miR-138靶向PLD2基因对口腔癌细胞增殖、迁移的影响

目的:探讨miR-138靶向PLD2基因抑制口腔癌细胞增殖、迁移的机制。方法:口腔癌细胞转染miR-138后,采用RT-PCR检测细胞中miR-138的表达水平,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞转染miR-138后细胞周期的分布,Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力;采用Western免疫印迹实验检测胃癌细胞MMP-9、PLD2及Cyclin D1的表达水平,采用荧光素酶报告实验分析miR-138与PLD2基因的靶向关系。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果:口腔癌细胞转染miR-138后,miR-138相对表达水平为4.28±0.16,显著高于空白对照及miR-NC组(P<0.05)。荧光素酶报告基因实验发现,口腔癌细胞转染miR-138后,PLD2野生质粒荧光素酶相对活性低于其他组(P<0.05),miR-138组的PLD2的mRNA表达水平低于空白对照及miR-NC组(P<0.05)。口腔癌细胞转染miR-138后,miR-373组的口腔癌细胞的增殖能力低于空白对照及miR-NC组(P<0.05)。流式细胞术实验发现,miR-138组的G0/G1期比例为(64.39±6.49)%,显著高于空白对照组及miR-NC组(P<0.05);miR-138组S期比例为(13.28±3.16)%,显著低于空白对照组及miR-NC组(P<0.05);各组G2/M期比例差异无统计学意义(P>0.05)。Transwell实验发现,口腔癌细胞转染miR-138后,迁移细胞数量为138.46±24.37,显著低于空白对照组及miR-NC组(P<0.05)。Western免疫印迹实验发现,miR-138组MMP-9的相对水平为0.14±0.04、Vimentin的相对水平为0.17±0.02、Cyclin D1的相对水平为0.15±0.03,均显著低于空白对照组及miR-NC组(P<0.05)。结论:miR-138可靶向调控PLD2基因表达,对口腔癌的增殖、迁移能力产生抑制作用。

毛果杨PLD基因家族全基因组水平鉴定及其盐胁迫下的表达分析

[目的]对木本模式植物毛果杨PLD基因家族的进化中的选择压力、启动子中顺式作用元件、组织表达特性以及盐胁迫下表达模式进行分析,为挖掘PtrPLD在非生物胁迫中作用提供参考。[方法]利用拟南芥PLD基因家族蛋白序列比对得到毛果杨基因组同源基因,再经过保守结构域鉴定后确定PtrPLD基因;利用软件ClustalW和MEGA对PtrPLD和AtPLD基因的氨基酸序列进行比对和系统进化分析;利用MEME、PlantmPLoc、 ExPasy等软件工具分析PtrPLD基因及编码蛋白的特征;利用Tbtools软件分析同源基因的Ka/Ks值;利用Plantcare在线工具分析PtrPLD启动子中顺式作用元件;利用Phytozome转录组数据库以及qRT-PCR分析PtrPLD组织表达特性;利用qRT-PCR分析各组织中PtrPLD对盐胁迫响应情况。[结果]PtrPLD家族的16个基因可分为C2-PLD和PX/PH-PLD 2个亚家族,分别包含13个和3个基因;有7对旁系同源基因且它们之间的Ka/Ks均远小于1;PtrPLD家族基因启动子区含有大量非生物胁迫和激素响应元件,其中,PtrPLDδ4启动子共含有9种、20个元件;PtrPLD家族编码的蛋白均含有Motif 1~4,且同一进化分支上的基因编码蛋白序列高度保守。PtrPLD基因家族表达特性分析表明,PtrPLD家族基因在根、茎和叶中具有表达特异性,并且多数成员主要在根部表达;NaCl胁迫下,PtrPLD家族基因在根、茎和叶中表达量在0~72 h内均表现为先上升后下降再上升的变化趋势。[结论]PtrPLD家族基因在毛果杨响应盐胁迫过程中有着重要作用,本项研究对于今后PtrPLD家族基因生物学功能的鉴定与非生物逆境胁迫响应基因资源的挖掘具有推动作用。

