应用荧光原位杂交技术动态观察急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合基因的变化

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)技术在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断及疗效判断中的作用。方法:对初发的急性白血病患者行常规形态学、细胞化学染色,并采用FISH技术检测PMLRARα融合基因,流式细胞术分析白血病细胞的免疫表型,对治疗过程中患者PMLRARα融合基因阳性细胞比例进行动态观察。结果:FISH对标准的PML-RARα融合基因的检出与形态学和临床符合率为100%,对流式细胞学免疫表型不符合的APL诊断的1例作出了明确诊断,对累及17号染色体的附加染色体异常也有一定的提示作用,对APL治疗过程中分子生物学缓解的判断非常直观。结论:FISH技术检测PMLRARα融合基因,实验方法简便、快速、直观和准确,具备了用以确定白血病类型,指导临床治疗和进行治疗后的疗效监测的作用。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因检测的临床意义

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)检测PML/RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断中的应用价值。方法应用常规细胞遗传学分析28例APL患者的染色体核型,同时用FISH法检测PML/RARα融合基因。结果 28例初诊的APL患者254例常规核型分析检出t(15;17)(q22;q12);2例患者核型正常;另1例未检出t(15;17),核型分析结果为涉及15和17号染色体的复杂异常;FISH检测所有病例均存在PML/RARα融合基因。结论 FISH法行PML/RARα融合基因检测特异性和敏感性好,是诊断APL的可靠方法。

实时定量RT-PCR检测PML-RARα融合基因诊断APL的临床价值

目的探讨一步法实时定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)技术在急性早幼粒细胞白血病(APL)患者诊断及微小残留病(MRD)检测中的临床价值。方法应用一步法RQ-RT-PCR、Taqman探针技术检测42例APL初诊患者和30例完全缓解(CR)患者骨髓PML-RARα融合基因的两种常见异构体转录本mRNA的表达。同时采用多参数流式细胞术(FCM)对部分患者骨髓MRD进行检测,并比较两种检测方法的一致性。结果①42例APL初诊患者的PML-RARα融合基因转录本中位标准拷贝数(NCN)为61%(13%～284%),其中L型34例,S型8例。L型和S型异构体中位NCN分别为56%(28%～278%)和70%(13%～284%),两者比较,P>0.05;②30例APL患者经标准诱导治疗CR后PML-RARα融合基因转录本中位NCN为4.00%(0.00%～8.26%);③一步法RQ-RT-PCR和FCM同时检测结果有较好的一致性(χ2=0.278,P=0.598),总符合率83.3%。结论一步法RQ-RT-PCR具有操作简便、特异性好、灵敏度高、结果可靠、直观等特点,有利于对APL的诊断和MRD检测。

检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的DNA传感器研制

利用共价键合法,将氨基修饰的具有急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因特异性的单链DNA探针固定在玻碳电极表面,构成急性早幼粒细胞白血病DNA传感器(急粒DNA传感器)。以电活性的芦荟大黄素(AE)为杂交指示剂,考察了杂交温度及传感器的特异性、重现性和检出限等性能。结果表明:AE在裸电极上的吸附常数为(4.5±0.2)×105L.mol-1,与单链DNA修饰的玻碳电极(ssDNA/GCE)和双链DNA修饰的玻碳电极(dsDNA/GCE)结合常数分别为(2.1±0.4)×105和(2.7±0.2)×105L.mol-1。这种新型的DNA传感器具有特异性强、灵敏度高和重现性好的优点。应用此方法于临床血清分析,初步探索了将该法应用于临床检测的可行性。

PML/RARα融合基因检测早幼粒细胞白血病微小残留病

目的:PML/RARα融合基因在监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(MRD)中的意义。方法:诱导缓解及巩固维持治疗期间,采用筑巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测患者骨髓细胞中PML-RARα融合基因的变化。结果:长期随访的18例完全缓解(CR)患者,2例分子学复发。其中1例发生于CR1后4个月,诱导缓解治疗后获CR2,CR2后2个月再次分子学与血液学的复发,诱导治疗1个疗程获得CR3;1例发生于CR1后74个月,诱导缓解治疗后获得CR2,随访结束时生存期已达106个月。结论:在CR期定期监测PML-RARα融合基因,可尽早发现分子学复发,及时治疗可避免血液学复发。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的检测

