PML/RARɑ阳性APL缓解后继发PML/RARɑ阴性AML 1例报道

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)作为急性粒细胞白血病中的特殊类型,发病凶险,常常并发弥散性血管内凝血,大部分患者通过早期诊断,予以亚砷酸和全反式维A酸(all-trans retinoic acid,ATRA)治疗可完全缓解,核型恢复正常,但仍有5%~30%的患者在完全缓解后复发[1]。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα异型的临床意义

为评价急性早幼粒细胞白血病(APL)PML/RARα异型与临床治疗及预后的相关性,对71例诱导治疗的APL患者定期进行血像、骨髓像检查,用巢式RT-PCR检测PML/RARα不同转录本。结果表明:短型(S)和V型白细胞总数比长型(L型)显著升高,所以较易早期发生严重的出血合并症。S型和V型PML/RARα患者的复发率高于L型患者。结论:APL患者PML/RARα异型可作为独立的预后因素。

实时定量PCR检测46例初诊急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα mRNA的分子表达

本研究探讨实时定量PCR(Q-PCR)检测PML/RARαmRNA的方法学,并对46例初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)患者骨髓标本进行检测。构建PML/RARα的bcr1型和bcr3型转录本以及内参照abl基因转录本的阳性标准品质粒;利用ABI Prism7500型Q-PCR仪对46例初诊APL患者和40例非APL患者骨髓标本进行检测,PML/RARαmRNA定量结果以校正比值(NQ)表示,NQ=PML/RARαmRNA拷贝数/ABLmRNA拷贝数;应用四色流式细胞术检测免疫表型。结果显示,Q-PCR结果的日间差和日内差平均变异系数(CV)分别为1.58%和0·88%。可重复敏感度为可以检测5copies/100ng RNA。40例非APL患者PML/RARαmRNA均为阴性。46例初诊APL患者PML/RARαmRNA表达量NQ中位值为0.450(0.084-1.082)。比较32例bcr1型和14例bcr3型两组患者的特征表明,PML/RARαmRNA NQ中位值分别为0.454(0.084-1.082)和0.386(0.151-0.848)(P>0·05)。形态学诊断M3v的患者比例分别为9.40%和48.96%(P<0.05);初诊时WBC中位数分别为2.15(0.2-59.6)和9·35(0.91-122.8)(P<0.05),而在性别、年龄、初诊时血红蛋白和血小板计数、骨髓中APL细胞比例、DIC指标等方面无差异。流式细胞仪术检测时,CD45/SSC射门情况下,APL细胞群分布可以分为两类:高侧向角(L-SSC,粗颗粒)和非高侧向角(NL-SSC,细颗粒)两类。bcr1型患者中85.70%表现为L-SSC,而bcr3型患者中64·29%表现为NL-SSC。结论:建立的Q-PCR方法稳定可靠,敏感度高;bcr1型和bcr3型APL患者的PML/RARαmRNA表达量无差异,bcr3型APL患者中形态学M3v比例和WBC数比bcr1型患者高;PML/RARα不同转录本类型和免疫表型以及细胞形态学之间有一定的相关性。

实时定量PCR监测急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα融合基因的临床意义

目的探讨实时定量PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML/RARα融合基因表达水平的意义。方法用扩增培养的NB4细胞的PML/RARα融合基因进行梯度稀释作为标准品,ABL作为内参,建立标准曲线。采用Taq Man法进行实时定量PCR,并对方法的可靠性、可重复性及灵敏性进行测定。对14例APL患者在初治、诱导缓解及巩固治疗3个时期的PML/RARαmRNA转录本水平进行动态定量监测,结果以NQ表示,NQ=PML/RARαmRNA的拷贝数/ABL mRNA的拷贝数×105。结果实时定量PCR方法可以检测出1×10-5μg NB4细胞cDNA中PML/RARα的融合基因,其重复性和稳定性Ct值变异系数分别为1.77%和2.11%。14例患者初治时骨髓PML/RARα融合基因平均水平为3 731,经全反式维甲酸、三氧化二砷双诱导缓解时PML/RARα融合基因平均水平为231,化疗与维甲酸序贯巩固治疗2个疗程后PML/RARα融合基因平均水平为116。治疗前后比较,PML/RARα基因转录本水平明显下降(P<0.05)。结论实时定量PCR检测PML/RARα融合基因表达敏感性好、特异性高、重复性好,可用于急性早幼粒细胞的诊断和微小残留病的检测。

