不同毛色羊驼皮肤中Agouti和PMEL基因表达与毛纤维中黑色素含量的相关性研究

为研究羊驼(Vicugna pacos)皮肤中控制黑色素生成的鼠灰色基因(Agouti Signaling gene,Agouti)和前黑素小体蛋白基因(premelanosome protein gene,PMEL)的表达量与毛纤维中黑色素含量的相关性,试验从不同毛色羊驼皮肤差异表达基因中筛选主要毛色相关基因。用紫外分光光度法测定白色、棕色和黑色羊驼毛纤维中的黑色素含量,并用实时定量PCR(qRT-PCR)法和Fisher法对Agouti与PMEL的相对表达量与毛纤维中黑色素的含量的相关性进行分析。结果显示,23个毛色基因在白色和黑色羊驼皮肤中呈差异表达,白色和褐色皮肤中Agouti的mRNA表达显著高于黑色皮肤中Agouti的表达;PMEL在羊驼黑色皮肤中的表达高于棕色皮肤和白色皮肤中的表达(P<0.05)。Agouti与PMEL的表达量均与毛纤维中黑色素含量相关。本研究为揭示羊驼毛色的分子机制提供理论基础,为分子育种提供了重要的理论依据。

山羊PMEL基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。

利用混合样本池法对鸡显性白羽基因PMEL17突变位点的检测

显性白羽基因座是影响鸡羽色形成的重要基因座位之一,该基因座上的显性等位基因I会抑制黑色素合成,从而使携带该基因的个体全身羽毛呈现白色。目前已确认鸡显性白羽基因座编码PMEL17蛋白:是一种黑素细胞特异性蛋白,在黑素细胞的分化与成熟中起到重要作用,并证明PMEL17基因的突变与显性白羽的形成有关。文章利用混合样本池建立了一种低成本、高效率,并能在大规模群体中检测PMEL17基因突变的方法,称为PCR产物混合样本池法。该方法的基本步骤如下:首先,提取个体基因组DNA,并设计相关引物对每一个体单独进行PCR扩增;其次,将PCR产物等比例混合,10个样品混在一个池中;然后,将PCR产物混合池样品于非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳;最后,待电泳结束后进行银染,根据凝胶上所显条带判定是否存在突变体。此外,文章还将这种方法与传统基因组DNA混合样本池法进行了比较试验,并利用该方法对试验鸡群显性白羽基因PMEL17突变进行检测,证实该方法具有较高准确度。

山羊PMEL基因生物信息学分析

基于生物基因组学数据库,对山羊PMEL基因进行生物信息学分析,为研究该基因的功能提供依据。根据Gen Bank中山羊PMEL基因编码蛋白序列(Gen Bank登录号:XP_005680442.1),利用Ex PASy数据库中的Prot Param、Prot Scale程序分别预测理化性质、疏水性;利用CBS Prediction Servers数据库中的Signal P、TMHMM、Protfun程序分别预测信号肽、跨膜区及其功能;利用Predict Protein、PSORTⅡPrediction、Motif Scan软件分别预测二级结构、亚细胞定位、功能位点,并对不同物种PMEL基因构建系统发育树。结果表明:山羊PMEL基因共编码685个氨基酸,属可溶性不稳定蛋白,无信号肽,在接近肽链的C-端存在1个跨膜区;二级结构以无规卷曲为主,该蛋白主要在内质网中发挥运输、结合、信号转导作用;不同物种PMEL基因的系统进化情况与生物进化过程中的动物学分类相符。山羊PMEL基因编码蛋白在生物进化中具有较强保守性,该基因结构和功能的分析为山羊PMEL基因遗传特性的进一步研究奠定了基础。

拉萨白鸡PMEL17基因第10外显子序列突变的研究

为研究拉萨白鸡显性白羽PMEL17基因第10外显子序列突变,选用5世代22周龄的拉萨白鸡228羽作为试验材料,采用PCR-RFLP技术分析拉萨白鸡的基因组DNA的PMEL17基因序列的第10外显子上是否存在9 bp的插入。结果表明:PMEL17基因序列的第10外显子存在9 bp插入突变时,扩增目的片段长度为184和42 bp,为II基因型纯合子的个体,且为显性白羽纯合个体;PMEL17基因序列的第10外显子存在9 bp插入突变,且扩增目的片段长度为217,184和42 bp,为Ii基因型的杂合的个体,且为显性白羽杂合个体;PMEL17基因序列的第10外显子不存在9 bp插入突变,且扩增目的片段长度为217 bp,为ii基因型,且为非显性白羽个体。通过本试验,为拉萨白鸡今后育种工作的开展提供另一个思路,通过分子选择PMEL17基因序列的第10外显子的9 bp插入突变作为拉萨白鸡羽毛颜色性状的功能基因的分子选育提供了理论基础。

