灰尘中均含有粉尘螨和屋尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因片段;北京地区10台空调空气滤网上收集的灰尘样品中,只有4份均含有Der f1和Der p1;它们扩增部分的序列与GenBank数据库里相应序列同源性为100%。从阴性对照提取物中未扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段,从阳性对照的DNA提取物中分别扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段。结论本研究首次应用分子生物学技术证实了空调空气滤网上的灰尘中存在尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因,并提示深圳地区空调过滤网灰尘中尘螨可能比北京地区的多,从而为今后防治空调中尘螨引起的变态反应性疾病提供了依据。

p16基因甲基化及蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达

目的探讨p16基因甲基化及蛋白在人非小细胞肺癌组织中的表达情况。方法应用甲基化特异性PCR法(MS-PCR)及免疫组化SP法检测45例非小细胞肺癌组织、21例肺良性疾病组织中p16基因甲基化及蛋白的表达情况。结果肺良性疾病中p16基因甲基化阳性率低于癌组织,差异有显著性(P=0.001),p16基因甲基化与非小细胞肺癌细胞分化程度及淋巴结转移情况有明显的相关性(P<0.05);肺良性疾病中p16蛋白阳性率高于癌组织,差异有显著性(P=0.007);p16蛋白表达与非小细胞肺癌临床分期、细胞分化程度及淋巴结转移情况有明显的相关性(P<0.05)。p16甲基化和p16蛋白表达缺失存在相关性(P=0.004)。结论p16基因甲基化及蛋白的表达情况与非小细胞肺癌的发生、发展有关。

肺癌患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化检测

目的:检测肺癌患者血清中抑癌基因p16、FHIT、APC的甲基化,探讨它们在肺癌发生和诊断中的临床价值。方法:收集120例原发性肺癌患者(肺癌组)、46例肺良性疾病患者(对照组)的血液标本,采用甲基化PCR方法检测2组患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化。采用logistic回归分析肺癌发生的危险因素,计算上述基因甲基化诊断肺癌的准确率。结果:肺癌组血清中p16、FHIT、APC的甲基化率分别为37.5%、34.2%、31.7%,对照组中分别为6.5%、13.0%、10.9%,差异有统计学意义(P均<0.05)。Logistic回归分析提示p16、FHIT基因甲基化均为肺癌发生的独立危险因素,OR(95%CI)分别为7.509(2.160~26.099)、2.927(1.096~7.814)(P均<0.05)。p16、FHIT、APC基因甲基化单项诊断肺癌的准确率分别为53%、49%、47%,3种基因甲基化联合诊断肺癌的准确率为87%,优于单项指标。结论:p16、FHIT基因甲基化均为肺癌发生的独立危险因素;联合检测p16、FHIT、APC甲基化可提高肺癌诊断的准确性。

芒果AP1同源基因的克隆及其生物信息学分析

我们采用RT-PCR方法克隆了2个A州同源基因全长cDNA，分别命名为MAPl—1（GenBankac—cession No．FJ529206）和MAPl—2（GenBankaccession No．FJ529207）。MAPl—1编码247个氨基酸，开放阅读框长度为741bp，蛋白质分子量为28．54kD，等电点为8．31；MAPl—2编码248个氨基酸，开放阅读框长度为744bp，蛋白质分子量为28．78kD，等电点为8．70。同源性分析表明，它们的核苷酸序列与其它木本植物A纠同源基因的一致性为72％～81％。实验分析表明，MAPl—1和MAPl—2第1至第61个氨基酸含有一个MADS盒结构域，第88至第178个为K盒结构域；两个基因均定位于细胞核，且功能位点分布存在着不同，推测这两个基因在花器官发育过程中的功能存在差异。蛋白二级结构预测显示，MAPl—1蛋白有12个α-螺旋，4个8折叠区，14个β-转角；而MAP1—2蛋白有11个α-螺旋，5个B折叠区，15个β-转角；其大多数氨基酸具有亲水性。本研究有助于进一步了解芒果的开花分子机理及成花的生物学发育阶段。