动态监测PML-RARα融合基因对急性早幼粒细胞白血病的临床意义

目的动态监测急性早幼粒细胞白血病(APL)特有的PML-RARα基因,并探讨其临床意义。方法15例APL患者用全反式维甲酸(ATRA)和其他化疗药物进行诱导缓解、巩固和维持治疗,并进行随访,在病程的不同阶段采集骨髓标本进行形态学检查,并采用实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测PML-RARα基因表达。结果15例APL患者入院时PML-RARα均为阳性,治疗中死亡1例、完全缓解14例(93%)。14例完全缓解患者中2例复发,13例在病程中PML-RARα转为阴性。2例复发患者中,1例PML-RARα持续阳性,1例在病程中由阴性转为阳性。13例仍生存者中,至少已连续3次PML-RARα为阴性。结论对APL患者跟踪检测PML-RARα融合基因可早期发现复发病例;RQ-PCR检测PML-RARα对APL诊断、疗效判定及微小残留病变监测是一种有力手段。

超抗原SEA增强PML-RARα多肽体外诱导特异性CTL杀伤活性的机制

目的探讨超抗原SEA体外增强PML-RARα多肽诱导特异性CTL杀伤活性的机制。方法分别将SEA、PML-RARα多肽以及SEA联合PML-RARα多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养,利用CCK-8比色法检测诱导后T细胞对NB4和K562细胞株杀伤活性,同时利用流式细胞术测定诱导T细胞表面CD4与CD8表达情况。结果诱导后第20天,SEA能明显增强PML-RARα多肽特异性杀伤NB4细胞株的作用。诱导后第5、10、20天动态检测表明,多肽及SEA联合多肽组CD4+/CD8+比值逐渐降低,其中SEA联合PML-RARα多肽诱导组降低最显著。结论超抗原SEA能明显增强PML-RARα多肽体外诱导特异性CD8+T细胞的增殖与特异性的杀伤作用。

PML-RARα和hGM-CSF双基因表达载体的构建

目的:构建急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα基因与人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因真核双表达载体,为利用DNA疫苗治疗APL奠定基础。方法:利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达载体。利用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性。结果:NheI/M luI和XbaI/SalI双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,且序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。结论:成功构建了含有PML-RARα基因及hGM-CSF基因的真核双表达载体。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立

目的:针对90%以上的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者表达的PML/RARα融合基因,设计引物及探针。对APL患者进行基因筛查,并构建PML/RARα环形质粒作为标准品,建立APL患者PML/RARα融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,为APL患者的诊治提供分子生物学依据。方法:设计PML/RARα及ABL引物及Taqman探针,对APL患者进行基因筛查。并以PML/RARαL型及S型阳性的APL患者cDNA为模板,应用PCR技术扩增出453bp和550bp基因片段,构建pMD 18TPML/RARα(L)及pMD 18T-PML/RARα(S)标准品。实时荧光定量(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术对该基因转录本水平的变化情况进行监测。结果:成功构建pMD 18T-PML/RARα质粒标准品,应用RQ-PCR技术,以ABL为内参,应用Taqman探针法,对APL患者标本进行检测,技术可行,数据稳定。结论:成功构建APL融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,应用于临床病人的基因诊断,为APL的诊治提供了可靠的分子依据。

超抗原SEA联合PML-RARα对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响

目的探讨超抗原SEA联合PML-RARα多肽对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响。方法分别将SEA、PML-RARα多肽以及SEA联合PML-RARα多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养,20d后收集增殖细胞,利用RT-PCR及基因扫描技术分析诱导后增殖T细胞TCRVβ亚家族的利用和克隆性增殖的特点。结果单纯SEA诱导后,T细胞表达了11个TCR Vβ亚家族,且仍为多克隆增殖。单纯PML-RARα多肽诱导后,T细胞限制性表达8个Vβ亚家族,其中Vβ13、Vβ14表现出寡克隆或寡克隆趋势。PML-RARα多肽联合SEA共同诱导,其T细胞表达TCR Vβ亚家族依然呈明显的限制性,且Vβ13、Vβ14亚家族呈寡克隆、双克隆及寡克隆趋势。结论SEA能协同PML-RARα多肽诱导的T细胞克隆性活化与增殖。

