基于PLO基因的山羊化脓隐秘杆菌PCR检测方法的建立与应用

为建立特异的化脓隐秘杆菌PCR检测方法,基于化脓隐秘杆菌PLO基因设计4对引物,对12种细菌进行常规PCR扩增,以评价方法的特异性,并运用建立的PCR方法检测临床样本。结果显示只有使用F1/R1引物对的PCR方法能鉴别化脓隐秘杆菌,并能用于临床样本检测。

番鸭呼肠孤病毒p10.8蛋白致细胞凋亡功能

为确定番鸭呼肠孤病毒(DRV)p10.8蛋白的生物学功能,本研究采用RT-PCR方法扩增DRVS14株p10.8编码基因,将其克隆到真核表达载体中,构建了重组表达质粒pcDNA-p10.8;通过转染鸭胚成纤维细胞(DEF),首次对p10.8蛋白的凋亡功能进行了研究。细胞转染48h后,Hoechest、DNALadder和TUNEL法的细胞凋亡检测结果显示:光镜下可见细胞形态学上出现的细胞皱缩,Hoechest染色后可见细胞核固缩,染色质凝固成团块状;DNALadder法可检测到凋亡细胞DNA样品呈梯形条带;TUNEL法可观察到褐色调亡细胞的存在。以上结果均表明,p10.8在DEF中的表达具有诱导宿主细胞凋亡的作用,是番DRV的凋亡蛋白。

山羊化脓隐秘杆菌LM01株分离鉴定及其毒力基因PLO遗传进化分析

为确诊福州某羊场患病山羊皮下脓肿的病因,采集脓液进行细菌分离、形态染色检镜、培养特性观察、生化试验及16S rRNA测序分析,结果分离鉴定出1株革兰阳性、形态不规则、具有β溶血现象的化脓隐秘杆菌,命名为LM01株。用分离菌皮下接种小鼠,能复制出与山羊自然感染相似的皮下脓肿临床病例,半数感染量(ID_(50))为1.65×10^(7)CFU/m L。病理组织学观察可见皮肤损伤处形成一个大的囊腔,腔内充满大量脓细胞,囊腔与肌层之间有大量成纤维细胞增生及中性粒细胞浸润。毒力基因检测显示分离株至少存在PLO、NanH、NanP、FimA、FimC、FimG等6个毒力基因,其中溶血素PLO是化脓隐秘杆菌最主要的毒力因子,又是宿主保护性抗原。PCR分段扩增PLO基因,得到全长1605 bp,编码534个氨基酸,与GenBank中收录的其他参考株相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.0%~99.8%和97.0%~99.8%。进化树分析显示,化脓隐秘杆菌分成Group 1(牛型)、Group 2(猪型)和Group 3(羊型)3个独立分支,本分离株归属在Group 3(羊型)分支,与重庆2012CQ-ZSH株亲缘关系最近。变异性分析发现,PLO基因仅发生点突变,没有插入或缺失现象;羊型与猪型、牛型相比,存在25处核苷酸特异性位点及5个特异性氨基酸位点:62(N/D)、340(T/A)、355(V/A)、384(F/Y)和470(A/L)。药敏试验表明,分离菌对恩诺沙星、强力霉素、阿米卡星等22种药物敏感,对阿奇霉素、复方新诺明、红霉素等6种药物耐药。结果表明,本次山羊患病的病原菌是化脓隐秘杆菌,本试验为病原学研究提供了参考。

1株梅花鹿源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

为确定重庆地区1株患病梅花鹿的致病菌,并探究其主要生物学特性,本试验采集病死梅花鹿肺脏,通过细菌分离、生化鉴定和16SrDNA测序对分离菌进行鉴定,随后对其致病性、毒力基因、药物敏感性以及生长曲线等主要特性进行分析。致病菌经鉴定为化脓隐秘杆菌,对小鼠具有较强的致病性,皮下和腹腔均能感染并产生典型症状,病死小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏产生坏死、出血和炎性细胞浸润为主要特征的组织病理学变化,对小鼠的半数致死量(LD50)为6.80×10^(10) CFU/mL,将其命名为YC-1;毒力基因检测显示,YC-1菌株具有2个神经氨酸酶(NanH、NanP)、2个菌毛蛋白(FimA、FimE)和1个溶血素(PLO)共5个毒力基因,其中PLO全长1605bp(GenBank编号OK513198),氨基酸进化树与霍加狓源化脓隐秘杆菌最为接近;药敏试验显示,YC-1对多种抗生素均敏感,耐药特征不明显;细菌的生长曲线显示在37℃,含有5%胎牛血清的TSB培养基中,培养6~10h为该菌的对数生长期。本试验解析我国梅花鹿源化脓隐秘杆菌主要生物学特性有助于深入研究该菌的致病机制以及开发有效的预防制剂。