狐狸PMEL基因密码子使用特性分析

前黑素小体蛋白(PMEL)对狐狸毛色中黑色素的合成和沉积过程有重要的调控作用。利用Codon W软件和系统聚类分析法等分析狐狸及14种哺乳动物PMEL基因的密码子偏性,为研究PMEL基因蛋白质表达机制提供理论依据。结果表明,狐狸PMEL基因偏好使用的密码子有34个,以G/C结尾密码子的同义密码子相对使用度明显偏高。该基因编码亮氨酸、缬氨酸的2个最优密码子分别为CTG、GTG。狐狸PMEL基因在密码子偏好的使用上与家猫、猎豹相似,但与同源性极高的家犬不同。基于同义密码子相对使用度的系统聚类分析结果表明,家猫和狐狸均为一类,在密码子使用上最为相似。为研究PMEL基因的表达机制及目的蛋白表达水平的提高提供了理论依据。

Pmel17在黑素小体成熟过程中的关键作用

黑色素的形成和沉积主要发生在黑素小体的淀粉样纤维上,前黑素小体蛋白17是黑素小体形成淀粉样纤维的关键蛋白,该蛋白在黑色素的形成和沉积中发挥重要作用。论文对Pmel17在黑素小体成熟过程中的调节作用进行综述,概述了Pmel17的解朊机制,SLC24A5、SLC45A2基因编码的离子交换蛋白对Pmel17解朊的影响,Oa1(ocular albinism type 1)基因对Pmel17表达量的影响,以及部分基因调控Pmel17对黑素小体结构形成的影响。对Pmel17在黑素小体成熟过程中的作用深入研究,有助于探明哺乳动物黑色素的合成和沉积机制,并从Pmel17的角度解析哺乳动物黑色素的色素减退机制和白化现象。

鸭PMEL17基因多态性与羽色性状相关性研究

为了探讨PMEL17基因对鸭羽色遗传性状的影响,试验以樱桃谷鸭(父本)和凤头白羽鸭(母本)的杂交F1代个体为样本,对PMEL17基因外显子进行PCR扩增并直接测序,利用生物信息学软件进行多态性分析,并与羽色进行关联。结果表明:在PMEL17基因编码区发现5个多态位点1904(C/G)、1961(T/C)、2102(C/T)、2110(G/A)和2143(A/G)的碱基突变引起了氨基酸的变化。群体遗传学分析显示,1904(C/G)、2102(C/T)、2110(G/A)和2143(A/G)位点表现为中度多态(0.25<PIC<0.5),1961(T/C)位点表现为低度多态(PIC<0.25)。χ~2检验表明鸭F1代群体在1904(C/G)、1961(T/C)、2102(C/T)、2110(G/A)和2143(A/G)位点均达到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。关联分析表明,PMEL17基因1904(C/G)、1961(T/C)和2143(A/G)位点基因型分布与鸭羽色具有显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01),由此推测PMEL17基因与鸭羽色性状具有一定的关联性。研究结果为后期的育种工作提供了一定的理论基础。

莆田黑鸭PMEL17基因的克隆、组织表达与多态性分析

为研究莆田黑鸭前黑素小体蛋白(PMEL17)基因序列特征,分析其在不同羽色鸭毛囊及莆田黑鸭不同组织中的表达情况,以莆田黑鸭毛囊组织为材料,利用cDNA克隆技术获得PEML17基因编码区全长序列并进行生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术检测PMEL17基因在毛囊、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肌胃、肾脏、大脑、胸肌、腿肌和皮肤组织中的表达情况。结果表明,莆田黑鸭PMEL17基因编码区全长1917 bp,其同源性与鸡最近,与其它物种变异性较大;PMEL17基因编码638个氨基酸,二级结构以无规则卷曲和延伸链为主,预测为稳定的疏水性蛋白,存在1个跨膜区;PMEL17基因在黑羽毛囊中表达,在白羽毛囊中不表达,莆田黑鸭各组织中仅在毛囊和皮肤表达,其它组织几乎不表达;在第6外显子处发现2个SNP位点,导致天冬氨酸突变成丙氨酸。试验结果为进一步研究PMEL17基因在鸭羽色形成中的作用奠定基础,也为莆田黑鸭种质特性研究提供数据。

鸡显性白羽基因PMEL17多态性及基因型鉴定方法

为建立显性白羽基因型检测的快捷方法,试验采用Sanger测序法扫描了白来航、寿光鸡和农大C系前黑素小体蛋白17(PMEL17)基因的全长并进行序列比对,共得到18个与显性白羽表型完全关联的标记。试验选择白来航PMEL17基因第5内含子上的22 bp插入以及第7外显子上的60 bp插入作为显性白羽基因型辅助鉴定的分子标记,并设计了特异性引物对。通过扩大群体和样本数量检测,证明该鉴定方法具有操作简便、结果清晰的优势,检测效力明显提高。研究提供了鸡显性白羽基因型检测的优化位点,为白羽鸡的分子育种提供了新的标记辅助鉴定技术。