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因中的价值。方法对初诊的30例及20例疑似APL的患者进行FISH技术检测PML/RARα融合基因,对治疗过程中PML/RARα融合基因阳性细胞比例进行动态观察,进而协助诊断和指导治疗。结果30例APL中PML/RARα融合基因阳性率90%(27/30),1例AML1/ETO融合基因阳性,确诊为AML-M2;20例未确诊者中AML1/ETO融合基因阳性率15%(3/20),PML/RARα融合基因阳性率50%(10/20),其余7例未检测到以上两种融合基因。达到完全缓解(CR)后有7例融合基因阴性,随访至CR后2年,发现7例PML/RARα融合基因阳性比例较高患者分别于1～3个月后复发。结论FISH技术对APL的诊断具有高灵敏度和高准确度,并精确定位复杂核型中融合信号的位置,可用以确定白血病类型,指导临床治疗和进行治疗后的疗效监测。

实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因

本研究旨在建立用实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARa mRNA的方法,探讨APLPML-RARa融合基因表达水平与疗效的关系。用RT-PCR扩增培养的NB4细胞的PML-RARa融合基因,取1μgNB4细胞的总cDNA进行10倍的梯度稀释,作为标准品,建立荧光定量RT-PCR方法,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行了测定。定量检测4例急性早幼粒细胞白血病(APL)患者治疗前后骨髓内PML-RARa融合基因转录本水平,并对1例经治疗完全缓解后又复发的患者PML-RARa转录本水平(拷贝数)进行动态监测。结果表明:用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10-5μgNB4细胞cDNA中的PML-RARa融合基因,其重复性的CT值,管间、批间变异系数(CV)分别为2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PML-RARa基因转录本水平的分别为1884、5533、1803、4677拷贝,平均为3475拷贝。经ATRA+化疗治疗后其PML-RARa基因转录水平下降至40、135、79、229拷贝,平均为121拷贝。还有1例患者治疗前PML-RARa基因转录本水平为8600拷贝,经过4个月治疗,虽然此时患者处于完全缓解期,但其转录水平拷贝数仍有730。3个月后患者出现复发,转录本水平升至为11000拷贝。经过ATRA+化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1200拷贝。结论;建立的实时定量RT-PCR灵敏、重复性好。治疗后APL患者的PML-RARa融合基因转录本水平明显下降,复发时基因转录本水平又升高。融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系一致,这有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立

目的:针对90%以上的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者表达的PML/RARα融合基因,设计引物及探针。对APL患者进行基因筛查,并构建PML/RARα环形质粒作为标准品,建立APL患者PML/RARα融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,为APL患者的诊治提供分子生物学依据。方法:设计PML/RARα及ABL引物及Taqman探针,对APL患者进行基因筛查。并以PML/RARαL型及S型阳性的APL患者cDNA为模板,应用PCR技术扩增出453bp和550bp基因片段,构建pMD 18TPML/RARα(L)及pMD 18T-PML/RARα(S)标准品。实时荧光定量(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术对该基因转录本水平的变化情况进行监测。结果:成功构建pMD 18T-PML/RARα质粒标准品,应用RQ-PCR技术,以ABL为内参,应用Taqman探针法,对APL患者标本进行检测,技术可行,数据稳定。结论:成功构建APL融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,应用于临床病人的基因诊断,为APL的诊治提供了可靠的分子依据。

PML-RARa融合基因BCR3亚型急性早幼粒细胞白血病的临床研究

目的研究全反式维甲酸(ATRA)联合亚砷酸(ATO)治疗初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)的疗效。方法回顾性分析ATRA联合ATO诱导治疗+序贯巩固化疗+ATO/ATRA维持治疗,对初诊急性早幼粒细胞白血病患者的疗效。并比较在高危组与中低危组间,及不同PML-RARa融合基因亚型组间的疗效差异。结果高危组和中低危组的完全缓解率分别为70.0%和96.9%,差异无统计学意义(P=0.04),3年总生存率(OS)分别为(70.0±14.5)%,(96.9±3.1)%,差异有统计学意义(P=0.01);3年无病生存率(DFS)分别为(66.7%±19.2)%,(93.8±6.1)%,差异无统计学意义(P=0.08);PML-RARa融合基因BCR1亚型组与BCR3亚型组的完全缓解率分别为78.6%和95.6%,差异无统计学意义(P=0.14),3年OS率分别为(95.7±4.3)%,(78.6±11.0)%,差异无统计学意义(P=0.18);DFS率分别为(92.9±6.9)%,(87.5±11.7)%,差异无统计学意义(P=0.24)。结论 ATRA联合亚砷酸作为一线用药治疗初诊急性早幼粒细胞白血病,尤其对于BCR3亚型患者取得了非常好的疗效。

