信号分子PLCγ-2PH结构域与PKC的结合

目的： 从大鼠脾脏克隆信号分子ＰＬＣγ２ 氨基端ＰＨ 结构域基因， 并进行ＧＳＴ 融合表达。检测信号分子ＰＬＣγ２ 氨基端ＰＨ 结构域与ＰＫＣ 的结合， 为进一步研究其在信号转导中所介导的功能、寻找其新配基奠定基础。方法：采用异硫氰酸胍变性和酚氯仿抽提的方法， 从大鼠新鲜脾组织中提取总ＲＮＡ， 紫外线定量后，反转录合成ｃＤＮＡ，以ＰＣＲ 扩增目的基因片段，双酶切后定向克隆到载体ｐ ＵＣ１９ 中。将引物末端用同位素（［ｒ － ３２ｐ］ＡＴＰ） 标记后，以双脱氧终止法测序；再将基因片段定向克隆到表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１ 中。以ＩＰＴＧ 在低温条件下（２６ ℃） 诱导１ ｈ ，进行ＧＳＴ融合表达。用ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ“锚定”，并纯化表达的ＧＳＴＰＨ 融合蛋白。将Ｊｕｒｋａｔ 细胞的裂解液与上述纯化的融合蛋白共孵育，以Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测ＰＨ 结构域与ＰＫＣ 的结合。结果： 信号分子ＰＬＣγ２ 的ＰＨ 结构域基因完全正确，内部不含终止码，为一开放读框。在表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１ 中得到融合表达，表达产物为可溶性的。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测到ＰＨ 结构域与ＰＫＣ 的结合。结论：从组织细胞中克隆ＰＨ

bFGF激活tyrosine kinase／PI3K／PLCγ增加血管内皮细胞[Mg^2＋]i的研究

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)对人脐带静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells,HUVECs)内游离镁离子浓度([Mg2+]i)的调节机制研究。方法我们采用荧光指示剂mag-fura-2,运用PTi阳离子测定系统动态测HUVECs的[Mg2+]i。结果经酪氨酸激酶阻断剂(tyrphostin A23和genistein)、3-磷脂酰肌醇激酶阻断剂(wortmannin和LY294002)、磷脂酶Cγ阻断剂(U73122)预处理,能阻断bF-GF诱导的[Mg2+]i增加。但经磷脂酶Cγ阻断剂无活性的类似物(U73343)和丝裂原活化蛋白激酶阻断剂(SB202190和PD98059)预处理,不能阻断bFGF诱导的[Mg2+]i增加。结论bFGF通过酪氨酸激酶/3-磷脂酰肌醇激酶/磷脂酶Cγ信号传递途径使细胞内的Mg2+库释放Mg2+,从而增加HUVECs的[Mg2+]i。

磷脂酶Cγ-2对B细胞的作用及临床应用

受体编辑是B细胞免疫耐受发展的主要机制。大量研究表明,受体编辑异常与恶性肿瘤、自身免疫性疾病和免疫缺陷病的发病机制有关,其中磷脂酶Cγ-2(PLCγ2)是前BCR和BCR受体转导途径的重要分子,对B细胞及受体编辑起调节作用。因此,明确磷脂酶Cγ-2对受体编辑的作用可为相关疾病的早期临床诊断和治疗提供理论依据。