PML-RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷诱导的NB4细胞凋亡中的作用研究

为研究PML RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷 (As2 S3 )诱导的人早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞凋亡中的作用 ,本研究应用细胞形态观察、流式细胞术测定及DNA电泳等方法观察三硫化二砷对NB4细胞的诱导凋亡作用 ,用染色体G显带技术、反转录PCR及Western印迹测定这一过程中PML RARα融合基因及其表达产物、野生型RARα蛋白的变化。结果表明 ,三硫化二砷在 0 .5 - 2 μmol/L之间能诱导NB4细胞凋亡 ,在此过程中PML RARα融合基因无明显变化 ,但PML RARα融合蛋白和野生型RARα蛋白明显减少。结论提示PML

PML—RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建PML-RARα融合基因相关重组表达质粒，在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化。方法利用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）以PML-RARα全长质粒为模板分别扩增出长度均为1200bp的PML和RARα序列，并将它们分别插入PET32a（＋）质粒中，构建重组表达质粒，化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆，菌落PCR筛选阳性转化子，双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性。正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a（＋）和Flag-RARα-PET32a（＋）。将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3），经异丙基β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，利用表达蛋白的组氨酸＂标签＂（His-tag）进行Ni2＋-树脂柱亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质。结果PCR扩增获得目的基因，重组表达质粒经EcoRI／HindIII双酶切和测序鉴定证明构建正确。转化感受态BL21（DE3）并经诱导后得到高效表达，SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白。结论成功构建重组表达质粒，并经诱导表达后可纯化出目的蛋白，为进一步的抗体制备等实验奠定了基础。

实时定量PCR监测急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα融合基因的临床意义

目的探讨实时定量PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML/RARα融合基因表达水平的意义。方法用扩增培养的NB4细胞的PML/RARα融合基因进行梯度稀释作为标准品,ABL作为内参,建立标准曲线。采用Taq Man法进行实时定量PCR,并对方法的可靠性、可重复性及灵敏性进行测定。对14例APL患者在初治、诱导缓解及巩固治疗3个时期的PML/RARαmRNA转录本水平进行动态定量监测,结果以NQ表示,NQ=PML/RARαmRNA的拷贝数/ABL mRNA的拷贝数×105。结果实时定量PCR方法可以检测出1×10-5μg NB4细胞cDNA中PML/RARα的融合基因,其重复性和稳定性Ct值变异系数分别为1.77%和2.11%。14例患者初治时骨髓PML/RARα融合基因平均水平为3 731,经全反式维甲酸、三氧化二砷双诱导缓解时PML/RARα融合基因平均水平为231,化疗与维甲酸序贯巩固治疗2个疗程后PML/RARα融合基因平均水平为116。治疗前后比较,PML/RARα基因转录本水平明显下降(P<0.05)。结论实时定量PCR检测PML/RARα融合基因表达敏感性好、特异性高、重复性好,可用于急性早幼粒细胞的诊断和微小残留病的检测。

应用荧光原位杂交技术动态观察急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合基因的变化

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)技术在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断及疗效判断中的作用。方法:对初发的急性白血病患者行常规形态学、细胞化学染色,并采用FISH技术检测PMLRARα融合基因,流式细胞术分析白血病细胞的免疫表型,对治疗过程中患者PMLRARα融合基因阳性细胞比例进行动态观察。结果:FISH对标准的PML-RARα融合基因的检出与形态学和临床符合率为100%,对流式细胞学免疫表型不符合的APL诊断的1例作出了明确诊断,对累及17号染色体的附加染色体异常也有一定的提示作用,对APL治疗过程中分子生物学缓解的判断非常直观。结论:FISH技术检测PMLRARα融合基因,实验方法简便、快速、直观和准确,具备了用以确定白血病类型,指导临床治疗和进行治疗后的疗效监测的作用。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因检测的临床意义