微滴式数字PCR技术检测外泌体PML-RARA融合基因的表达

目的:利用微滴式数字PCR技术检测外泌体中PML-RARA融合基因表达水平。方法:使用基于Taqman探针法的ddPCR技术,建立可检测长型和短型PML-RARA融合基因转录本的方法。以PML-RARA阴性细胞株HL-60细胞的RNA逆转录合成的cDNA为阴性对照建立空白检测限(LOB);以表达长型PML-RARA融合基因的NB4细胞RNA逆转录合成的cDNA和含短型PML-RARA cDNA的重组质粒为模板分别确定两者的最低检测限(LOD);并检测NB4细胞培养上清来源的外泌体和急性早幼粒白血病患者血清来源的外泌体中PML-RARA融合基因的表达情况。结果:采用ddPCR技术针对长型和短型PML-RARA转录本测得的LOB分别为每微升PCR反应体系中含0.0725拷贝和0.083拷贝;测得的LOD分别为每微升PCR反应体系中含0.19拷贝和0.21拷贝;使用该检测方法,在NB4细胞培养上清来源的外泌体和急性早幼粒细胞白血病患者血清来源的外泌体中均可检测到PML-RARA融合基因的表达。结论:建立了一种基于ddPCR技术检测融合基因转录本的方法,可对外泌体中的微量PML-RARA转录本进行绝对定量,为无创动态监测急性早幼粒细胞白血病患者血清外泌体中PML-RARA融合基因的表达水平提供了可能。

PML/RARa融合基因监测急性早幼粒细胞白血病微小残留病的临床意义

目的:观察PML/RARa融合基因在监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(MRD)中的临床意义。方法:诱导缓解及巩固维持治疗期间,采用筑巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测患者骨髓细胞中PML-RARa融合基因的动态变化,PML-RARa融合基因。结果:长期随访的18例完全缓解(CR)患者,2例出现分子学复发。其中1例发生于CR1后后4个月,诱导缓解治疗后获得CR2, CR2后2个月再次出现分子学与血液学的复发,诱导治疗1个疗程获得CR3;1例发生于CR1后74个月,诱导缓解治疗后获得CR2,随访结束时生存期已达106个月。结论:在CR期定期监测PML-RARa融合基因,可早期发现分子学复发,及时干预治疗可避免血液学复发。

儿童急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因跟踪检测的临床意义(英文)

目的 探讨跟踪检测急性早幼粒细胞白血病 (APL)特有的PML RARα融合基因在发现APL早期复发和指导APL临床治疗方面的意义。方法 1 0例APL患儿用全反式维甲酸 (ATRA)和 (或 )其它化疗药物进行诱导缓解、巩固治疗和维持治疗 ,并进行随访。在病程的不同阶段采集骨髓标本进行形态学检查 ,并应用RT PCR方法检测PML RARα融合基因。结果 随访时间为 1 4～ 1 5 6月 (中位时间 4 2月 ) ,5年无病生存率为 5 6 .0 %±1 6 .5 %。 1 0例APL患儿完全缓解 (CR)率为 90 % ,早期死亡 1例。 9例CR病人中 4例在CR后 1 4～ 4 2月复发 ,4例在连续完全缓解 4～ 5年后已停药 ,停止治疗时间为 1 8～ 96月。 1例CR ,仍在继续治疗中。 9例CR患儿中 ,8例在病程中PML RARα转为阴性 ,1例持续阳性。 4例复发病人中 ,2例复发前持续阳性 ,2例在病程中由阴性转为阳性。 5例仍生存的患儿中 ,1例在病程中PML RARα由阴性转为阳性 ,2例分别在持续完全缓解 36和 4 2月仍呈阳性 ,这 3例患儿经治疗干预后均转阴 ,且长期生存。结论 对APL患儿跟踪检测PML RARα可早期发现分子复发 ,及时干预治疗可避免血液学复发。