蒙古冰草PLD基因cDNA克隆及生物信息学分析

以蒙古冰草（Agropyron mongolicumKeng）叶片为材料。根据已报道的醉酒毒麦PLD基因片段设计特异引物,通过RT-PCR和RACE技术,获得蒙古冰草PLD基因的全长cDNA（GenBank登录号为EU333811）。该基因cDNA全长2 966 bp,包含2 439 bp的完整开放读码框,编码813个氨基酸。BlastP搜索结果显示,该基因推测的氨基酸序列与已克隆的醉酒毒麦、玉米、水稻PLD基因氨基酸序列的一致性为80%-89%。利用生物信息学软件在线分析其序列结构、氨基酸组成及编码氨基酸的性质和结构,结果表明：该基因编码的蛋白为可溶性蛋白,其相对分子量为92 079.2 Da,理论等电点为5.24,无跨膜域、无信号肽;其二级结构主要以无规卷曲为主;三级结构显示紧靠N端处为C2域,在中间和靠近C端处存在PLD的标志序列,即HKD基序。系统进化树显示,蒙古冰草PLD与醉酒毒麦的亲缘关系最近。

转反义PLDγ基因小麦的获得及其抗白粉病的初步鉴定

利用穗茎注射法将反义PLDγ基因导入烟农15和农大1521两个小麦品种中,旨在获得抗病性增强的转基因植株。结果表明:T3代经PCR及PCR-Southern杂交鉴定,目的基因已经整合到小麦的基因组中,并能在小麦基因组内稳定遗传;烟农15和农大1521的6个转基因株系的抗白粉病的能力明显增强。

渗透胁迫下扁穗冰草生理变化与PLD基因的表达差异

为分析扁穗冰草(Agropyron cristatum)抗旱特性,以扁穗冰草实生苗为研究材料,进行干旱胁迫条件下脯氨酸、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、可溶性糖生理指标的测定及用Real-time qPCR方法分析扁穗冰草PLD基因表达差异。结果表明,不同渗透胁迫条件下扁穗冰草的脯氨酸、POD和可溶性糖含量的变化以及扁穗冰草PLD基因表达量都与扁穗冰草渗透胁迫相关。

奶牛精子变形期间Pld6基因表达及蛋白序列分析

本研究旨在揭示精子线粒体鞘形成机制,提高种公牛繁殖潜力。采集3头健康状况良好、15～17月龄荷斯坦公牛睾丸和附睾组织,通过冷冻切片和激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术获取圆形和长形精子细胞,浮游法获取附睾尾精子,并采用TRizol法提取各样本RNA,对奶牛精子形成过程中的转录组进行差异分析和q PCR检测,利用生物信息学技术对其中Pld6蛋白结构和功能进行预测分析。结果表明,在精子形成过程中,Pld6基因在圆形～长形精子细胞发育过程中表达升高,而在成熟过程中转录降低甚至关闭。Pld6基因富集在线粒体融合(mitochondrial fusion)条目上,与精子尾部中段线粒体分布和形态结构相关,其蛋白为跨膜蛋白,第10～32位氨基酸是跨膜区域,三级结构呈喇叭状,在喇叭内部具有保守且呈β折叠的H(X) K(X4) D (HKD)酶活性结构域,与小鼠Pld6结构相似,且两者具有最接近的进化趋势。综上表明,根据小鼠研究推断牛精子变形过程中,Pld6基因表达增多可诱导线粒体向精子细胞尾部中段聚集,促进了线粒体鞘的正常形成,对确保牛精子活力及受精能力具有重要作用。

转反义PLD_γ基因小麦的分子鉴定

为了提高小麦的耐逆性,采用穗茎注射法将反义PLDγ基因导入小麦品种LK906中。通过卡那霉素筛选获得了91株抗性植株。提取抗性植株叶片DNA进行PCR扩增,结果有42株扩增出430 bp目的条带,PCR-Southern杂交也证实其为阳性。RT-PCR检测发现,反义PLDγ基因在10株植株已经表达。同时试验发现,转基因小麦的耐盐性与对照相比均达到极显著水平。从分子水平及性状表现说明目的基因已经转入受体小麦中且能够成功表达。