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)检测PML/RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断中的应用价值。方法应用常规细胞遗传学分析28例APL患者的染色体核型,同时用FISH法检测PML/RARα融合基因。结果 28例初诊的APL患者254例常规核型分析检出t(15;17)(q22;q12);2例患者核型正常;另1例未检出t(15;17),核型分析结果为涉及15和17号染色体的复杂异常;FISH检测所有病例均存在PML/RARα融合基因。结论 FISH法行PML/RARα融合基因检测特异性和敏感性好,是诊断APL的可靠方法。

巢式RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的意义

目的探讨巢式RT-PCR技术在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的价值。方法采用巢式RT-PCR检测218例初诊为APL患者的PML/RARα融合基因的表达水平及在部分患者的动态变化;随机选择39例APL完全缓解(CR)的患者,分别用流式细胞术(FCM)和巢式RT-PCR监测外周血或骨髓中的微小残留病(MRD)白血病细胞。结果在确诊的167例APL患者中PML/RARα融合基因阳性率为90.4%(151/167);39例APL-CR患者中PML/RARα融合基因阳性率76.9%(30/39);FCM和巢式RT-PCR监测APL-CR患者MRD有很好的一致性(P>0.05)。结论巢式RT-PCR对APL的诊断有高灵敏度和高特异性;对APL的疗效及预后判断有重要临床意义。

复方黄黛片及其与化疗序贯应用清除APL-PML/RARα融合基因的临床研究

目的:探讨复方黄黛片及其与化疗交替序贯应用对急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的影响。方法:采用复方黄黛片及其与化疗序贯治疗42例APL患者,并采用RT-PCR技术监测PML/RARα融合基因。结果:①CR后1个月内融合基因转阴率达92.3%(12/13),12个月内达100%(34/34);②长期监测表明86%(31/36)的患者处于持续阴性状态。③治疗过程中融合基因转为阳性的患者加强治疗可再度转为阴性,处于持续的血液学和分子学缓解状态。结论:复方黄黛片治疗APL有很高的分子学缓解率,联合化疗可使86%以上患者处于持续血液学和分子学缓解状态。

急性早幼粒细胞白血病患儿PML/RARα融合基因罕见型2例

目前认为急性早幼粒细胞白血病（APL ）属于急性髓细胞白血病（AML ）的特殊类型［1］，由于 APL 细胞存在 t （15；17）（q22；q21），该易位使第15号染色体长臂2区2带的早幼粒细胞白血病基因（PML）和第17号染色体长臂2区1带的维甲酸受体‐α（RARα）基因形成 PML ／RARα融合基因，该基因在产生过程中因断裂点不同及 mRNA 的剪切、拼接不同会产生不同的异构体并在 APL 发病中起到重要作用［2］。本院收治2例APL 患儿出现新的 PML ／RARα融合基因变异体，现报道如下。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的检测

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因中的价值。方法对初诊的30例及20例疑似APL的患者进行FISH技术检测PML/RARα融合基因,对治疗过程中PML/RARα融合基因阳性细胞比例进行动态观察,进而协助诊断和指导治疗。结果30例APL中PML/RARα融合基因阳性率90%(27/30),1例AML1/ETO融合基因阳性,确诊为AML-M2;20例未确诊者中AML1/ETO融合基因阳性率15%(3/20),PML/RARα融合基因阳性率50%(10/20),其余7例未检测到以上两种融合基因。达到完全缓解(CR)后有7例融合基因阴性,随访至CR后2年,发现7例PML/RARα融合基因阳性比例较高患者分别于1～3个月后复发。结论FISH技术对APL的诊断具有高灵敏度和高准确度,并精确定位复杂核型中融合信号的位置,可用以确定白血病类型,指导临床治疗和进行治疗后的疗效监测。

一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的建立一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者PML-RARα融合基因的实验方法并作相关性能评价。方法设计两对特异性引物,用一步法RT-PCR法检测APL患者PML-RARα融合基因的三种异构体,并用NB4阳性细胞株做稀释试验,得出该方法的最低检测限;同时对2006年以来华西医院确诊APL患者的PML-RARα融合基因检测和骨髓细胞形态学检查结果进行比较。结果一步法RT-PCR法检测PML-RARα融合基因的灵敏度可达10-4水平;使用两对引物同时扩增,可检出PML-RARα融合基因全部三种异构体;62例经临床和骨髓形态学确诊为APL的患者,其PML-RARα融合基因阳性率为100%。结论一步法RT-PCR检测APL患者PML-RARα融合基因有很好的灵敏度,临床符合度较高且操作简便快速,样本交叉污染可能性小,临床实用性较高。