食管鳞癌组织中p16基因缺失及甲基化检测

目的探讨食管癌组织中p16基因表达缺失的机制。方法采用PCR、DHPLC、MSP及免疫组化的方法,检测45例食管鳞癌组织及其相应的间变组织和正常食管上皮组织中p16基因的缺失、突变、甲基化状态及蛋白表达情况。结果正常食管上皮组织中p16蛋白均为正常表达(45/45,100%),间变和癌组织中异常表达率分别为84.4%(38/45)和91.1%(41/45),3者间异常表达率差异有统计学意义(χ2=20.03,P<0.001)。p16蛋白表达异常的41例癌组织中,纯合型甲基化发生率为80.48%(33/41),杂合缺失发生率58.53%(24/41),不缺失发生率41.46%(17/41),均高于p16蛋白表达正常的癌组织。结论该地区食管癌组织中p16基因主要通过纯合型甲基化失活。

肝癌患者血清p16、Runx3基因甲基化及其与临床病理参数的相关性

目的:探讨血清p16和Runx3基因启动子区CpG岛异常甲基化与原发性肝癌(hepatocellular carcino-ma,HCC)关系。方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)法对56例HCC患者、40名健康体检者、40例乙肝患者和40例肝硬化患者血清p16和Runx3基因甲基化状况进行检测。结果:HCC患者血清p16和Runx3基因甲基化检出率分别为69.6%(39/56)和66.1%(37/56),而肝硬化患者、乙肝患者和健康体检者均未检出基因甲基化,与HCC组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析结果均未发现以α=0.05为显著性水准进入回归模型的变量。结论:HCC患者血清中可检测到p16和Runx3基因的甲基化,有助于肝癌的诊断、治疗和预后评估。

多发性骨髓瘤中p16、p15基因甲基化及其mRNA表达的研究

目的探讨p16、p15基因的高甲基化及其mRNA转录阻抑与多发性骨髓瘤的发病和进展之间的关系。方法采用甲基化敏感的限制性内切酶联合聚合酶链反应方法(REP法),检测了28例多发性骨髓瘤患者骨髓细胞p16、p15基因5'端启动子区的甲基化状态,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测多发性骨髓瘤患者p16、p15基因mRNA表达情况。结果p16、p15基因启动子区过度甲基化率分别为57.14%(16/28)、64.28%(18/28),53.57%(15/28)患者同时存在p16、p15基因启动子区过度甲基化。大多数存在甲基化的患者不表达p16、p15基因mRNA。结论p16、p15基因的高甲基化与多发性骨髓瘤的发病有关,p16、p15基因甲基化与其转录阻抑高度相关。

口蹄疫病毒结构蛋白P1研究进展

口蹄疫病毒P1基因编码的结构蛋白是构成口蹄疫病毒衣壳的基础,对诱导动物机体产生中和抗体和其他保护性免疫反应有重要作用。文章综述了口蹄疫病毒结构蛋白的结构、抗原特性以及利用重组P1基因制备口蹄疫新型疫苗和诊断检测制剂的最新研究进展。

诱导方式对P_L启动子控制下人工合成心钠素28肽基因转录动态变化的影响

本文用含有人工合成28肽心钠素基因质粒的大肠杆菌(TAP106-pYX40),分别进行温度诱导和丝裂霉素C诱导,提取菌体中的总RNA,与γ-^(32)P标记的心钠素基因片段进行RNA打点杂交,并通过测定杂交阳性信号的总灰度值(Totalgray value),建立了人心钠素基因特异mRNA相对定量方法,从而观察到温度诱导对P_L启动子控制下的心钠素基团转录发生得慢,特异的mRAN产量较低,但转录所持续的时间长,而丝裂霉素C诱导对P_L启动子控制下的心钠素基因转录发生得快,特异mRNA产量高,但持续的时间短。

人α-型肿瘤坏死因子cDNA在大肠杆菌中的高效表达

人α-型肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)可以在体内或体外特异地杀伤多种肿瘤细胞,并同时具有抗病毒感染及免疫调节活性,是一种非常有前途的抗肿瘤及抗病毒生物制剂。最近,国外用基因工程技术将TNF-α基因克隆并在大肠杆菌及酵母细胞中表达成功。目前,人们正致力于提高其在大肠杆菌中表达产量的研究。据此,我们构建了P_L启动子控制的TNF-α cDNA表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高水平表达。

