筑巢式聚合酶链反应检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARαmRNA

目的 :观察急性早幼粒细胞白血病 (APL)患者PML RARαmRNA的表达情况。方法 :应用逆转录筑巢式聚合酶链反应(NestedPCR)检测了 3 0例APL患者的PML RARαmRNA。结果 :3 0例APL患者中 2 2例检测到PML RARαmRNA ,其中 16例为L型 ,6例为S型。结论 :NestedPCR是检测APL患者PML

实时定量PCR检测46例初诊急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα mRNA的分子表达

本研究探讨实时定量PCR(Q-PCR)检测PML/RARαmRNA的方法学,并对46例初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)患者骨髓标本进行检测。构建PML/RARα的bcr1型和bcr3型转录本以及内参照abl基因转录本的阳性标准品质粒;利用ABI Prism7500型Q-PCR仪对46例初诊APL患者和40例非APL患者骨髓标本进行检测,PML/RARαmRNA定量结果以校正比值(NQ)表示,NQ=PML/RARαmRNA拷贝数/ABLmRNA拷贝数;应用四色流式细胞术检测免疫表型。结果显示,Q-PCR结果的日间差和日内差平均变异系数(CV)分别为1.58%和0·88%。可重复敏感度为可以检测5copies/100ng RNA。40例非APL患者PML/RARαmRNA均为阴性。46例初诊APL患者PML/RARαmRNA表达量NQ中位值为0.450(0.084-1.082)。比较32例bcr1型和14例bcr3型两组患者的特征表明,PML/RARαmRNA NQ中位值分别为0.454(0.084-1.082)和0.386(0.151-0.848)(P>0·05)。形态学诊断M3v的患者比例分别为9.40%和48.96%(P<0.05);初诊时WBC中位数分别为2.15(0.2-59.6)和9·35(0.91-122.8)(P<0.05),而在性别、年龄、初诊时血红蛋白和血小板计数、骨髓中APL细胞比例、DIC指标等方面无差异。流式细胞仪术检测时,CD45/SSC射门情况下,APL细胞群分布可以分为两类:高侧向角(L-SSC,粗颗粒)和非高侧向角(NL-SSC,细颗粒)两类。bcr1型患者中85.70%表现为L-SSC,而bcr3型患者中64·29%表现为NL-SSC。结论:建立的Q-PCR方法稳定可靠,敏感度高;bcr1型和bcr3型APL患者的PML/RARαmRNA表达量无差异,bcr3型APL患者中形态学M3v比例和WBC数比bcr1型患者高;PML/RARα不同转录本类型和免疫表型以及细胞形态学之间有一定的相关性。

儿童急性早幼粒细胞白血病PML-RAR_α融合基因连续检测的临床意义

目的 :研究儿童急性早幼粒细胞白血病 (APL)的临床治疗和PML RARα 融合基因连续检测的意义。 方法 :以全反式维A酸 (ATRA)单用或联合化疗进行诱导缓解 ,常规联合化疗巩固 ,常规化疗、小剂量化疗和维A酸 (Tretinoin)交替维持治疗的方案 ,治疗 10例儿童APL。应用逆转录聚合酶链扩增 (RT PCR)方法在病程的不同阶段连续检测PML RARα变化 ,作为鉴测微小残留白血病细胞的指标。 结果 :10例APL中完全缓解 (CR) 9例 ,CR率 90 %。 9例CR患儿中 4例在CR后 14～ 4 2个月复发 ;1例仍在继续治疗中 ;生存期达 34个月 ;4例在连续CR 4～ 5年后已停药 ,停止治疗时间为 18～ 96个月 ,生存期达 72～ 15 6个月。 10例患儿中 ,8例在病程中PML RARα 转为阴性 ,首次转阴时间为 6～ 4 2个月 ,1例持续阳性。4例复发患儿中 ,2例复发前持续阳性 ,2例为病程中由阴性转为阳性。 5例仍生存者 ,至少已 2次连续检查为阴性。 1例在病程中由阴性转为阳性、2例分别在持续CR 36和 4 2个月仍阳性的患儿 ,在治疗干预后均转阴 ,且长期生存。结论 :在连续CR期定期检测PML RARα 可早期发现分子复发 ,及时干预治疗可避免血液学复发。持续PML