IKZF4和PMEL基因CNV与白癜风的关联性研究

目的探讨IKZF4和PMEL基因CNV与白癜风发病的关联性。方法收集1 101例患者和1 101例健康对照,设计探针,采用TaqMan Real-time PCR系统进行基因拷贝数多态性分析,SDS 2.4软件输出IKZF4与PMEL基因拷贝数,并运用SPSS 19.0进行数据整理和结果的统计分析。结果①携带有IKZF4基因拷贝数为2和>2的个体增加白癜风的发病风险(P=0.03,OR=1.30,95%CI:1.07~1.57;P=0.04,OR=1.31,95%CI:1.00~1.71),携带有IKZF4基因拷贝数<2的个体降低白癜风的发病风险(P=3.90×10-6,OR=0.53,95%CI:0.41~0.67);②携带有PMEL基因拷贝数为2的个体增加白癜风的发病风险(P=1.03×10-7,OR=3.03,95%CI:2.05~4.57),携带有PMEL基因拷贝数<2的个体降低白癜风的发病风险(P=4.69×10-8,OR=0.23,95%CI:0.13~0.38)。③携带有IKZF4和PMEL基因拷贝数>2的患者明显增加白癜风合并自身免疫性疾病的风险(P=3.49×10-4,OR=2.38,95%CI:1.47~3.76;P=0.006,OR=4.06,95%CI:1.38~10.77),但IKZF4和PMEL基因拷贝数与白癜风其他的临床亚表型无明显相关性(P>0.05)。结论IKZF4和PMEL基因CNV与白癜风的易感性相关,且二者的CNV可能影响其疾病表型(白癜风伴发其他自身免疫性疾病),但与白癜风的某些亚型(如发病年龄、性别、皮损面积、临床类型、家族史、同形反应等)无明显相关性。

北极蓝狐和北极白狐PMEL基因不同组织差异的表达

为了确定PMEL基因在北极蓝狐和北极白狐不同组织中的表达特征,进而确定其与毛色形成的相关性,以北极蓝狐和北极白狐为试验对象,利用实时荧光定量PCR技术构建了前黑素小体蛋白基因(PMEL)在北极蓝狐和北极白狐的组织表达谱,并比较分析了该基因在以上2种不同毛色北极狐皮肤中mRNA的表达差异。结果表明,PMEL基因在北极蓝狐和北极白狐的不同组织(皮肤、心、肝、脾、肺、肾和肌肉)中均有表达,但在皮肤中的表达量均为最高,且北极蓝狐mRNA表达显著高于北极白狐(P<0.05),提示PMEL基因的表达与北极狐深色毛色的形成呈正相关。

坝上长尾鸡pmel基因核心启动子的鉴定

为探明坝上长尾鸡的前黑素小体蛋白(Pre-melanosomal protein,Pmel)基因核心启动子区,首先构建了双荧光素酶表达载体,通过脂质体瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1,并利用双荧光素酶检测试剂盒进行启动活性检测。成功克隆了坝上长尾鸡pmel基因5?侧翼区片段1268bp,预测启动子区(-1200–+68)含有2个CpG岛和多种转录因子结合位点,构建了9个含有不同长度pmel基因启动子片段的表达载体及1个核心启动子区突变载体,说明鸡pmel基因启动子的核心区域为-840–+68bp,其中-840–-590bp和-525–-266bp区域为正调控区,-590–-525bp区域为负调控区,多态位点(-456、-435、-410、-374和-341)对pmel基因启动子活性有较大影响。

雪域白鸡群体中PMEL17基因多态性分析

为了研究前黑色素小体蛋白17(pre-melanosomal protein 17,PMEL17)基因第10外显子上有关显性白羽突变的基因频率和基因型频率在雪域白鸡群体中的分布情况,试验采用PCR-RFLP方法分析基因型,利用POPGENE 1.32软件计算基因型和基因频率,用SPSS 20.0软件进行哈代-温伯格平衡适合性检验。结果表明:雪域白鸡群体中PMEL17基因有Ⅱ、Ii和ii 3种基因型,基因型频率分别为91.58%、7.37%、1.05%,Ⅰ和i等位基因频率分别为95.27%和4.73%。雪域白鸡群体内PMEL17基因BsrB酶切基因型分布不符合哈代-温伯格平衡状态(P<0.05),这可能与经历人工选择有关。说明雪域白鸡群体中Ⅱ基因型个体已占主导,但仍存在其他羽色个体,可通过分子标记辅助选择育种技术剔除ii及Ii基因型个体来提高群体羽色均一性,还可组建有色羽纯合群体以增加收益。