胃肠道间质细胞瘤p16基因表达与增殖、凋亡的关系

目的 研究胃肠道间质细胞瘤 (GIST)中 p16基因表达与增殖、凋亡的关系[1] 。方法 我们研究了 86例GIST ,采用免疫组织化学法检测p16基因表达 ,采用胶银及免疫组织化学法检测核仁组成区嗜银蛋白 (AgNORs)、增殖细胞核抗原 (PCNA)、抗人增殖细胞抗体Ki 6 7(Ki 6 7)来反映细胞的增殖 ,采用原位末端标记法检测细胞凋亡指数(APl)来反映细胞的凋亡。结果 p16阳性、阴性表达组的AgNORs、PCNA、Ki 6 7表达分别为 3.6 8± 1.78、6 .5 6± 1.82 (P <0 .0 1)、11.37± 6 .2 6、2 2 .13± 8.73(P <0 .0 1)、3.2 5± 2 .4 7、7.74± 3.0 5 (P <0 .0 1) ;p16阳性、阴性表达组的APl分别为 14 .92± 6 .84、7.78± 3.91(P <0 .0 1)。结论 p16基因具有明显的抑制增殖、促进凋亡的作用 ,进而影响GIST的发生、发展。

淡紫拟青霉丝氨酸蛋白酶基因克隆表达及抗血清的制备

[目的]探索利用大肠杆菌进行丝氨酸蛋白酶PL基因的克隆与表达及抗血清制备的方法。[方法]根据报道的PL蛋白基因序列设计1对引物,通过RT-PCR扩增获得PL基因片段,对重组载体进行构建、鉴定和序列分析,用表达的特异蛋白条带制备抗原,免疫家兔制备抗血清。[结果]通过RT-PCR扩增得到长约850 bp的PL基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,获得的重组子pET-22b-PL转化E.coliBL21(DE3),经最终浓度为1 mmol/L IPTG诱导37℃培养4 h,获得约31 kDa大小的重组蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明,该蛋白表达量占菌体总蛋白的60%,说明该蛋白得到了高效表达。用表达的特异蛋白条带制备的免疫家兔制备抗血清,经ELISA测定效价为1/10 000。[结论]通过基因重组可获得PL基因在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性。

急性白血病p16基因微卫星不稳定性及杂和性缺失的研究

目的分析急性白血病(AL)患者p16基因连锁的微卫星不稳定性(MSI)和杂和性缺失(LOH),了解p16基因改变与AL发生的关系。方法采用多重PCR方法检测53例AL患者骨髓及口腔黏膜细胞标本的p16基因连锁的3个微卫星位点(D9Sl62、D9S1748、D9S171),观察其MSI及LOH情况。结果53例AL患者中,MSI检出率为43.4%(23/53);位于9p21的p16基因连锁的微卫星D9Sl62、D9S1748、D9S171的LOH发生率分别为0(0/53)、5.7%(3/53)和9.4%(5/53),MSI发生率分别为13.2%(7/53)、7.6%(4/53)和7.6%(4/53)。结论AL患者p16基因连锁微卫星均可检测到高频率的MSI和LOH,说明p16基因突变与AL发生、发展有关。

样条变换偏最小二乘在肝癌数据分类中的应用

肝癌是中国最常见的恶性肿瘤之一。基于肿瘤基因表达谱数据的分析与研究是当今研究的热点,对于癌症的早期诊断、治疗具有十分重要的意义。针对高维小样本基因表达谱数据所显现的变量间严重共线性、类别变量与预测变量的非线性关系,采用了基于样条变换的偏最小二乘回归新技术。首先通过筛选法去除基因表达谱数据中的冗余信息,然后以3次B基样条变换实现非线性基因表达谱数据的线性化重构,随后将重构的矩阵交由偏最小二乘法构建类别变量与预测变量间的关系模型。最后,通过对肝癌肿瘤基因表达谱数据的分析,结果显示此分类模型对数据重构稳健,有效的解决了高维小样本基因表达谱数据间的过拟合和变量间的共线性,具有较高的拟合和分类正确率。