茎环结构DNA电化学传感芯片对PML/RARα mRNA的检测

PML/RARα融合基因是急性早幼粒细胞白血病的分子学标志,本文根据期其碱基序列设计了茎环结构DNA探针(HP),并且采用电化学酶联免疫分析技术构建出多通道电化学传感芯片,对人工合成的PML/RARα融合基因片断进行检测。实验结果显示:该传感芯片对mRNA的检测限为5.0×10-14 M,检测电流值与靶序列的浓度在0.5-300 pM范围保持良好的线性关系。说明该方法能很好识别完全互补序列与单碱基突变序列,可以实现对PML/RARα融合基因定性定量的测定。

PML-RAR_α融合基因检测方法学的建立

应用筑巢式逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测２３例急性早幼粒白血病（ＡＰＬ），早幼粒白血病基因ＰＭＬ维甲酸受体α融合基因（ＰＭＬ－ＲＡＲα），肯定了２例与急非淋白血病Ｍ２不易鉴别的不典型ＡＰＬ。１５例缓解在２年以内ＡＰＬ此融合基因均阳性，其中Ｌ型８例，Ｓ型７例，Ｌ型中尚发现一个变异型。８例缓解在３年以上ＡＰＬ，此融合基因４例阳性，其中Ｌ型３例，Ｓ型１例，Ｌ型１例已有复发倾向，而缓解超过４年ＡＰＬ此融合基因均为阴性。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα异型的临床意义

为评价急性早幼粒细胞白血病(APL)PML/RARα异型与临床治疗及预后的相关性,对71例诱导治疗的APL患者定期进行血像、骨髓像检查,用巢式RT-PCR检测PML/RARα不同转录本。结果表明:短型(S)和V型白细胞总数比长型(L型)显著升高,所以较易早期发生严重的出血合并症。S型和V型PML/RARα患者的复发率高于L型患者。结论:APL患者PML/RARα异型可作为独立的预后因素。

实时定量PCR监测急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα融合基因的临床意义

目的探讨实时定量PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML/RARα融合基因表达水平的意义。方法用扩增培养的NB4细胞的PML/RARα融合基因进行梯度稀释作为标准品,ABL作为内参,建立标准曲线。采用Taq Man法进行实时定量PCR,并对方法的可靠性、可重复性及灵敏性进行测定。对14例APL患者在初治、诱导缓解及巩固治疗3个时期的PML/RARαmRNA转录本水平进行动态定量监测,结果以NQ表示,NQ=PML/RARαmRNA的拷贝数/ABL mRNA的拷贝数×105。结果实时定量PCR方法可以检测出1×10-5μg NB4细胞cDNA中PML/RARα的融合基因,其重复性和稳定性Ct值变异系数分别为1.77%和2.11%。14例患者初治时骨髓PML/RARα融合基因平均水平为3 731,经全反式维甲酸、三氧化二砷双诱导缓解时PML/RARα融合基因平均水平为231,化疗与维甲酸序贯巩固治疗2个疗程后PML/RARα融合基因平均水平为116。治疗前后比较,PML/RARα基因转录本水平明显下降(P<0.05)。结论实时定量PCR检测PML/RARα融合基因表达敏感性好、特异性高、重复性好,可用于急性早幼粒细胞的诊断和微小残留病的检测。

槲皮素对NB4,HL-60细胞形态、PML mRNA及蛋白表达的影响

目的 探讨槲皮素对NB4,HL 6 0细胞的形态、PMLmRNA及蛋白的表达影响。方法 以NB4,HL 6 0细胞为研究对象 ,细胞形态学观察采用Wright’s染色法及荧光染色法 ;PML蛋白细胞内分布定位采用免疫荧光技术 ;PMLmRNA表达采用RT PCR法。结果 1)经槲皮素处理后 ,各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。 2 )槲皮素处理后NB4细胞内融合蛋白降解 ,PML聚积于POD结构 ,随后降解 ;在HL 6 0细胞 ,PML发生相似改变。 3)槲皮素处理后各组细胞PMLmRNA表达均无显著影响。结论 在槲皮素诱导下 ,PML在蛋白水平参与诱导白血病细胞凋亡机制 ;槲皮素能诱导NB4,HL 6 0细胞凋亡 。