应用荧光原位杂交技术动态观察急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合基因的变化

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)技术在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断及疗效判断中的作用。方法:对初发的急性白血病患者行常规形态学、细胞化学染色,并采用FISH技术检测PMLRARα融合基因,流式细胞术分析白血病细胞的免疫表型,对治疗过程中患者PMLRARα融合基因阳性细胞比例进行动态观察。结果:FISH对标准的PML-RARα融合基因的检出与形态学和临床符合率为100%,对流式细胞学免疫表型不符合的APL诊断的1例作出了明确诊断,对累及17号染色体的附加染色体异常也有一定的提示作用,对APL治疗过程中分子生物学缓解的判断非常直观。结论:FISH技术检测PMLRARα融合基因,实验方法简便、快速、直观和准确,具备了用以确定白血病类型,指导临床治疗和进行治疗后的疗效监测的作用。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因检测的临床意义

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)检测PML/RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断中的应用价值。方法应用常规细胞遗传学分析28例APL患者的染色体核型,同时用FISH法检测PML/RARα融合基因。结果 28例初诊的APL患者254例常规核型分析检出t(15;17)(q22;q12);2例患者核型正常;另1例未检出t(15;17),核型分析结果为涉及15和17号染色体的复杂异常;FISH检测所有病例均存在PML/RARα融合基因。结论 FISH法行PML/RARα融合基因检测特异性和敏感性好,是诊断APL的可靠方法。

含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品的制备及应用

目的建立一个含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品,用于PML/RARαL型)的定量检测。方法从NB4细胞中提取总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板,设计PML/RARα(L型)与ABL基因特异性引物进行PCR,PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收、PCMV4载体克隆后转化DH5α工程菌,提取质粒进行酶切、测序鉴定,提取质粒用于制作荧光定量PCR标准曲线,同时对质粒的稳定性能进行评价。结果结果NB4细胞提取的总RNA完整性良好,构建的质粒经酶切鉴定后与目的条带一致,测序结果与目的片段几乎完全一致,且质粒的原始浓度为9×1012copies/ml,倍比稀释至9×104copies/ml,均能得到良好的标准曲线(R2≈1),且质粒的稳定性好,提示含PML/RARa(L型)与ABL双基因荧光定量PCR质粒标准品构建成功。结论本研究建立了制备含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品方法,并成功制备出稳定的含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品。

巢式RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的意义

目的探讨巢式RT-PCR技术在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的价值。方法采用巢式RT-PCR检测218例初诊为APL患者的PML/RARα融合基因的表达水平及在部分患者的动态变化;随机选择39例APL完全缓解(CR)的患者,分别用流式细胞术(FCM)和巢式RT-PCR监测外周血或骨髓中的微小残留病(MRD)白血病细胞。结果在确诊的167例APL患者中PML/RARα融合基因阳性率为90.4%(151/167);39例APL-CR患者中PML/RARα融合基因阳性率76.9%(30/39);FCM和巢式RT-PCR监测APL-CR患者MRD有很好的一致性(P>0.05)。结论巢式RT-PCR对APL的诊断有高灵敏度和高特异性;对APL的疗效及预后判断有重要临床意义。

复方黄黛片及其与化疗序贯应用清除APL-PML/RARα融合基因的临床研究

目的:探讨复方黄黛片及其与化疗交替序贯应用对急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的影响。方法:采用复方黄黛片及其与化疗序贯治疗42例APL患者,并采用RT-PCR技术监测PML/RARα融合基因。结果:①CR后1个月内融合基因转阴率达92.3%(12/13),12个月内达100%(34/34);②长期监测表明86%(31/36)的患者处于持续阴性状态。③治疗过程中融合基因转为阳性的患者加强治疗可再度转为阴性,处于持续的血液学和分子学缓解状态。结论:复方黄黛片治疗APL有很高的分子学缓解率,联合化疗可使86%以上患者处于持续血液学和分子学缓解状态。

检测PML/RARα基因的双重荧光定量PCR方法的建立

目的建立在一个反应体系中同时检测融合基因PML/RARα和内参基因ABL的双重荧光定量PCR方法。方法从DNA聚合酶含量、Mg2+浓度和引物浓度等方面进行优化,建立检测PML/RARα和ABL基因双重荧光定量PCR体系,从分析灵敏度,批内、批间精密度以及检测临床样本阳性率等方面对双重荧光定量PCR反应体系进行性能评价,并同时和北京思尔成公司荧光定量PCR试剂盒进行比较,分析两者的一致性。结果成功构建双重荧光定量PCR反应体系,检测质粒灵敏度为103copies/ml,检测NB4细胞的灵敏度为10-3,反应体系批内、批间精密度Ct值的变异系数CV都小于5%,检测20例确诊为APL病人,其检测阳性率,和北京思尔成公司的PCR反应试剂一致。结论成功开发出稳定的双重荧光定量PCR试剂盒,其操作简单,成本低,误差小,能够有效地用于APL分子生物学分型诊断、用药指导、预后观察及MRD监测。

