腺病毒介导的PML(NLS^-)过表达对白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响

目的利用腺病毒介导PML(NLS-)的过表达,探讨PML(NLS-)对NB4白血病细胞增殖凋亡的影响。方法重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经Pac I酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度;重组腺病毒感染NB4细胞,荧光显微成像和流式细胞术检测感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NB4细胞中PML(NLS-)的转录及表达水平,MTT实验观察细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期及凋亡。结果重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经酶切和测序鉴定正确,经4轮扩增病毒滴度为1×1010pfu/m L;重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染NB4细胞效率达75%,PML(NLS-)基因可在NB4细胞中高效表达;NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体感染组(P<0.05),S期细胞比例明显增高(P<0.05),G2期细胞比例明显减少(P<0.05);实验组细胞凋亡率明显低于空病毒感染组(P<0.05)。结论 PML(NLS-)过表达能够促进白血病NB4细胞的体外增殖能力,抑制其凋亡。

PML基因诱导角质形成细胞凋亡及其Fas,Fasl和Bcl-2表达

目的探讨PML基因在银屑病发病机制中的作用。方法通过流式细胞仪及Annexin V法检测经PML基因转染的角质形成细胞凋亡;采用免疫组织化学、基因探针杂交测定经PML基因作用后的角质形成细胞Fas,Fasl和Bcl-2表达。结果 PML基因上调角质形成细胞Fas及Fasl表达(P<0.01),抑制Bcl-2基因表达,诱导角质形成细胞凋亡。结论 PML基因可能通过上调角质形成细胞Fas抗原及Fasl表达,抑制Bcl-2基因表达,进而诱导角质形成细胞凋亡而参与银屑病的发病。

PML-RARα和hGM-CSF双基因表达载体的构建

目的:构建急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα基因与人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因真核双表达载体,为利用DNA疫苗治疗APL奠定基础。方法:利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达载体。利用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性。结果:NheI/M luI和XbaI/SalI双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,且序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。结论:成功构建了含有PML-RARα基因及hGM-CSF基因的真核双表达载体。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立

目的:针对90%以上的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者表达的PML/RARα融合基因,设计引物及探针。对APL患者进行基因筛查,并构建PML/RARα环形质粒作为标准品,建立APL患者PML/RARα融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,为APL患者的诊治提供分子生物学依据。方法:设计PML/RARα及ABL引物及Taqman探针,对APL患者进行基因筛查。并以PML/RARαL型及S型阳性的APL患者cDNA为模板,应用PCR技术扩增出453bp和550bp基因片段,构建pMD 18TPML/RARα(L)及pMD 18T-PML/RARα(S)标准品。实时荧光定量(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术对该基因转录本水平的变化情况进行监测。结果:成功构建pMD 18T-PML/RARα质粒标准品,应用RQ-PCR技术,以ABL为内参,应用Taqman探针法,对APL患者标本进行检测,技术可行,数据稳定。结论:成功构建APL融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,应用于临床病人的基因诊断,为APL的诊治提供了可靠的分子依据。

实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因

本研究旨在建立用实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARa mRNA的方法,探讨APLPML-RARa融合基因表达水平与疗效的关系。用RT-PCR扩增培养的NB4细胞的PML-RARa融合基因,取1μgNB4细胞的总cDNA进行10倍的梯度稀释,作为标准品,建立荧光定量RT-PCR方法,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行了测定。定量检测4例急性早幼粒细胞白血病(APL)患者治疗前后骨髓内PML-RARa融合基因转录本水平,并对1例经治疗完全缓解后又复发的患者PML-RARa转录本水平(拷贝数)进行动态监测。结果表明:用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10-5μgNB4细胞cDNA中的PML-RARa融合基因,其重复性的CT值,管间、批间变异系数(CV)分别为2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PML-RARa基因转录本水平的分别为1884、5533、1803、4677拷贝,平均为3475拷贝。经ATRA+化疗治疗后其PML-RARa基因转录水平下降至40、135、79、229拷贝,平均为121拷贝。还有1例患者治疗前PML-RARa基因转录本水平为8600拷贝,经过4个月治疗,虽然此时患者处于完全缓解期,但其转录水平拷贝数仍有730。3个月后患者出现复发,转录本水平升至为11000拷贝。经过ATRA+化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1200拷贝。结论;建立的实时定量RT-PCR灵敏、重复性好。治疗后APL患者的PML-RARa融合基因转录本水平明显下降,复发时基因转录本水平又升高。融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系一致,这有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因检测的临床意义