RARα mRNA和RARβ mRNA在过量RA致神经管畸形发生中的表达

目的探讨过量RA对金黄地鼠胚胎神经管RARα和RARβ mRNA表达的影响。方法采用原位杂交及图像分析,半定量分析正常及RA致畸金黄地鼠胚胎神经管中RARα和RARβ mRNA表达水平的变化。结果过量RA可使RARα和RARβ mRNA在金黄地鼠神经管中的表达水平呈现短时下降,随后又大幅上升的变化。结论过量RA引起的RARα和RARβ mRNA表达水平的变化与RA致金黄地鼠神经管畸形相关。

动态监测PML-RARα融合基因对急性早幼粒细胞白血病的临床意义

目的动态监测急性早幼粒细胞白血病(APL)特有的PML-RARα基因,并探讨其临床意义。方法15例APL患者用全反式维甲酸(ATRA)和其他化疗药物进行诱导缓解、巩固和维持治疗,并进行随访,在病程的不同阶段采集骨髓标本进行形态学检查,并采用实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测PML-RARα基因表达。结果15例APL患者入院时PML-RARα均为阳性,治疗中死亡1例、完全缓解14例(93%)。14例完全缓解患者中2例复发,13例在病程中PML-RARα转为阴性。2例复发患者中,1例PML-RARα持续阳性,1例在病程中由阴性转为阳性。13例仍生存者中,至少已连续3次PML-RARα为阴性。结论对APL患者跟踪检测PML-RARα融合基因可早期发现复发病例;RQ-PCR检测PML-RARα对APL诊断、疗效判定及微小残留病变监测是一种有力手段。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立

目的:针对90%以上的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者表达的PML/RARα融合基因,设计引物及探针。对APL患者进行基因筛查,并构建PML/RARα环形质粒作为标准品,建立APL患者PML/RARα融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,为APL患者的诊治提供分子生物学依据。方法:设计PML/RARα及ABL引物及Taqman探针,对APL患者进行基因筛查。并以PML/RARαL型及S型阳性的APL患者cDNA为模板,应用PCR技术扩增出453bp和550bp基因片段,构建pMD 18TPML/RARα(L)及pMD 18T-PML/RARα(S)标准品。实时荧光定量(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术对该基因转录本水平的变化情况进行监测。结果:成功构建pMD 18T-PML/RARα质粒标准品,应用RQ-PCR技术,以ABL为内参,应用Taqman探针法,对APL患者标本进行检测,技术可行,数据稳定。结论:成功构建APL融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,应用于临床病人的基因诊断,为APL的诊治提供了可靠的分子依据。

PML-RARα和hGM-CSF双基因表达载体的构建

目的:构建急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα基因与人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因真核双表达载体,为利用DNA疫苗治疗APL奠定基础。方法:利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达载体。利用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性。结果:NheI/M luI和XbaI/SalI双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,且序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。结论:成功构建了含有PML-RARα基因及hGM-CSF基因的真核双表达载体。

应用荧光原位杂交技术动态观察急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合基因的变化

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)技术在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断及疗效判断中的作用。方法:对初发的急性白血病患者行常规形态学、细胞化学染色,并采用FISH技术检测PMLRARα融合基因,流式细胞术分析白血病细胞的免疫表型,对治疗过程中患者PMLRARα融合基因阳性细胞比例进行动态观察。结果:FISH对标准的PML-RARα融合基因的检出与形态学和临床符合率为100%,对流式细胞学免疫表型不符合的APL诊断的1例作出了明确诊断,对累及17号染色体的附加染色体异常也有一定的提示作用,对APL治疗过程中分子生物学缓解的判断非常直观。结论:FISH技术检测PMLRARα融合基因,实验方法简便、快速、直观和准确,具备了用以确定白血病类型,指导临床治疗和进行治疗后的疗效监测的作用。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因检测的临床意义

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)检测PML/RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断中的应用价值。方法应用常规细胞遗传学分析28例APL患者的染色体核型,同时用FISH法检测PML/RARα融合基因。结果 28例初诊的APL患者254例常规核型分析检出t(15;17)(q22;q12);2例患者核型正常;另1例未检出t(15;17),核型分析结果为涉及15和17号染色体的复杂异常;FISH检测所有病例均存在PML/RARα融合基因。结论 FISH法行PML/RARα融合基因检测特异性和敏感性好,是诊断APL的可靠方法。

