海南番木瓜PRSV和PLDMV病毒发生情况及分子鉴定

对海南昌江、乐东、澄迈、文昌和三亚5个主要番木瓜产区的病毒病发生情况进行调查。对76份番木瓜疑似病毒样品进行检测,检测结果表明海南番木瓜病毒病主要有2种:由番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)引起的番木瓜环斑病毒病和由番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)引起的番木瓜畸形花叶病毒病。其中,番木瓜环斑病毒病最为常见,检出率达77.63%,是影响海南地区番木瓜产业健康发展的主要病毒病;畸形花叶病毒病发生率很低,仅检出2例番木瓜畸形花叶病毒病样品。以PRSV病毒基因组P1和Hc-Pro作为靶标基因进行分子克隆、测序,结果表明海南地区PRSV病毒可明显分为2个株系:HNPRSV-1株系和HN-PRSV-2株系。此外,基于CP基因的系统进化树分析结果表明在海南新发现的PLDMV病毒可能源于台湾和日本。本研究可为开展番木瓜花叶病的防控和创制抗花叶病毒番木瓜新种质提供数据参考。

混合感染番木瓜PRSV/PLDMV株系基因组全长cDNA的克隆和实时荧光定量PCR分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)与番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)存在混合感染的现象,近年来混合感染发病率逐年递增,是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。运用RT-PCR和RACE方法从混合感染样品中克隆获得2种病毒基因组全长c DNA,分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM,Gen Bank登录号分别为KT633943和KT633944,基因组序列大小分别为10 325、10 153 nt(不包括3′端的poly A)。序列分析表明:PRSV-LM与单独感染样品中的PRSV海南分离物HN(Gen Bank登录号:EF183499)的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高,为94%;PLDMV-LM与单独感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF(Gen Bank登录号:JX974555)核苷酸和氨基酸序列相似性最高,分别高达99%和97%。进化树分析显示,PRSV-LM和PLDMV-LM分别与单独感染样品的PRSV和PLDMV海南分离物有共同的进化起源。进一步利用实时荧光定量PCR对混合感染样品的PRSV与PLDMV病毒积累量进行分析,结果表明,混合感染样品中PLDMV病毒积累量大约是PRSV含量的100倍。研究结果为进一步探究PRSV/PLDMV混合感染发病机制奠定基础。

一种E.coli-Free的酵母同源重组系统稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法

侵染性克隆是研究病毒的重要工具,而偏大的病毒基因组及其在大肠杆菌中的不稳定给构建侵染性克隆造成很大困难。通常采用插入内含子和酵母同源重组等方式可以获得稳定克隆,但本实验最初利用酵母同源重组系统并未成功构建番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)的侵染性克隆。经研究证实,该不稳定现象确实存在于大肠杆菌中,而非酵母和农杆菌细胞。通过改良酵母同源重组方法,成功构建了有/无内含子intron 2的PLDMV侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2,农杆菌注射接种番木瓜均发病,侵染效率达64.7%~69.7%。本研究通过酵母同源重组质粒直接转化农杆菌,建立了一种10 d内即可稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的E.coli-Free酵母同源重组新方法。该方法对其他在大肠杆菌中不稳定的植物病毒侵染性克隆的构建具有重要意义。

海南地区番木瓜畸形花叶病毒的发现与鉴定

利用马铃薯Y病毒属的简并引物对3个海南感病番木瓜植株的叶片进行RT-PCR检测,并将其克隆到T载体上进行测序和BLAST分析.结果表明：均获得了大小约1 700 bp的特异性条带,与预期大小基本一致;所得序列与GenBank中收录的番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortionmosaicvirus,PLDMV）基因序列相似性达到88％～96％,序列包含部分NIb蛋白基因、外壳蛋白（CP）基因和3’端非编码区.这是首次报道在中国海南地区发现番木瓜感染了PLDMV.但是仅基于PLDMV外壳蛋白基因的系统进化分析结果还不足以证明在海南发现的PLDMV与其他地区的某一PLDMV株系为同一进化簇.