黑素小体特异性蛋白Pmel17的研究进展

Pmel17是黑素小体特异性蛋白,在早期黑素小体中形成纤维性基质,以利于黑素沉积.在Pmel17合成代谢过程中,适配器蛋白与Rab7参与调控其从高尔基体到黑素小体的投递,去整合素金属蛋白酶与pH值参与调控其在黑素小体内形成纤维基质.Pmel17与黑素小体的结构形成,分级组装,转运功能等密切相关,其表达受小眼相关转录因子、眼白化病1型因子、α黑素细胞刺激素等因素的调节.Pmel17参与了白癜风发病,为白癜风的免疫机制研究提供新的方向,Pmel17还可作为黑素瘤的治疗靶点.

鸡青黄脚和白色羽性状分子选育研究

【目的】鸡的胫色和羽色作为品种的特征性状是新品种选育的重要性状。通过分子生物学手段对鸡育种生产中的青黄脚和白色羽性状进行分析,探究其形成机制并建立相关的分子标记辅助选择方案。【方法】采用候选基因的方法,将BCO2基因作为鸡青黄脚形成的候选基因,以青黄脚、青脚和黄脚个体为材料,通过测序对BCO2基因上的目的位点进行分型,分析该位点与不同性状间的关系。分别将编码扩展基因座e、显性白基因座I和隐性白基因座C的MC1R、PMEL17和TYR基因作为白色羽相关候选基因,以隐性白羽洛克鸡、快大型白羽肉鸡、合成隐性白品系和杂交后代白羽个体为试验材料,通过测序和PCR检测对相关候选突变进行分型,分析相关基因多态性与性状的关系。【结果】(1)青黄脚性状是由真皮层黑色素和胫部黄色鳞片相互作用的结果,BCO2基因突变是青黄脚性状形成的关键,342 bp处的突变位点可用于相关性状的分子标记辅助选择,淘汰CT基因型个体即可达到纯化目的;(2)合成隐性白品系的隐性白基因座为cc,后代白色羽不是因隐性白突变所致;(3)杂交白羽后代均携带PMEL17基因编码的显性白等位基因I,全部为杂合子基因型Ii;(4)杂交白羽后代均携带MC1R基因编码的E和E^(R)等位基因;(5)显性白突变等位基因I、E和ER均来自快大型白羽肉鸡。【结论】青黄脚性状是由控制表皮颜色的BCO2基因上的突变导致,342 bp位点可用于针对该性状的分子标记辅助选择;白色羽形成与隐性白突变无关,主要是由编码显性白等位基因I的PMEL17突变导致。

犬细小病毒HL-01株的分离鉴定及VP2基因真核表达质粒的构建

从临床发病犬采集粪便样品,以F81传代细胞进行病毒分离,经血球凝集实验(HA)和血球凝集抑制实验(HI)初步鉴定为犬细小病毒。为进一步确诊,根据Genbank中已发表的犬细小病毒VP2基因序列设计并合成一对引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出CPV VP2基因,酶切,测序加以鉴定。其序列与国际已发表的CPV-d(type 2)、CPV-1(5 type 2a)、CPV-3(9 type 2b)VP2序列同源性分别为98.97%,98.75%,98.69%,氨基酸序列的同源性分别为98.12%,97.60%,97.60%,从而证明此分离株为犬细小病毒。在获得VP2基因的基础上,为实现VP2蛋白的表达,构建了真核表达质粒pMel BacC-VP2。

γ1neo-hgp100基因的体外转染表达及体内免疫保护效应

目的:构建含有黑色素肿瘤相关抗原hgp100的CTL表位编码基因质粒γ1neo-hgp100,观察此质粒的体外表达和表达产物的提呈,以及体内基因免疫对黑色素肿瘤攻击的保护效应。方法:将编码hgp100的CTL表位的DNA序列插入抗体化抗原的表达质粒γ1neo中,构建γ1neo-hgp100,体外转染J558L,ELISA检测免疫球蛋白的表达;转染后的J558L与pmelTCR转基因T细胞共育,48h后ELISA检测培养上清中IFN-γ的含量。以γ1neo-hgp100脾内基因免疫C57BL/6小鼠,以B16F10黑色素瘤细胞攻击免疫后小鼠,定期观察肿瘤的生长情况及大小。结果:所构建的γ1neo-hgp100可以在体外表达,表达产物可以被充分的提呈,被提呈的hgp100CTL表位能有效的活化pmelTCRT细胞分泌IFN-γ。经γ1neo-hgp100免疫的小鼠能显著抵抗B16F10黑色素瘤细胞的攻击,生存时间得以明显延长。结论:γ1neo—hgp100基因可有效的在体外表达并被提呈至T细胞,产生体内免疫保护效应。