甘蓝型油菜2个BnPLDα基因的克隆与表达

该实验采用同源克隆技术在甘蓝型油菜中克隆得到2个重复的编码磷脂酶D的PLDα基因,命名为BnPLDα1和BnPLDα2(GenBank登录号为KF113586和KF113587),两者核苷酸序列一致性为87.33%。对BnPLDα1和BnPLDα2编码蛋白进行序列比对分析发现,两者序列一致性为91.01%,大部分差异残基零散地分布于氨基酸全序列中,但在PLDα蛋白活性催化位点的第1个HKD基序紧邻的一段序列中,差异氨基酸残基数达到7个。此外,2个蛋白的三维结构预测结果也存在较大差异。对BnPLDα1和BnPLDα2基因进行表达分析发现,两者在生长旺盛的组织部位表达量较高;低温胁迫下BnPLDα1表达上调,而BnPLDα2表达不受影响;干旱和盐胁迫下,两者上调至最大作用时间点不同,BnPLDα1在盐胁迫信号转导中起主导作用,而BnPLDα2在干旱胁迫信号转导中起主导作用;高温胁迫下,两者表达均呈下调趋势。研究表明,BnPLDα1和BnPLDα2在甘蓝型油菜逆境防御系统中发挥作用,但表达模式的差异性可能会使两者呈现出异于原始基因的多样性功能。

砂藓RcPLD基因的抗旱功能分析

砂藓(Racomitrium canescens)是一种具有极强耐脱水性的苔藓植物,编码磷脂酶D的基因RcPLD能够在砂藓的脱水和复水过程中产生显著的表达响应,它可能参与了砂藓的强耐脱水性功能。该研究使用已克隆的RcPLD编码序列构建拟南芥(Arabidopsis thaliana)过量表达转基因株系rcpld-oe,初步考察过表达株系的干旱胁迫耐受能力及其相关的生理生化指标,分析RcPLD增强拟南芥抗旱性的机制。结果表明:(1)利用已克隆的RcPLD编码序列构建了植物中的过表达载体,成功构建了RcPLD的过表达转基因拟南芥株系rcpld-oe,并获得了多个T3代rcpld-oe纯合体株系。(2)在正常生长条件下,rcpld-oe株系T3代纯合体植株比野生型拟南芥植株体积小,但营养生长期较长,抽薹较晚,莲座叶衰老速率较慢;在干旱处理条件下,rcpld-oe株系表现出比野生型拟南芥更强的干旱耐受能力。(3)在干旱胁迫处理过程中,rcpld-oe株系莲座叶的水分散失速率降低,可能在一定程度上降低了干旱对膜完整性的损伤和光合作用的抑制,但其渗透调节物质含量的变化相对较小。研究发现,在干旱胁迫条件下,rcpld-oe植株莲座叶的水分散失速率和光合作用抑制程度显著降低,从而表现出明显强于野生型的干旱耐受能力,这为后续RcPLD功能的深入研究和更多砂藓抗旱功能基因的挖掘奠定了基础。

花生编码磷脂酶D的类PLD基因的鉴定和部分测序(英文)

花生工业界认为收获前花生黄曲霉毒素的污染是全世界花生工业界面临的最严峻的挑战。干旱胁迫是加重花生黄曲霉真菌侵染和毒素污染最重要的环境因素。选育花生抗性品种将使美国花生工业处于优势地位。在这一研究报告中 ,我们鉴定出了一个新的类PLD基因 ,它编码磷脂酶D。在植物体中 ,这个酶是负责干旱诱导降解细胞膜磷脂的主要酶。克隆的PLD1片段有 1 0 69个核甘酸对长。推导的氨基酸序列与已知的PLD基因有很高的同一性 ,包括相似的保守序列特征 ,比如两个HXKXXXXD基元。对花生PLD基因特性需要从遗传和生理上作进一步研究 。

与家族性系统性红斑狼疮有关的PLD2基因新突变及其功能分析

目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是严重危害人类健康的自身免疫性结缔组织病,遗传因素在SLE的发病中起关键作用。本研究探讨与家族性SLE有关的磷脂酶D2(phospholipase D2,PLD2)基因新突变,并进一步探讨该突变致SLE的可能机制。方法:收集SLE患者、患者父母及147例正常对照的静脉血,抽提全血DNA。对患者及其父母行全基因组高通量测序,并对测序结果采用多种生物信息学方法进行分析。进一步构建野生型(wild type,wt)、突变型(mutant type,mu)及阴性对照PLD2质粒并转染293细胞,采用蛋白质印迹法检测各组293细胞中调控PLD2-Ras信号通路的关键基因HRAS的蛋白质表达水平。结果:在该SLE家系中,女性SLE患者及其母亲、Ⅱ及Ⅲ代各1例有典型的SLE临床表现,且均较早出现狼疮性肾炎,其遗传特点符合常染色体显性遗传。发现患者及其母亲新的PLD2杂合突变(c.2722C>T),且患者父亲及其他正常对照中未发现该突变。与转染wtPLD2质粒和阴性对照PLD2质粒比较,转染muPLD2质粒的293细胞中HRAS的蛋白质表达水平显著上调(均P<0.05)。结论:PLD2 c.2722C>T突变可能是导致该SLE家系发病的原因之一。

