堆型艾美尔球虫cSZ1基因在PMV361整合载体的构建

目的:构建PMV361-cSZ1载体,研制鸡球虫疫苗。方法:根据堆型艾美尔球虫基因序列,设计合成引物,扩增cSZ1基因,在pMD18-T Simple Vector表达后提取质粒,经过PCR鉴定和酶切鉴定。将cSZ1基因片段和PMV361载体由限制性内切酶PvuⅡ和ClaI双酶切后,进行DNA连接。结果:经PT-PCR扩增出cSZ1基因片段,大小为940bp,连接到整合表达载体PMV361中,成功构建PMV361-cSZ1的整合表达载体。结论:成功扩增了堆型艾美耳球虫cSZ1基因开放阅读框并构建了整合表达载体pMV361-cSZ1,为构建鸡球虫重组卡介疫苗内表达提供前期实验基础。

结核分枝杆菌PhoP/PhoR基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定

为构建结核杆菌PhoPR双组分系统PhoP、PhoR基因的重组穿梭质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR并对其进行鉴定。采用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株基因组DNA为模版,利用PCR技术分别扩增PhoP、PhoR基因编码序列,先克隆于T-Vector pMD19(Simple),再亚克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV361,并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取所得的阳性克隆子获得重组表达质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR,通过PCR及双酶切鉴定。结果显示,结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株基因组DNA中扩增出的PhoP、PhoR基因与GenBank公布的序列一致,经过PCR及双酶切鉴定,表明PhoP、PhoR基因均成功插入了pMV361穿梭载体。由此可知,成功构建了重组穿梭质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR,为进一步研究PhoPR双组分系统奠定了基础。

分泌表达人IL-12基因重组卡介苗菌株的构建和筛选

目的筛选获得分泌表达人白介素12(IL-12)的基因重组卡介苗菌株。方法采用PCR反应从pORF-hIL-12载体中扩增得到人IL-12基因的完整序列,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌(E.coli-BCG)穿梭载体pMV361中,构建含人IL-12基因的重组质粒rpMV-IL-12。将纯化的rpMV-IL-12电穿孔转化卡介苗(BCG),通过卡那霉素抗性筛选、基因组PCR方法进行初步鉴定,再经热休克诱导表达后,分别收集培养上清液和细菌沉淀,进行SDS-PAGE分析,筛选得到IL-12基因重组BCG(rBCG-12)。结果成功构建含人IL-12基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒rpMV-IL-12,测序结果与GenBank收录序列一致,未发生突变。rpMV-IL-12电穿孔转化BCG,经卡那霉素抗性筛选及基因组DNA的IL-12目的片段PCR扩增筛选得到rBCG-12重组菌。rBCG-12热休克诱导表达后的SDS-PAGE电泳,从培养上清液中检测到相对分子质量为70×103的蛋白质条带,而细菌沉淀中未见到特异性条带。结论分泌表达人IL-12蛋白的重组BCG菌株构建、筛选成功。

结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因重组穿梭质粒的构建及其在BCG中的融合与分泌表达研究

通过SOE法(重叠延伸,Genesplicingbyoverlapextension),扩增cfp10-esat6融合基因,与穿梭整合质粒pMV361构建成重组质粒。另将BCGα抗原(α-Ag)信号肽序列与上述重组质粒构建成另一重组质粒。将两种重组质粒分别导入BCG菌构建融合型重组卡介苗和分泌型重组卡介苗,热诱导后分析其表达产物。本研究成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合及分泌表达的重组BCG,为发展新型结核病疫苗打下了一定的基础。

结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA、Mpa基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定

目的构建结核杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统中Pup、Dop、PafA和Mpa基因的重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,并对其进行鉴定。方法提取结核杆菌国际标准强毒株H37Rv基因组DNA,以此为模板PCR扩增Pup、Dop、PafA和Mpa基因编码序列并测序。扩增产物克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361,并转化E.coli DH5α感受态细胞,利用PCR技术、双酶切技术及基因测序技术对构建的重组穿梭表达质粒进行鉴定。结果 PCR扩增的Pup、Dop、PafA和Mpa基因片段分别为213、1 683、1 377、和1 848bp,与预期长度一致;双酶切鉴定Pup、Dop、PafA和Mpa基因均成功插入穿梭表达质粒pMV361,测序显示插入穿梭表达质粒pMV361的Pup、Dop、PafA和Mpa基因序列与GenBank公布的序列一致。结论成功构建了重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,为进一步研究结核分枝杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统奠定了基础。