孕妇血浆中胎儿特异性C21orf105、PLAC4 mRNA的检测

目的:探讨孕妇血浆中胎儿特异性C21orf105、PLAC4 mRNA的稳定性及其表达量检测的临床价值。方法:1收集30例健康单胎妊娠妇女的血样,分为8组,其中4组分别在室温中放置0、6、24、72 h,余4组分别于4℃条件下放置0、6、24、72 h,然后采用实时荧光定量RT-PCR法检测C21orf105、PLAC4 mRNA。2收集健康单胎妊娠妇女的血样,其中经染色体核型分析证实胎儿为21-三体综合征的孕妇38例,胎儿染色体正常的孕妇40例,同法检测血浆C21orf105、PLAC4 mRNA。结果:30例孕妇血浆中均能检测到C21orf105、PLAC4 mRNA,孕妇血浆室温放置72 h后,C21orf105、PLAC4 mRNA无明显降解(P>0.05)。21-三体综合征胎儿孕妇血浆中C21orf105、PLACA4mRNA表达量高于正常胎儿孕妇(P<0.001)。结论:母体血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA很稳定,其检测有望成为21-三体综合征产前筛查的有效指标。

北京地区汉族人群21号染色体PLAC4基因上SNP位点多态性的研究

目的运用MLPA-SNP方法检测北京地区汉族人群中21号染色体上PLAC4基因的多个SNP位点,并分析其多态性的特点。方法运用多重链接探针扩增技术(MLPA),对378例北京地区汉族人群标本中PLAC4基因上5个SNP位点(rs12482116,rs12106409,rs12106401,rs4818219,rs3804026)同时进行检测分析,计算其等位基因频率及基因型频率。结果被检测的5个SNP位点均出现扩增峰(单峰或双峰),378例被检测样本中,位点rs12482116,rs12106409,rs12106401均呈单峰;位点rs4818219:112例呈双峰,266例呈单峰,杂合基因型频率0.288,位点rs3804026:40例呈双峰,338例呈单峰,杂合基因型频率0.109,两个杂合型位点与UCSC数据库提供的基因频率相比较,经χ2检验,P<0.005,有统计学差异。结论位点rs4818219,rs3804026可用于无创性产前诊断21三体的研究中,而rs12482116,rs12106409,rs12106401均为纯合型,不宜使用。应尽可能筛选出更多的杂合频率高的位点用于无创性产前诊断的研究,而MLPA-SNP可同时对多个SNP位点进行检测分析,且耗时短,是一种十分可行的方法。

两种胎儿特异性mRNA在母血中的表达研究

目的：检测孕妇外周血中着血红蛋白基因和PLAC4基因mRNA表达水平,比较其特异性及实用性。方法：选取55例正常妊娠孕妇和21例健康非孕妇女为研究对象,提取全血总RNA,采用实时定量PCR法检测着血红蛋白基因和PLAC4基因mRNA表达水平,并探讨其与孕龄的相关性。结果：55例孕妇外周血中14例扩增出胎儿着基因片段,31例为阴性；胎儿着血红蛋白基因mRNA质量浓度最小为0.571×103 copies/ml,最大为1.812×103 copies/ml,中位数为1.15×103 copies/ml,在孕7~10周该基因浓度与孕龄呈负相关（ P〈0.05）。55例正常妊娠孕妇外周血均扩增出PLAC4基因片段,最小值为1.853×103 copies/ml,最大值为15.221×103 copies/ml,中位数为7.836×103 copies/ml,表达水平与孕龄无相关性（P〉0.05）。21例健康非孕妇女外周血均未扩增出着血红蛋白基因和PLAC4基因片段。结论：与着血红蛋白基因mRNA相比较, PLAC4基因mRNA具有特异性更强、与孕龄无关、阳性率更高等优点,更适用于21三体的无创性产前诊断。

应用Multiple-SNaPshot技术无创性产前检测唐氏综合征

目的：探讨1种相对便捷。准确。经济的适用于杂合型SNP位点的无创性产前检测胎儿唐氏综合征的方法。方法：选择50例孕整倍体胎儿（孕15-21周）。13例孕21三体胎儿（孕19-26周）的母血浆样本,应用Multiple-SNaPshot法检测胎盘源性PLAC4基因上5个SNP等位基因的基因比率及其杂合性,从而对杂合型SNP位点的胎儿无创性产前检测唐氏综合征;同时对我国苏南地区200例人群的5个SNP位点进行基因型别研究。结果：从63例单胎孕妇外周血中成功提取到PLAC4 mRNA,检测出17例PLAC4上为杂合型SNP的样本,通过分析SNP等位基因比率检测出14例正常整倍体胎儿及3例21三体胎儿。苏南地区人群PLAC4上Rs8130833和Rs4818219位点的杂合度分别为0.278和0.343。结论：对PLAC4基因上为杂合型SNP位点的胎儿,用Multiple-SNaPshot法检测其等位基因比率可用于无创性产前筛查唐氏综合征。苏南地区人群PLAC4基因上SNP杂合度较高的位点有Rs8130833和Rs4818219。