改进的RT-PCR检测PML/RARα融合基因快速诊断急性早幼粒细胞白血病

在急性早幼粒细胞白血病 (APL)细胞中迅速、准确检出PML/RARα融合基因对于及时应用全反式维甲酸 (ATRA)或亚砷酸 (As2 O3 )提高诱导缓解率、减轻出血导致的早期死亡至关重要 ,但目前临床上采用的嵌套式RT PCR方法繁琐且费时 ,亟待改进以满足临床APL快速、准确诊断的需要。本研究采用TRIZOL 快速提取高质量的细胞总RNA ,随机引物反转录 ,热启动单轮PCR ,适当控制MgCl2 及引物浓度和Taq酶用量 ,4条引物 ,3个体系 ,相同循环参数 ,对 4 0例初诊APL患者骨髓标本同时扩增PML/RARα融合基因及内对照RARα。结果显示 ,4 0例APL患者标本均扩增出特异条带 ,非APL标本无特异扩增产物 ;阳性扩增片段清晰易辩、断裂点类型易于确定 ,检测可在 6小时内完成。结论 :此改进的RT PCR检测PML/RARα融合基因快速、特异、简便 。

抗PML-RARα反义核酸对NB4细胞生长、细胞周期及细胞凋亡的影响

目的：探讨抗ＰＭＬ－ＲＡＲα反义核酸对早幼粒白血病细胞生长、细胞周期、细胞凋亡的作用。方法：以ＮＢ４细胞株为研究对象；细胞计数采用台盼兰排除、计数板计数法；白血病细胞集落采用甲基纤维素半固体培养；流式细胞仪（ＦＣＭ）用于检测细胞凋亡和细胞周期。结果：以６０μｇ／ｍｌ的终浓度处理细胞，抗 ＰＭＬ－ＲＡＲα融合部位反义核酸（ＦＵＡＳ）能明显抑制ＮＢ４细胞增殖及白血病细胞集落（ＡＭＬ－ＣＦＵ）形成，最大抑制率分别为４６．８％，５１．６％；ＧＭ－ＣＳＦ能减弱ＦＵＡＳ的作用，ＦＵＡＳ作用时间越短，ＧＭ－ＣＳＦ促ＡＭＬ－ＣＦＵ增加越明显；ＦＵＡＳ处理第７，９天，出现明显的凋亡细胞群，凋亡细胞百分比分别为４１．０％，３４．２％；ＦＵＡＳ处理第５天Ｓ期下降，Ｇ２／Ｍ期升高，第７天Ｃ０／Ｇ１期明显升高，Ｓ期回升。结论：抗ＰＭＬ－ＲＡＲα反义核酸具有抑制早幼粒白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。

PML-RAR α基因在早幼粒细胞性白血病发病中的作用研究

目的：通过封闭ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因对ＮＢ４细胞生长分化作用的影响，探讨ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因与ＡＰＬ发病的关系。方法：用反义核酸封闭ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因的表达。ＮＢ４细胞的生长、分化及功能，通过细胞生长曲线、形态学、细胞表面标志及ＮＢＴ还原试验判定；细胞周期应用流式细胞仪分析。结果：ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因的封闭能够抑制ＮＢ４细胞生长，促进其分化成熟，同时可降低Ｓ期细胞的百分比（由５６％降至３７％）。结论：急性早幼粒细胞性白血病（ＡＰＬ）特征性的染色体易位ｔ（１５；１７）形成的ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因，是ＡＰＬ发病的分子基础。

PML—RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建PML-RARα融合基因相关重组表达质粒，在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化。方法利用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）以PML-RARα全长质粒为模板分别扩增出长度均为1200bp的PML和RARα序列，并将它们分别插入PET32a（＋）质粒中，构建重组表达质粒，化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆，菌落PCR筛选阳性转化子，双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性。正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a（＋）和Flag-RARα-PET32a（＋）。将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3），经异丙基β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，利用表达蛋白的组氨酸＂标签＂（His-tag）进行Ni2＋-树脂柱亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质。结果PCR扩增获得目的基因，重组表达质粒经EcoRI／HindIII双酶切和测序鉴定证明构建正确。转化感受态BL21（DE3）并经诱导后得到高效表达，SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白。结论成功构建重组表达质粒，并经诱导表达后可纯化出目的蛋白，为进一步的抗体制备等实验奠定了基础。