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)检测PML/RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断中的应用价值。方法应用常规细胞遗传学分析28例APL患者的染色体核型,同时用FISH法检测PML/RARα融合基因。结果 28例初诊的APL患者254例常规核型分析检出t(15;17)(q22;q12);2例患者核型正常;另1例未检出t(15;17),核型分析结果为涉及15和17号染色体的复杂异常;FISH检测所有病例均存在PML/RARα融合基因。结论 FISH法行PML/RARα融合基因检测特异性和敏感性好,是诊断APL的可靠方法。

腺病毒载体介导的PML生长抑制因子转染人角质形成细胞的实验研究

目的探讨腺病毒介导的PML基因对角质形成细胞(KC)的生长抑制作用。方法用原位杂交和免疫组织化学法分别检测PML基因重组腺病毒的转导效率,观察培养人KC中PMLmRNA和蛋白的表达量及表达时间,MTT法检测PML基因转染后人KC的生长状况,观察转染PML基因后KC的增殖能力的变化。结果腺病毒滴度为100MO I时被转染的人KC可达100%,Ad-PML基因转染的人KC能高效表达PMLmRNA和PML蛋白,表达时间可持续2周以上,PML基因对人KC体外生长具有明显抑制作用。结论腺病毒介导的PML基因能在人KC中高效稳定地表达,能显著抑制人KC的体外生长,PML生长抑制因子有可能用于银屑病等皮肤病的基因治疗。

微滴式数字PCR技术检测外泌体PML-RARA融合基因的表达

目的:利用微滴式数字PCR技术检测外泌体中PML-RARA融合基因表达水平。方法:使用基于Taqman探针法的ddPCR技术,建立可检测长型和短型PML-RARA融合基因转录本的方法。以PML-RARA阴性细胞株HL-60细胞的RNA逆转录合成的cDNA为阴性对照建立空白检测限(LOB);以表达长型PML-RARA融合基因的NB4细胞RNA逆转录合成的cDNA和含短型PML-RARA cDNA的重组质粒为模板分别确定两者的最低检测限(LOD);并检测NB4细胞培养上清来源的外泌体和急性早幼粒白血病患者血清来源的外泌体中PML-RARA融合基因的表达情况。结果:采用ddPCR技术针对长型和短型PML-RARA转录本测得的LOB分别为每微升PCR反应体系中含0.0725拷贝和0.083拷贝;测得的LOD分别为每微升PCR反应体系中含0.19拷贝和0.21拷贝;使用该检测方法,在NB4细胞培养上清来源的外泌体和急性早幼粒细胞白血病患者血清来源的外泌体中均可检测到PML-RARA融合基因的表达。结论:建立了一种基于ddPCR技术检测融合基因转录本的方法,可对外泌体中的微量PML-RARA转录本进行绝对定量,为无创动态监测急性早幼粒细胞白血病患者血清外泌体中PML-RARA融合基因的表达水平提供了可能。

抑癌基因PML在宫颈病变组织中的突变探讨

目的探讨抑癌基因早幼粒细胞性白血病基因(PML)在宫颈病变组织中是否存在突变。方法随机选取以下宫颈病变新鲜组织标本,包括宫颈上皮内瘤样病变I级(CINⅠ)、CINⅡ、CINⅢ、宫颈浸润鳞癌各30例、以及因其他疾病切除子宫病理证实为慢性宫颈炎者30例。用变性高效液相色谱(DHPLC)进行PML基因全部外显子及内含子-外显子交接区突变的筛查,对其中10例宫颈浸润鳞癌组织进行PML基因全部外显子及内含子-外显子交接区测序。结果全部组织均未发现PML基因突变。结论 PML在蛋白质水平的表达改变不是由其基因突变所引起。

三氧化二砷及全反式维甲酸对白血病NB4细胞PML/RARA融合基因的影响

目的探讨在NB4细胞增殖过程中PML/RARA融合基因表达的情况,并用三氧化二砷(As2O3)和/或全反式维甲酸(All trans retinoic acid,ATRA)干扰后观察目的基因的变化。方法用As2O3(1×106 mol/L)或/和ATRA(1×106 mol/L)干扰体外培养成熟的NB4细胞,后用real/Time PCR检测PML/RARA融合基因的相对表达量。结果ATRA及As2O3均使PML/RARA融合基因表达抑制,但双药联用无明显协同作用(P<0.05)。As2O3对PML/RARA融合基因表达抑制较同剂量ATRA强。结论 ATRA及As2O3均能下调PML/RARA融合基因。As2O3对PML/RARA融合基因的下调作用及对NB4细胞的增殖抑制均比同剂量的ATRA强。双药联用与单药干预,无叠加效应。