一种改进的异硫氰酸胍法结合硅胶膜离心吸附柱提取孕妇外周血微量胎儿RNA的方法

孕妇外周血中存在胎儿RNA为无创性产前诊断提供了基础.但血液中富含RNA酶和微量胎儿RNA的特点,对从孕妇血浆中提取胎儿RNA带来困难.我们以ε血红蛋白基因和胎盘特异表达基因4(PLAC4)mRNA作为研究对象,用改进的异硫氰酸胍法结合硅胶膜离心吸附柱法探索孕妇外周血中胎儿微量RNA的提取方法,获得满意效果.30例孕妇和9例非孕妇外周血样品中总RNA经凝胶电泳测定显示3条带,分别为28S,18S和5.8S.其28S条带亮度为18S亮度的2倍.总RNA质量浓度(A260/A280)为1.97 g/L,光密度比值(A260-A320)/(A280-A 320)为1.86.30例孕妇外周血样本有7例提取到ε血红蛋白基因mRNA,ε血红蛋白基因mRNA的最小浓度为0.537μg/mL,最大浓度为1.79μg/mL,ε血红蛋白基因mRNA的浓度中位数为1.24μg/mL.30例孕妇外周血样本提取到PLAC4基因mRNA,浓度最小值为2.105×103 copies/mL,最大值为12.760×103 copies/mL,而9例非孕妇中均未提取到(P<0.01),浓度中位数为6.612×103 copies/mL.因此,改进的异硫氰酸胍法与硅胶膜离心吸附柱纯化法相结合,可有效抑制RNA降解,用于提取、纯化孕妇血液中微量胎儿RNA.

唐氏综合征无创性产前诊断的研究

目的探讨应用逆转录-多重链接探针扩增技术(RT-MLPA)检测RNA-SNP进行临床无创产前诊断唐氏综合征的可行性。方法收集217例14孕周以上(含14孕周)孕妇的外周血血清,抽提胎儿游离RNA,RT-MLPA技术扩增SNP位点片段,并对其进行毛细管电泳分析,通过对杂合SNP位点峰面积比值进行判断,并选择唐氏综合征产前诊断金标准-染色体核型分析结果作为对照方法。结果检测到阳性样本61例,检测的灵敏度和特异度分别为92.42%和99.30%。结论逆转录-多重链接探针扩增技术检测RNA-SNP进行临床无创产前诊断唐氏综合征的方法在唐氏综合征的产前筛查中具有广泛的应用前景。

用改良绝对定量法检测正常孕妇与妊娠21三体胎儿孕妇外周血游离核酸浓度

目的运用一种改良的绝对定量PCR法比较分析正常孕妇组与妊娠21-三体孕妇组外周血中游离PLAC4-DNA浓度的变化;方法采用长片段扩增子代替质粒构建标准曲线,根据生成的标准曲线方程计算出两组孕妇外周血中游离PLAC4-DNA的浓度值,经两独立样本t检验分析两组结果差异;结果长片段扩增子构建的标准曲线方程:Y=-3.334X+43.438,R2=0.996,Eff%=99.478%。根据标准曲线方程得出,300例正常孕妇组PLAC4平均浓度:58.4 copies/μl,20例妊娠21三体孕妇组平均浓度:62.6 copies/μl,,经两独立样本t检验,P=0.439;结论改良的长片段扩增子构建标准曲线具有操作简便,成本低,准确性高的优点,可为绝对定量提供一种经济简便且有效的参考方法。通过绝对定量法检测得出正常组孕妇与妊娠21-三体孕妇组外周血中总的游离PLAC4-DNA的变化无统计学差异。

胎盘特异性基因4 mRNA基因在孕妇外周血中的检测及临床价值

目的:应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术对不同孕周孕妇外周血浆胎盘特异性基因4(PLAC4)m RNA基因进行检测,寻找唐氏综合征产前诊断的可靠生物学标志物,为无创性产前诊断提供新的突破口。方法:按入组标准随机选取健康育龄未妊娠女性5例,正常健康妊娠孕妇60例(早期妊娠20例、中期妊娠20例、晚期妊娠20例),唐氏筛查高危孕妇8例,正常分娩24 h女性5例。共收集外周血浆样本78例。应用RT-PCR技术,检测样本中的PLAC4 m RNA基因含量,并进行相对定量分析。结果:健康育龄未妊娠女性及正常分娩后24 h女性外周血浆中均无游离胎儿PLAC4 m RNA基因的存在;正常健康妊娠孕妇不同孕周标本均检测到PLAC4 m RNA基因,以早期妊娠作为对照,中期妊娠是早期妊娠的1.99倍,晚期妊娠是早期妊娠的3.73倍;唐氏筛查高危孕妇均检出PLAC4 m RNA基因,含量是早期妊娠的6.36倍。结论:PLAC4 m RNA基因有望成为唐氏综合征产前诊断的可靠性生物学标志物。