PML-RARα245-hIL-2双基因表达载体的构建和表达研究

目的:采用长度为245 bp的PML-RARα融合基因片段构建一种新的PML-RARα融合基因与人白介素-2(hIL-2)基因真核双表达质粒。方法:利用RT-PCR从NB4细胞的RNA中扩增出包含PML-RARα基因融合点的长度为245 bp的基因片段,通过RT-PCR从Jurkat细胞中扩增hIL-2基因,并将两基因片段分别克隆到pIRES质粒中,通过酶切和测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测该质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交和ELISA技术检测目的蛋白的表达。结果:Nhe I/Mlu I和Sal I/Not I双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα融合基因片段和hIL-2基因,测序结果证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将构建的pIRES-PML-RARα245-hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML-RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录并翻译出相应蛋白。结论:成功构建了含有245 bp的PML-RARα基因与hIL-2基因的真核双表达载体,该载体能够在真核细胞中正常转录并翻译出PML-RARα和hIL-2蛋白,为利用DNA疫苗治疗急性早幼粒细胞白血病提供了更丰富的资料。

儿童急性早幼粒细胞白血病PML-RAR_α融合基因连续检测的临床意义

目的 :研究儿童急性早幼粒细胞白血病 (APL)的临床治疗和PML RARα 融合基因连续检测的意义。 方法 :以全反式维A酸 (ATRA)单用或联合化疗进行诱导缓解 ,常规联合化疗巩固 ,常规化疗、小剂量化疗和维A酸 (Tretinoin)交替维持治疗的方案 ,治疗 10例儿童APL。应用逆转录聚合酶链扩增 (RT PCR)方法在病程的不同阶段连续检测PML RARα变化 ,作为鉴测微小残留白血病细胞的指标。 结果 :10例APL中完全缓解 (CR) 9例 ,CR率 90 %。 9例CR患儿中 4例在CR后 14～ 4 2个月复发 ;1例仍在继续治疗中 ;生存期达 34个月 ;4例在连续CR 4～ 5年后已停药 ,停止治疗时间为 18～ 96个月 ,生存期达 72～ 15 6个月。 10例患儿中 ,8例在病程中PML RARα 转为阴性 ,首次转阴时间为 6～ 4 2个月 ,1例持续阳性。4例复发患儿中 ,2例复发前持续阳性 ,2例为病程中由阴性转为阳性。 5例仍生存者 ,至少已 2次连续检查为阴性。 1例在病程中由阴性转为阳性、2例分别在持续CR 36和 4 2个月仍阳性的患儿 ,在治疗干预后均转阴 ,且长期生存。结论 :在连续CR期定期检测PML RARα 可早期发现分子复发 ,及时干预治疗可避免血液学复发。持续PML

pIRES-PML-RARα重组载体的构建和表达研究

目的:采用不同长度的PML-RARα融合基因片段与pIRES质粒构建真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达。方法:利用逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)从NB4细胞的RNA中分别扩增出包含PML-RARα基因融合点的长度为245 bp和384 bp的基因片段,并将不同长度的基因片段分别克隆到pIRES质粒中,通过酶切和测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒转染K562细胞,通过RT-PCR和实时荧光定量PCR检测该质粒在真核细胞中的转录。结果:NheⅠ/MluⅠ双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα融合基因片段,测序结果证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将构建的pIRES-PML-RARα质粒转染K562细胞后经RT-PCR和实时荧光定量PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML-RARα基因能够在真核细胞中进行正常转录。结论:成功构建了含有不同长度的PML-RARα基因的真核表达载体,该载体能够在真核细胞中正常转录,为研发DNA疫苗用于治疗急性早幼粒细胞白血病提供重要资料。

表型分析在PML-RARA转基因小鼠筛选中的应用

PML-RARA转基因 ( Tg)小鼠发生急性早幼粒细胞白血病 ( APL) ,为深入研究APL 发病机理提供了良好模型。对 Tg小鼠进行定期观察和表型分析 ,结果表明 PML-RARA Tg小鼠经历白血病前期和白血病早期阶段 ,最终发展成典型的终末期白血病 ,证实 Tg小鼠 APL 的发生是一个经历多阶段的渐进过程 ,各阶段具有明确可分的细胞形态学和组织病理学特征性改变。通过对 Tg小鼠进行定期观察并作外周血、骨髓象和组织病理学分析 ,筛选处于 APL不同发病阶段的 Tg小鼠 ,为研究 APL多阶段渐进的发病过程中基因型改变提供了良好的实验依据。