一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的:建立一步法RT-PCR检测APL患者PML-RARα融合基因的实验方法。方法:用特异引物一步法RT-PCR检测PML-RARα融合基因,并作灵敏度试验。结果:本方法的灵敏度可达到1∶103水平。对25例APL患者检测PML-RARα融合基因,阳性率为100%,并可检测出PML-RARα融合基因各种融合方式。结论:一步法RT-PCR检测PML-RARα融合基因有很好的灵敏度和特异性,操作简便、快速,特别适用于临床检测。

筑巢式RT-PCR检测早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的检测急性早幼粒细胞白血病（APL）中染色体易位t（15;17）所形成的早幼粒细胞白血病一维甲酸受体α（PML-RARα）融合基因转录本。方法筑巢式逆转录酶／多聚酶链反应（RT-PCR）。结果在30例APL中，L型18例，S型10例，另有两例完全缓解者（CR4年和6年）未检测到上述转录本。10例初治APL同时进行PML-RARα融合基因和细胞遗传学检查，10例患者均检测到PML-RARα融合基因，而只有6例检测到t（15;17）易位染色体。结论PML-RARα融合基因检测在APL的诊断、疗效评价及MRD的监测中是一个快速、准确且灵敏的方法。

计时电量法用于检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的研究

以氯化六氨合钌([Ru(NH3)6]3+)为杂交指示剂,通过Au-S键的共价结合,将DNA探针固定在电极表面与互补靶序列杂交,构建了计时电量法(CC)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中PML/RARα融合基因的电化学DNA传感器,并通过对比杂交前后电量的变化检测互补序列及浓度。由于杂交前后与DNA链静电结合的[Ru(NH3)6]3+量不同而形成电量差值(ΔQ),随着靶序列浓度的增加,[Ru(NH3)6]3+引起的电量差值增大。在最佳实验条件下,此传感器显示了良好的特异性,能区分完全互补和错配序列,并可对融合基因进行定量。互补靶DNA序列在1.0×10-12～1.0×10-8 mol.L-1浓度范围内,ΔQ与DNA浓度的对数值呈良好的线性关系,检出限为4.0×10-13 mol.L-1。实验结果表明,以[Ru(NH3)6]3+为电化学指示剂的DNA传感器,能很好地对含PML/RARα融合基因的靶序列进行定性定量检测。

急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα融合基因首次转阴时间及其临床意义探讨

目的:为了观察和分析急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)PML/RARα融合基因首次转阴时间和首次转阴时间长短的临床意义。方法:选取我院初诊APL患者60例,按照APL临床路径行诱导缓解及缓解后巩固治疗和维持治疗;应用多重巢式PCR动态监测APL患者PML/RARα融合基因的表达水平变化,计算首次转阴时间,随访观察并评价首次转阴时间的临床意义。结果:除3例死亡和1例失访外,其余56例初诊APL患者经正规治疗后,其PML/RARα融合基因均在24至381 d之间首次转阴,平均首次转阴时间为(131±90)d。首次转阴时间在PML/RARα融合基因不同亚型之间存在差异,L型转阴时间较S型的短(P=0.032),而不同年龄、性别、危险度分层组别之间差异均无统计学意义。首次转阴后的56例患者分别随访25 d至1979 d,中位随访时间为946 d,其中1例133 d首次转阴患者维持3个月后转阳并且随后出现临床复发,其余55例患者均长期保持分子水平缓解。结论:初诊APL患者PML/RARα融合基因平均约在正规治疗后4个月首次转阴;不同基因亚型之间首次转阴时间存在差异。PML/RARα融合基因首次转阴时间可客观反映APL患者治疗后白血病细胞的消减水平,对临床治疗有提示作用,但不能作为判断预后的绝对依据;以PML/RARα融合基因动态监测微小残留病灶对分析APL复发具有重要的临床意义。