PML-RARa融合基因BCR3亚型急性早幼粒细胞白血病的临床研究

目的研究全反式维甲酸(ATRA)联合亚砷酸(ATO)治疗初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)的疗效。方法回顾性分析ATRA联合ATO诱导治疗+序贯巩固化疗+ATO/ATRA维持治疗,对初诊急性早幼粒细胞白血病患者的疗效。并比较在高危组与中低危组间,及不同PML-RARa融合基因亚型组间的疗效差异。结果高危组和中低危组的完全缓解率分别为70.0%和96.9%,差异无统计学意义(P=0.04),3年总生存率(OS)分别为(70.0±14.5)%,(96.9±3.1)%,差异有统计学意义(P=0.01);3年无病生存率(DFS)分别为(66.7%±19.2)%,(93.8±6.1)%,差异无统计学意义(P=0.08);PML-RARa融合基因BCR1亚型组与BCR3亚型组的完全缓解率分别为78.6%和95.6%,差异无统计学意义(P=0.14),3年OS率分别为(95.7±4.3)%,(78.6±11.0)%,差异无统计学意义(P=0.18);DFS率分别为(92.9±6.9)%,(87.5±11.7)%,差异无统计学意义(P=0.24)。结论 ATRA联合亚砷酸作为一线用药治疗初诊急性早幼粒细胞白血病,尤其对于BCR3亚型患者取得了非常好的疗效。

应用荧光原位杂交技术动态观察急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合基因的变化

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)技术在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断及疗效判断中的作用。方法:对初发的急性白血病患者行常规形态学、细胞化学染色,并采用FISH技术检测PMLRARα融合基因,流式细胞术分析白血病细胞的免疫表型,对治疗过程中患者PMLRARα融合基因阳性细胞比例进行动态观察。结果:FISH对标准的PML-RARα融合基因的检出与形态学和临床符合率为100%,对流式细胞学免疫表型不符合的APL诊断的1例作出了明确诊断,对累及17号染色体的附加染色体异常也有一定的提示作用,对APL治疗过程中分子生物学缓解的判断非常直观。结论:FISH技术检测PMLRARα融合基因,实验方法简便、快速、直观和准确,具备了用以确定白血病类型,指导临床治疗和进行治疗后的疗效监测的作用。

含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品的制备及应用

目的建立一个含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品,用于PML/RARαL型)的定量检测。方法从NB4细胞中提取总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板,设计PML/RARα(L型)与ABL基因特异性引物进行PCR,PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收、PCMV4载体克隆后转化DH5α工程菌,提取质粒进行酶切、测序鉴定,提取质粒用于制作荧光定量PCR标准曲线,同时对质粒的稳定性能进行评价。结果结果NB4细胞提取的总RNA完整性良好,构建的质粒经酶切鉴定后与目的条带一致,测序结果与目的片段几乎完全一致,且质粒的原始浓度为9×1012copies/ml,倍比稀释至9×104copies/ml,均能得到良好的标准曲线(R2≈1),且质粒的稳定性好,提示含PML/RARa(L型)与ABL双基因荧光定量PCR质粒标准品构建成功。结论本研究建立了制备含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品方法,并成功制备出稳定的含PML/RARα(L型)与ABL双基因质粒标准品。

实时定量RT-PCR检测PML-RARα融合基因诊断APL的临床价值

目的探讨一步法实时定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)技术在急性早幼粒细胞白血病(APL)患者诊断及微小残留病(MRD)检测中的临床价值。方法应用一步法RQ-RT-PCR、Taqman探针技术检测42例APL初诊患者和30例完全缓解(CR)患者骨髓PML-RARα融合基因的两种常见异构体转录本mRNA的表达。同时采用多参数流式细胞术(FCM)对部分患者骨髓MRD进行检测,并比较两种检测方法的一致性。结果①42例APL初诊患者的PML-RARα融合基因转录本中位标准拷贝数(NCN)为61%(13%～284%),其中L型34例,S型8例。L型和S型异构体中位NCN分别为56%(28%～278%)和70%(13%～284%),两者比较,P>0.05;②30例APL患者经标准诱导治疗CR后PML-RARα融合基因转录本中位NCN为4.00%(0.00%～8.26%);③一步法RQ-RT-PCR和FCM同时检测结果有较好的一致性(χ2=0.278,P=0.598),总符合率83.3%。结论一步法RQ-RT-PCR具有操作简便、特异性好、灵敏度高、结果可靠、直观等特点,有利于对APL的诊断和MRD检测。

