荧光定量PCR检测结核杆菌PncA基因突变研究

目的运用实时荧光定量PCR方法检测结核分支杆菌耐吡嗪酰胺(PZA)分离株PncA基因突变情况,从而探讨其水平与结核病的临床转归的相关性。方法用荧光定量PCR Taqman探针技术,以PncA基因片段设计引物,以突变发生率最高的47位(Thr→Ala)(PncA139)和85位(Leu→Pro)(PncA254)设计探针,10倍系列稀释含有目的基因的质粒,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线。并用于检测临床105份标本(TB-DNA>103)pncA基因突变表达量。结果①63例PncA139点突变表达量>102,占60%;②31例PncA254点突变表达量>102,占30%;③PncA139位突变表达量>103的患者同时也出现PncA254位突变表现,且TB-DNA表达量均>106;④PncA139位突变的高拷贝组与低拷贝组突变率比较χ2为50.44,85位点χ2为20.97,P值均<0.005,比较差异亦有明显统计意义。结论 TB-DNA高拷贝且PncA基因突变是临床结核病患者病情反复,以致迁延不愈的原因之一。

结核分枝杆菌耐砒嗪酰胺pncA基因突变的检测

目的了解青岛市结核分枝杆菌(MTB)耐砒嗪酰胺(PZA)分离株pncA基因的突变情况,探讨其与耐PZA之间的关系。方法应用BacT/ALERT 3D培养系统对25例MTB临床分离株进行常规培养和药敏检测,通过PCR扩增pncA全长基因,DNA序列分析检测pncA基因的突变情况。结果25株MTB临床分离株有22株扩增出含pncA全基因的序列,进行DNA序列分析表明有6例发生了pncA基因的突变,突变发生在pncA基因29、349、428、533、539、541位的核苷酸,并导致PZA酶氨基酸序列的改变。结论pncA基因突变是青岛市MTB临床分离株耐PZA的分子机制之一。

耐多药结核分枝杆菌pncA基因突变特征及与吡嗪酰胺耐药相关性研究

目的了解耐多药MTB的pncA基因突变特征及其与吡嗪酰胺（PZA）耐药之间的关系。方法收集2007-2009年深圳市耐多药MTB共127株，采用BACTECMGIT960系统检测其PZA耐药性，并用Wayne法检测吡嗪酰胺酶（PZase）活性；对pncA基因进行测序，分析其突变情况和分布特征，对PZA药物敏感性与PZase活性、pncA基因突变进行相关性分析。结果127株耐多药菌株中有62株对PZA耐药，耐药率为48．8％。耐PZA菌株中有55株PZase阴性。62株耐药株中有48株发生了pncA基因突变，突变率为77．4％，突变形式包括碱基置换（33株）、移码突变（12株）和整码突变（3株）。48株pncA突变的耐药菌株中，PZase阴性为45株。全部65株敏感株酶活性均为阳性，其中1株菌株发生了pncA基因突变（N11D）。pneA基因突变分析中发现了5个新的突变类型位点：H57P、P62Q、G108R、D110Y、G162V。耐多药菌株对PZA的敏感性与PZase活性（r=0．895，P〈0．05）、pncA基因突变（r=0．779，P〈0．05）存在相关。结论pncA基因突变类型多样，突变随机分布整个基因片段，发现了5个此前未曾报道过的新突变类型，所有突变主要分布于PZase活性位点和金属结合位点及其相邻区域上，且与PZA耐药存在较高相关性。

CT联合VEGF、PNCA检测在非小细胞肺癌预后中的价值

(1)目的研究CT联合PNCA、VEGF基因表达检测在非小细胞肺癌淋巴结转移以及预后中的诊断价值。(2)方法 68例非小细胞肺癌患者术前增强CT扫描,术后PCR检测肿瘤组织中PNCA、VEGF基因的相对表达,所有患者术后随访0.5年,分析CT与基因表达联合对纵膈淋巴结转移的诊断以及在评价非小细胞肺癌术后复发中的意义价值。(3)结果 PNCA、VEGF基因在纵膈转移淋巴结中的表达要高于非纵膈淋巴结转移中的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);术后随访0.5年中复发组PNCA、VEGF基因的表达要高于未复发组,差异具有统计学意义(P<0.05);在预测纵膈淋巴结转移方面,CT预测的敏感性和特异性分别为70.0%、81.5%,PNCA/VEGF预测的敏感性和特异性分别为83.3%、68.4%,CT联合基因检测预测的敏感性和特异性可达到86.7%、89.5%。(4)结论 PNCA、VEGF基因的高表达可能与纵膈淋巴结转移和术后复发有关,CT联合基因检测可以显著提高纵膈淋巴结转移的检出率,在预测非小细胞预后中有着重要的临床价值。

河南省结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA分析

目的了解河南地区结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）分离株pncA基因突变情况，探讨与耐PZA之间的关系。方法对41例结核分枝杆菌临床分离株进行常规培养和药敏检测，采用聚合酶链反应-测序技术检测pncA基因的突变。结果有68．29％（28／41）的耐药菌株PncA发生突变从而改变了吡嗪酰胺酶氨基酸序列的一级结构。28株临床分离突变株涵盖碱基替代、插入突变和缺失突变等类型。突变分布在pncA基因整个序列，位于开读框架的3～535位的核苷酸。结论河南地区结核分枝杆菌耐PZA主要机制之一为pncA基因突变。