荧光原位杂交技术检测急性早幼粒细胞白血病的PML/RARα融合基因重排

目的:探讨双色双融合荧光原位杂交技术(dual-color and dual-fusion fluorescence in-situ hybridization,D-FISH)在急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)诊断中的应用价值。方法:同时应用常规细胞遗传学R显带(RHG)核型分析和双色双融合荧光原位杂交2种方法,对21例APL患者进行检测。结果:21例APL患者中,常规细胞遗传学检出t(15;17)染色体易位18例,D-FISH检测均为PML/RARα融合基因(+);2例阴性和1例因无分裂相而无法分析结果者经D-FISH检测均为(+)。D-FISH检测总阳性率100%(21/21),高于常规细胞遗传学检查阳性率85.71%(18/21)。结论:与常规细胞遗传学方法相比,D-FISH检测APL的PML/RARα融合基因具有简便、快速、灵敏、特异性强等优点,可以作为APL临床诊断的一种重要检测方法。

RQ-PCR动态监测急性早幼粒细胞白血病患者治疗过程中PML/RARα融合基因表达的临床意义

目的:初步观察急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者PML/RARα融合基因在治疗过程中的动态变化。方法:收集2008年1月至2012年6月广东省人民医院初诊APL患者临床资料及融合基因表达监测结果。结果:47例初诊APL患者,男30例,女17例,中位年龄29(6～67)岁。PML/RARα融合基因以ABL基因作为内参进行标化(normalized quantity,NQ)。治疗前31例患者NQ中位数0.446 7(0.044～1.451 2)。患者获得完全血液学缓解(CR)时及CR后巩固化疗1～4疗程NQ中位数分别为0.000 53(0～0.030 4)、0(0～0.001 037)、0(0～0.000 27)、0(0～0.000 24)、0(0～0.000 08),基因表达阳性率分别为82.6%、31.6%、26.1%、9.1%、4.8%,维持治疗期间降至0。结论:PML/RARα融合基因表达水平能够直观、有效的反应APL患者治疗过程中微小残留病变(minimal residual disease,MRD)水平的变化,可用于APL患者的疗效评估。

检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的电化学传感器研制

针对急性早幼粒细胞白血病(APL)中PML/RARα融合基因的碱基序列,设计了锁核酸(LNA)修饰的发夹结构捕获探针,结合信号探针构建新型的"三明治"电化学传感模式。信号探针末端修饰的生物素可与酶上的亲和素结合,通过检测酶催化H2O2氧化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)产生的电化学信号,实现对靶序列的检测。该传感器可识别和定量检测PBS缓冲液中人工合成的PML/RARα融合基因序列。结果表明,该传感器能很好地区分互补序列、单碱基及多碱基错配序列,杂交电流值与目标链浓度在1.0×10-11～1.6×10-10 mol/L范围内呈较好的线性关系,检出限为1.0×10-13 mol/L。同时,该新型传感器成功地用于无稀释人血清中PML/RARα融合基因的检测,具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点,有望用于临床实际样品的检测,进而实现临床上急性早幼粒细胞白血病的早期诊断及预后判断。

石墨烯修饰玻碳电极用于急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因的检测

应用电化学还原法将固定在玻碳电极表面的氧化石墨还原为石墨烯,然后利用偶联活化剂将经过氨基修饰的急性早幼粒细胞白血病(APL)PML/RARα融合基因序列探针固定到石墨烯修饰电极表面,以亚甲基蓝(MB)为电化学杂交指示剂,并由差分脉冲伏安法检测人工合成APL的PML/RARα融合基因.结果表明,石墨烯对MB的检测信号起到了很好的增敏作用,杂交前后MB还原峰电流差值与靶标链DNA浓度在5×10-10～2.5×10-9 mol/L范围内呈线性关系,检出限为8×10-11 mol/L.该方法简单、特异性好,有望用于实际样品的检测.