PML/RARα融合基因检测早幼粒细胞白血病微小残留病

目的:PML/RARα融合基因在监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(MRD)中的意义。方法:诱导缓解及巩固维持治疗期间,采用筑巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测患者骨髓细胞中PML-RARα融合基因的变化。结果:长期随访的18例完全缓解(CR)患者,2例分子学复发。其中1例发生于CR1后4个月,诱导缓解治疗后获CR2,CR2后2个月再次分子学与血液学的复发,诱导治疗1个疗程获得CR3;1例发生于CR1后74个月,诱导缓解治疗后获得CR2,随访结束时生存期已达106个月。结论:在CR期定期监测PML-RARα融合基因,可尽早发现分子学复发,及时治疗可避免血液学复发。

PML/RARa融合基因监测急性早幼粒细胞白血病微小残留病的临床意义

目的:观察PML/RARa融合基因在监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(MRD)中的临床意义。方法:诱导缓解及巩固维持治疗期间,采用筑巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测患者骨髓细胞中PML-RARa融合基因的动态变化,PML-RARa融合基因。结果:长期随访的18例完全缓解(CR)患者,2例出现分子学复发。其中1例发生于CR1后后4个月,诱导缓解治疗后获得CR2, CR2后2个月再次出现分子学与血液学的复发,诱导治疗1个疗程获得CR3;1例发生于CR1后74个月,诱导缓解治疗后获得CR2,随访结束时生存期已达106个月。结论:在CR期定期监测PML-RARa融合基因,可早期发现分子学复发,及时干预治疗可避免血液学复发。

PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗诱导BALB／c小鼠的细胞和体液免疫应答

目的分析PML-RARα融合基因疫苗诱导小鼠特异体液和细胞免疫应答情况。方法用成功构建的重组质粒(pIRES-PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠后,分别利用ELISA法检测小鼠血清中INF-γ生成情况;LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL细胞针对APL细胞株NB4的杀伤率;用间接免疫荧光法检测血清中抗PML-RARα抗体。结果免疫后第7周时,小鼠血清中INF-γ含量、抗PML-RARα抗体及脾脏CTL细胞针对NB4的杀伤率均高于对照组。结论所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒可诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的检测

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因中的价值。方法对初诊的30例及20例疑似APL的患者进行FISH技术检测PML/RARα融合基因,对治疗过程中PML/RARα融合基因阳性细胞比例进行动态观察,进而协助诊断和指导治疗。结果30例APL中PML/RARα融合基因阳性率90%(27/30),1例AML1/ETO融合基因阳性,确诊为AML-M2;20例未确诊者中AML1/ETO融合基因阳性率15%(3/20),PML/RARα融合基因阳性率50%(10/20),其余7例未检测到以上两种融合基因。达到完全缓解(CR)后有7例融合基因阴性,随访至CR后2年,发现7例PML/RARα融合基因阳性比例较高患者分别于1～3个月后复发。结论FISH技术对APL的诊断具有高灵敏度和高准确度,并精确定位复杂核型中融合信号的位置,可用以确定白血病类型,指导临床治疗和进行治疗后的疗效监测。

检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的DNA传感器研制

利用共价键合法,将氨基修饰的具有急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因特异性的单链DNA探针固定在玻碳电极表面,构成急性早幼粒细胞白血病DNA传感器(急粒DNA传感器)。以电活性的芦荟大黄素(AE)为杂交指示剂,考察了杂交温度及传感器的特异性、重现性和检出限等性能。结果表明:AE在裸电极上的吸附常数为(4.5±0.2)×105L.mol-1,与单链DNA修饰的玻碳电极(ssDNA/GCE)和双链DNA修饰的玻碳电极(dsDNA/GCE)结合常数分别为(2.1±0.4)×105和(2.7±0.2)×105L.mol-1。这种新型的DNA传感器具有特异性强、灵敏度高和重现性好的优点。应用此方法于临床血清分析,初步探索了将该法应用于临床检测的可行性。

双色双融合荧光原位杂交检测成人急性白血病PML/RARα、MLL、AML1/ETO基因重排

目的探讨双色双融合荧光原位杂交技术(DC-DF-FISH)在成人急性白血病(Acute Leukemia,AL)中的应用价值。方法应用DC-DF-FISH检测我院26例AL患者相应的AML1/ETO、MLL、PML/RARa融合基因,并与常规R-显带技术进行比较。结果 26例AL患者中,R-显带发现4例存在标记染色体,检出率15.4%(4/26),17例为正常核型和其他异常核型,未检出包含11q23染色体异常,DC-DF-FISH检测发现8例特异目的基因为阳性,包括R-显带检测出的4例,检出阳性率30.8%(8/26)。结论双色双融合荧光原位杂交技术是检测成人急性白血病PML/RARα、MLL、AML1/ETO基因重排的可靠方法,适用于AL的诊断、疗效判定及微小残留病灶的检测。