大豆磷脂酶D家族基因全基因组鉴定及耐盐性分析

磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)及其产物磷脂酸(Phosphatidic Acid,PA)在植物生长发育和胁迫响应的调控中起着重要作用。目前,对大豆PLD基因家族的研究仍不够全面。为进一步寻找与大豆抗逆性相关的潜在候选基因,本研究利用全基因组分析方法对28个GmPLDs的基因结构、蛋白保守结构域、共线性和系统发育关系等进行研究,并采用qRT-PCR方法分析基因在盐胁迫下的表达量。结果表明:大豆PLD家族基因分布在16条染色体上,片段复制在大豆PLD基因家族的扩展中发挥了重要作用。基因表达模式分析显示GmPLDs在不同组织中的表达存在差异,启动子顺式作用元件分析显示GmPLDs具有参与非生物胁迫和激素途径的潜在功能。qRT-PCR分析显示,18个大豆PLDs基因表达受盐胁迫诱导显著上调,可能参与大豆耐盐胁迫。研究结果为解析及克隆大豆耐盐基因提供理论依据,并为挖掘响应非生物逆境胁迫GmPLDs基因提供了基础信息。

转基因三倍体毛白杨抗盐试验研究

试验设计4～11g·kg^-18个NaCl浓度梯度，对转PLD／AtNHXI基因抗盐碱三倍体毛白杨进行组培苗抗盐分化试验，设计2～10g·kg^-19个NaCl浓度梯度进行组培苗抗盐生根试验，设计3～12g·kg^-110个NaCl浓度梯度对1年生盆栽苗进行抗盐试验，结果表明：在NaCl浓度达8g·kg^-1时，转基因三倍体毛白杨分化培养37d后，组培苗的叶色、分化芽数及新稍长度开始受到影响，随着NaCl浓度的增大将抑制组培苗分化生长，甚至枯萎死亡；在含NaCl7g·kg“的生根培养基中，培养20d后，虽然叶色没有受到盐太大的影响，但生根和新稍的生长都开始受到抑制，根系明显的减少；在含NaCl7g·kg^-1的土壤条件下，盆栽苗培养32d后，开始表现出盐害症状。

农杆菌介导的双价抗盐基因转化番茄的研究

植物的耐盐性是一个多基因控制的复杂性状,将多个耐盐相关基因导入同一植物更有助于提高植物的耐盐能力。运用农杆菌介导法向转AtNHX1(拟南芥Na+/H+逆向运输蛋白编码基因)的番茄(Lycopersicumesculentum L.Moneymaker’)株系X1OEA1自交二代植株(T2)中转入山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)。PCR、Southern、RT-PCR和甜菜碱含量分析结果表明,BADH已经整合到番茄基因组中,并在转基因植株中转录和翻译表达。叶绿素荧光(Fv/Fm)、相对电导率(Rc/Rc’)、叶绿素含量(Chla+b)、叶绿素a/b比(Chla/b)、光合速率(Pn)测定结果表明,200mmol·L-1NaCl胁迫下,双转化的番茄植株各项生理指标均优于单转化AtNHX1的番茄。转双基因植株TT0-2随着NaCl浓度的增加,Fv/Fm值下降幅度最小;相对电导率与非胁迫条件下相比增加了3.6倍,而单转化AtNHX1的T2增加了4.2倍;与转单基因植株T2相比,茎部干重、鲜重分别增加12.5%、19.8%;叶部干重、鲜重分别增加22.5%、14.0%,差异达显著水平。初步证明双基因转化有助于增强番茄的耐盐性。同时对番茄的转化系统进行优化的结果表明,使用抗生素特美汀的转化效率明显高于头孢霉素的。

高山离子芥磷脂酶Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建

磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1 600bp,blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化PCR产物,克隆至pTG19-T载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础.