含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品的制备及应用

目的建立一个含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品,用于PML/RARαL型)的定量检测。方法从NB4细胞中提取总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板,设计PML/RARα(L型)与ABL基因特异性引物进行PCR,PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收、PCMV4载体克隆后转化DH5α工程菌,提取质粒进行酶切、测序鉴定,提取质粒用于制作荧光定量PCR标准曲线,同时对质粒的稳定性能进行评价。结果结果NB4细胞提取的总RNA完整性良好,构建的质粒经酶切鉴定后与目的条带一致,测序结果与目的片段几乎完全一致,且质粒的原始浓度为9×1012copies/ml,倍比稀释至9×104copies/ml,均能得到良好的标准曲线(R2≈1),且质粒的稳定性好,提示含PML/RARa(L型)与ABL双基因荧光定量PCR质粒标准品构建成功。结论本研究建立了制备含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品方法,并成功制备出稳定的含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品。

巢式RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的意义

目的探讨巢式RT-PCR技术在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的价值。方法采用巢式RT-PCR检测218例初诊为APL患者的PML/RARα融合基因的表达水平及在部分患者的动态变化;随机选择39例APL完全缓解(CR)的患者,分别用流式细胞术(FCM)和巢式RT-PCR监测外周血或骨髓中的微小残留病(MRD)白血病细胞。结果在确诊的167例APL患者中PML/RARα融合基因阳性率为90.4%(151/167);39例APL-CR患者中PML/RARα融合基因阳性率76.9%(30/39);FCM和巢式RT-PCR监测APL-CR患者MRD有很好的一致性(P>0.05)。结论巢式RT-PCR对APL的诊断有高灵敏度和高特异性;对APL的疗效及预后判断有重要临床意义。

复方黄黛片及其与化疗序贯应用清除APL-PML/RARα融合基因的临床研究

目的:探讨复方黄黛片及其与化疗交替序贯应用对急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的影响。方法:采用复方黄黛片及其与化疗序贯治疗42例APL患者,并采用RT-PCR技术监测PML/RARα融合基因。结果:①CR后1个月内融合基因转阴率达92.3%(12/13),12个月内达100%(34/34);②长期监测表明86%(31/36)的患者处于持续阴性状态。③治疗过程中融合基因转为阳性的患者加强治疗可再度转为阴性,处于持续的血液学和分子学缓解状态。结论:复方黄黛片治疗APL有很高的分子学缓解率,联合化疗可使86%以上患者处于持续血液学和分子学缓解状态。

检测PML/RARα基因的双重荧光定量PCR方法的建立

目的建立在一个反应体系中同时检测融合基因PML/RARα和内参基因ABL的双重荧光定量PCR方法。方法从DNA聚合酶含量、Mg2+浓度和引物浓度等方面进行优化,建立检测PML/RARα和ABL基因双重荧光定量PCR体系,从分析灵敏度,批内、批间精密度以及检测临床样本阳性率等方面对双重荧光定量PCR反应体系进行性能评价,并同时和北京思尔成公司荧光定量PCR试剂盒进行比较,分析两者的一致性。结果成功构建双重荧光定量PCR反应体系,检测质粒灵敏度为103copies/ml,检测NB4细胞的灵敏度为10-3,反应体系批内、批间精密度Ct值的变异系数CV都小于5%,检测20例确诊为APL病人,其检测阳性率,和北京思尔成公司的PCR反应试剂一致。结论成功开发出稳定的双重荧光定量PCR试剂盒,其操作简单,成本低,误差小,能够有效地用于APL分子生物学分型诊断、用药指导、预后观察及MRD监测。

PML-RARα对环腺苷酸诱导急性髓系白血病细胞分化的影响

为了进一步探讨环腺苷酸cAMP协同低剂量氧化砷诱导急性早幼粒白血病细胞分化的分子机制,以稳定转染了PML-RARα融合基因的PR9细胞为实验对象,通过观察细胞的生长,并利用形态学实验、流式细胞技术和荧光素酶报告基因转染实验等检测cAMP和/或氧化砷处理前后细胞相关指标的变化,研究PML-RARα在cAMP诱导AML细胞分化过程中的作用。结果显示,虽然cAMP单独能使表达PML-RARα的PR9细胞表面分化抗原CD11b的阳性率有所升高;但细胞形态学分析表明,cAMP单用无法诱导表达PML-RARα融合蛋白的PR9细胞分化,只有联合氧化砷才能使细胞表现出完全分化的特征,并伴有CD11b表达的显著升高。此外,PML-RARα还可以明显抑制含有cAMP反应元件的报告基因的转录。结论:PML-RARα融合蛋白对cAMP诱导AML细胞分化的信号转导途径具有显著的抑制作用。