PML-RARα对环腺苷酸诱导急性髓系白血病细胞分化的影响

为了进一步探讨环腺苷酸cAMP协同低剂量氧化砷诱导急性早幼粒白血病细胞分化的分子机制,以稳定转染了PML-RARα融合基因的PR9细胞为实验对象,通过观察细胞的生长,并利用形态学实验、流式细胞技术和荧光素酶报告基因转染实验等检测cAMP和/或氧化砷处理前后细胞相关指标的变化,研究PML-RARα在cAMP诱导AML细胞分化过程中的作用。结果显示,虽然cAMP单独能使表达PML-RARα的PR9细胞表面分化抗原CD11b的阳性率有所升高;但细胞形态学分析表明,cAMP单用无法诱导表达PML-RARα融合蛋白的PR9细胞分化,只有联合氧化砷才能使细胞表现出完全分化的特征,并伴有CD11b表达的显著升高。此外,PML-RARα还可以明显抑制含有cAMP反应元件的报告基因的转录。结论:PML-RARα融合蛋白对cAMP诱导AML细胞分化的信号转导途径具有显著的抑制作用。

建立RQ-PCR方法检测急性早幼粒细胞白血病患者6种不同PML/RARα异构体

目的:建立检测急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者PML/RARα融合基因6种特异性异构体(bcr1/2、P4R3、P46R3、bcr3及P2R3)的实时定量PCR(RQ-PCR)技术,并评价其特异性。方法:设计不同异构体的特异性引物和探针,建立异构体特异性RQ-PCR方法对6种特异性异构体PML/RARα阳性模板进行扩增,评价异构体定量检测的特异性,并检测10例APL患者中不同异构体的含量。结果:所建立的各异构体特异性RQ-PCR法最大敏感性均达10拷贝/μL,但其重复性较差,108~102拷贝/μL阳性模板的重复性良好,正常对照及空白对照无扩增信号,每个异构体特异性RQ-PCR均不能扩增其他异构体。5例长型(bcr1)和1例变异型(bcr2)阳性APL患者中bcr1/2异构体表达量为7.71%~89.71%(中位数13.70%),P4R3异构体表达量为0.71%~16.26%(中位数4.48%),P46R3异构体表达量为3.57%~14.09%(中位数6.33%)。4例短型(bcr3)患者中bcr3异构体表达量为21.43%~197.04%(中位数100.69%),P2R3异构体表达量为0.34%~9.07%(中位数2.45%)。1例短型患者经诱导治疗缓解后bcr3和P2R3异构体转录本明显下降,复发时又明显升高。结论:检测PML/RARα异构体特异性RQ-PCR方法敏感、可靠,可用于APL患者不同异构体的定量检测和微小残留病灶的随访监测。

PML-RARα多肽和NB4细胞体外诱导CTL细胞杀伤活性分析

目的了解PML-RARα多肽和NB4细胞体外诱导体外诱导增殖的T细胞的特异性细胞毒作用.方法采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养(MLTC)方法,经丝裂霉素C处理的NB4细胞或PML-RARα多肽(LSSCITQGKAI-ETQSSSSEE)作为刺激原体外诱导脐血单个核细胞增殖.利用LDH方法检测诱导后T细胞的细胞毒性.结果PML-RARα多肽诱导组第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:49.65±6.7%(p<0.01)和73.13±8.42%(p<0.01),NB4细胞诱导组第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:53.33±8.82%(p<0.01)和74.46±9.57%(p<0.01),而无诱导组的第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:15.93±9.25%和38.19±10.54%,前两组T细胞对NB4细胞的杀伤作用均明显高于对照组.结论PML-RARα多肽和NB4细胞体外可诱导出特异性T细胞,他们对表达PML-RARα的NB4细胞具有选择性杀伤作用.

急性早幼粒细胞白血病患儿PML/RARα融合基因罕见型2例

目前认为急性早幼粒细胞白血病（APL ）属于急性髓细胞白血病（AML ）的特殊类型［1］，由于 APL 细胞存在 t （15；17）（q22；q21），该易位使第15号染色体长臂2区2带的早幼粒细胞白血病基因（PML）和第17号染色体长臂2区1带的维甲酸受体‐α（RARα）基因形成 PML ／RARα融合基因，该基因在产生过程中因断裂点不同及 mRNA 的剪切、拼接不同会产生不同的异构体并在 APL 发病中起到重要作用［2］。本院收治2例APL 患儿出现新的 PML ／RARα融合基因变异体，现报道如下。