硒对糖尿病大鼠肝脏磷脂酶D基因表达的影响

目的:研究硒对糖尿病大鼠代谢相关基因表达的调控作用。方法:对前期研究分离到的与补硒50μg/kgbwd有关的糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序及同源性分析,选择目的基因进行RT-PCR验证,以观察各组大鼠之间肝脏中基因表达的变化。结果:差异显示基因片段Se-4的碱基序列与磷脂酶D(PLD)基因片段的同源性为100%。RT-PCR验证结果显示:PLDmRNA在糖尿病对照组、糖尿病补硒组大鼠肝脏中的表达水平较正常对照组明显增高,但糖尿病补硒组PLDmRNA的表达较糖尿病对照组有所降低(P<0.05)。结论:硒可抑制糖尿病大鼠肝脏中PLDmRMA的表达,这可能是硒改善糖尿病糖、脂代谢紊乱的分子机制之一。

甘蓝磷酯酶D HKD2功能区基因片段的克隆与反义表达载体的构建

以甘蓝 (Brassiaca oleracea)为材料 ,取幼叶分离 m RNA,反转录合成 c DNA,以 c DNA第一链为模板 ,通过 PCR扩增 ,获得甘蓝磷酯酶 D (Phosphorate Lipid Dehydrolase,PLD) HKD2功能区的基因片段 .对其进行Blast分析 ,结果表明 ,分离的目的片段核苷酸序列与 Genbank中报道的甘蓝 PLD基因相比同源率为 99.7% ,只有 2个碱基发生改变 .将得到的 PLD基因片段插入植物表达载体 p AT940 ,构建了 PLD基因反义表达载体p ATC-r PLD,为下一步进行抗逆转基因作物选育打下基础 .

补锌糖尿病大鼠肝脏糖脂代谢相关基因表达

目的探讨补锌对糖尿病大鼠肝脏糖脂代谢相关基因蛋白磷酸酶2A(PP2A)和磷脂酶D(PLD)表达的调控。方法对补锌糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序及同源性分析;设计基因序列引物,RT-PCR检测观察各组大鼠肝脏中基因表达的变化。结果结果显示,片段Zn-4、Zn-8的碱基序列分别与PLD、PP2A同源性为100%,99%。糖尿病对照组PP2A mRNA表达量(0.5072±0.0574)低于正常对照组(1.3303±0.1855),P<0.05;糖尿病补锌组PP2A mRNA的表达量(0.7005±0.1563)与糖尿病对照组比较有所恢复(P<0.05)。糖尿病对照组PLD mRNA表达量(1.0754±0.0312)和糖尿病补锌组PLD mRNA的表达量(1.0130±0.0992)均高于正常对照组(0.7995±0.1040),P<0.05;糖尿病补锌组PLD mRNA的表达量与糖尿病对照组比较无变化(P>0.05)。结论补锌对糖尿病大鼠肝脏PP2A mRNA表达有上调作用,这可能是锌改善糖尿病糖、脂代谢紊乱的分子机制之一。

磷脂酶D(PLD)在植物信号转导中的作用

磷脂酶D是植物中一类主要的磷脂水解酶。它的作用不仅在于通过水解细胞膜中的磷脂而影响到膜的结构、功能和稳定性 ,而且最近几年的研究发现它在细胞的信息传递、激素作用的发挥、膜运输、细胞增殖、细胞骨架组装、细胞的防御反应、分化和生殖等过程中都有重要作用。由于这一发现 ,使对磷脂酶D (PLD)的研究掀起了一场热潮。本文就PLD基因分离与克隆 。

日本结缕草(Zoysia japonica)磷脂酶D基因部分保守序列的克隆及其对机械损伤的响应

以日本结缕草Zenith为材料,通过同源克隆的方法克隆出其磷脂酶D(PLD)基因部分保守序列,序列长399 bp,并通过实时荧光定量PCR检测PLD基因在机械损伤胁迫下随时间变化的表达模式。结果表明,磷脂酶D在胁迫2 h内大量表达,随后逐渐降低,在9 h已接近于对照水平,说明PLD基因在损伤初期大量参与了应对机械损伤胁迫的防御与修复过程,在损伤后期其作用减弱或被代替;电导率的测定结果表明,细胞膜结构在胁迫初期遭到极大程度的破坏,胁迫9 h后膜损伤程度开始减轻。结合PLD基因和电导率的表达模式,推测PLD基因在6 h内会激活一系列感受信号及下游信号分子,9 h后其相应防御机制发挥作用来减轻胁迫造成的损害。