海南地区番木瓜花叶病病原的分子鉴定与多样性分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)和番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)是热带、亚热带地区严重威胁番木瓜农业生产的主要病害。本研究对27份疑似番木瓜花叶病病叶样品进行分子鉴定,提取病叶总RNA,反转录获得对应的cDNA,根据PRSV病毒的CP、P1、Hc-Pro和NIb基因序列和PLDMV病毒的CP基因序列设计特异性引物进行PCR检测和测序分析。研究发现PRSV感染20例(74.1%),PLDMV感染3例(11.1%),PRSV和PLDMV交叉感染的样品1例(3.7%)。多样性分析结果表明,海南地区PRSV病毒存在3个株系,株系之间出现明显分化;海南地区PLDMV病毒与日本和台湾地区报道的PLDMV病毒株系有共同的起源。研究结果表明PRSV和PLDMV是海南地区番木瓜花叶病的主要病原,其中PRSV病毒3个株系之间P1基因同源性在95%以下,这可为后续研究构建抗PRSV和PLDMV的双价表达载体提供数据支持。

原核表达dsRNA抗番木瓜畸形花叶病毒的研究

番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）是一种已对番木瓜种植业构成潜在威胁的新型病害,在转基因植物备受争议的背景下,利用原核表达的dsRNA来防控病毒的策略不失为一种新的选择.本文选取PLDMV CP基因全长（879 bp）,运用OZ-LIC法构建了含有pdk内含子的ihpRNA结构,将其嵌入原核表达载体pSP73中,并转化RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌M-Jm109LacY,构建了1种能高表达dsRNA的原核表达菌株M-Jm109LacY-CP879,以终浓度为0.4 mmol/LIPTG诱导后能够稳定高效的表达CP879-dsRNA.研究共设2个处理：保护性处理与治疗性处理.分别用含有CP879-dsRNA的粗提液对这2个处理的番木瓜植株进行喷施处理,通过统计发病率、观察病症变化以及ELISA分析结果表明,保护性处理能有效抑制番木瓜畸形花叶病毒的侵染,主要表现为发病时间推迟和相对较低的发病率;治疗性处理植株的病毒积累量会在喷施后第3～12天内出现暂时性的降低.结果表明,保护效果优于治疗效果,若每月喷施2～3次dsRNA粗提液,有望能够有效地预防PLDMV的侵染.

番木瓜感染畸形花叶病毒后的生理变化及扫描电镜观察

【目的】阐明番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)的侵染机理及侵染后番木瓜自身防御体系对抗病毒的作用机制,为番木瓜病毒病防治提供参考。【方法】以台农二号番木瓜为材料,通过RTPCR检测接种PLDMV处理组(T)与健康空白对照组(CK)的病毒感染情况,采用分光光度法测定PLDMV侵染对番木瓜相关生理指标的影响,运用扫描电镜法观察两组番木瓜叶片的微观结构差异。【结果】通过RT-PCR检测,证明T番木瓜植株已感染PLDMV。T与CK番木瓜叶片在表征、微观解剖结构及生理指标等方面均存在明显差异,与CK番木瓜叶片相比,T番木瓜叶片纵切面栅海比及背部绒毛密度明显小于CK番木瓜,气孔密度大于CK番木瓜;T番木瓜的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性和脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、超氧阴离子(O)含量均显著高于CK番木瓜(P<0.05,下同),过氧化氢酶(CAT)活性和叶绿素(Chl)含量显著低于CK番木瓜,而超氧化物歧化酶(SOD)和几丁质酶活性两组间无显著差异(P>0.05)。【结论】番木瓜受PLDMV侵染后,其叶片结构被破坏,细胞毒害损伤严重,体内代谢紊乱,多种代谢调节平衡被打破,番木瓜的正常生长发育受阻。

应用现代生物技术防治番木瓜RNA病毒研究进展

植物病毒几乎都是RNA病毒,所占比例达93.9%,以番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)和番木瓜畸叶嵌纹病毒(papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)为代表的RNA病毒是番木瓜生产上的最大限制因子,不抗病的品种几乎绝产。在物理和化学防治措施效果不佳与抗性品种缺乏的情况下,现代生物技术方法被引入番木瓜的防治工作,并取得可喜的成绩。迄今为止,被实际应用的番木瓜抗病毒基因都是来自其病毒本身的基因,这类转基因番木瓜的抗病行为主要是由RNA所诱导的后转录基因沉默(RNAmediated post-transcriptional gene silencing,PTGS)所致,亦即RNA干扰。本研究综述了现代生物技术在防治番木瓜RNA病毒上的主要成果和问题,并展望了利用最新CRISPR技术防治番木瓜RNA病毒的策略。