结核菌耐药pncA和embB基因突变与临床治疗的研究

目的 分别了解结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺和乙胺丁醇的pncA和embB基因突变情况 ,研究其治疗对策。方法 通过传统药敏实验和聚合酶链反应 (PCR)一单链构象多态性 (SSCP)技术初步鉴定 10 6株临床分离株的药敏和embB、pncA基因。结果 与结核菌标准株H3 7RV对照分析 94例TB菌耐吡嗪酰胺 (PZA)的pncA基因突变率为 44 69%( 4 2 / 94) ,分析 83例耐乙胺丁醇 (EMB)的embB基因突变率为 5 4 2 %( 4 5 / 83 ) ,两种基因同时突变率为 11 8%( 11/ 94) ,其中embB基因均在传统药敏的高耐药区域。根据上述分析建立的个体化化疗方案治疗 ,痰菌转阴率为 65 9%( 62 / 94) ,病灶治疗有效率为 69 1%( 65 / 94) ,空洞治疗有效率为 5 6 4%( 5 3 / 94)。结论 临床部分结核分枝杆菌耐EMB和PZA是由于其embB、pncA基因突变所致 ,临床根据传统药敏的高、低耐药浓度和基因突变的情况制定的治疗方针 。

河南省耐多药结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药性分析及其与耐药相关基因pncA突变的关系

目的评价耐药相关基因pncA突变检测河南省耐多药结核病患者吡嗪酰胺耐药性的效果。方法收集2018年1月至12月于河南省10个结核病耐药监测地区就诊的152例耐多药结核病患者的痰标本。对患者进行问卷调查,收集年龄、性别、治疗史、痰培养等信息。最终将问卷及菌株标本送至河南省疾病预防控制中心进行后续研究。采用结核分枝杆菌液体培养进行吡嗪酰胺药物敏感试验。采用聚合酶链反应和基因测序鉴定pncA的突变情况,并与标准菌株H37Rv的序列进行比较。分析吡嗪酰胺耐药表型与抗结核治疗效果的相关性。统计学分析采用χ^(2)检验和独立样本t检验。结果152株耐多药结核分枝杆菌菌株中,105株为吡嗪酰胺表型耐药菌株。对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素全部耐药的菌株,以及准广泛耐药菌株和广泛耐药菌株对吡嗪酰胺的耐药率均较高,分别为80.39%(82/102)、81.13%(43/53)和92.59%(25/27)。102株菌株的pncA基因发生突变。以表型药物敏感试验结果为参照,pncA基因突变检测吡嗪酰胺耐药性的灵敏度为89.52%(95%可信区间81.64%~94.39%),特异度为89.36%(95%可信区间76.10%~96.01%)。共存在100种不同类型的pncA突变,包括80种点突变和20种插入或缺失突变,其中有13株菌株存在多个位点突变。7株菌株pncA启动子发生突变,分别为-7G插入突变、-11T到C点突变和-12A到G点突变,3组菌株中pncA mRNA相对表达量分别为0.21±0.05、0.31±0.08和0.33±0.03,均低于标准株H37Rv(设置其pncA mRNA表达量为1.00),差异均有统计学意义(t=4.57、2.43、3.65,均P<0.05)。治疗后不同时间段吡嗪酰胺耐药患者和敏感患者的痰菌阴转率差异有统计学意义(χ^(2)=10.01,P=0.02),其中吡嗪酰胺耐药患者治疗6个月末的阴转率为1.08%(1/93),而吡嗪酰胺敏感患者为7.14%(3/42)。结论耐多药结核分枝杆菌呲嗪酰胺耐药与pncA基因突变相关,该突变散在分布且具有多样性。吡嗪酰胺耐药患者的痰菌阴转时间可能延长。

耐多药结核分枝杆菌吡嗪酰胺药物敏感性及pnc A突变情况

目的通过鉴定耐多药(multidrug-resistant,MDR)结核分枝杆菌中吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)耐药的表型和基因型特性,为制定合适的治疗方案提供实验室依据。方法采用液体培养对耐多药结核分枝杆菌进行PZA药物敏感性测定。通过测序鉴定pncA的突变情况,并与标准菌株H37Rv的序列进行比较。结果75株耐多药结核菌中,52株(69.33%)为PZA表型耐药菌株。80.76%的准广泛耐药(pre-extensive drug resistant,pre-XDR)菌株、92.31%的广泛耐药(extensive drug resistant,XDR)菌株以及84.61%的对四种一线药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素)耐药的菌株发生了PZA耐药。在PZA耐药菌株中45株(45/52,86.53%)的pncA基因发生了突变。在这些MDR菌株共存在40种不同类型的pncA的突变,包括33个点突变和7个插入缺失突变。在这些突变类型中,有17个为新发现位点。结论对四种一线药物全部耐药的菌株,准广泛耐药菌株和广泛耐药菌株的PZA具有较高耐药率。大多数PZA耐药与pncA相关,该突变散在分布且具有多样性。

牛结核分枝杆菌与结核分枝杆菌鉴别方法的研究现状

结核分枝杆菌复合群（MTBC）中的人结核和牛结核分枝杆菌是目前结核病的主要致病菌.人结核和牛结核分枝杆菌在基因组水平的同源性超过99％[1],临床无法区分,但两者所致的结核病需要采用不同的治疗方案.牛结核分枝杆菌由于pncA基因上的突变导致对吡嗪酰胺（PZA）天然耐药,

结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段;通过pET28a构建表达载体pET28a-pncA,序列测定证实正确后转化大肠埃希菌DH10b,经IPTG诱导表达His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白。结果扩增出结核分枝杆菌pncA基因并构建了具有正确基因序列的质粒载体pET28a-pncA,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了分子质量单位约20ku的表达产物,并得到纯化的带His标签的目的蛋白。结论构建了结核分枝杆菌pncA基因原核表达质粒,并诱导表达了His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。

结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶-GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX4T-1构建表达载体pGEX4T-pncA,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH10b,再经IPTG诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-吡嗪酰胺酶融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌pncA基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-pncA,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。

结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法的研究进展

吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)是重要的一线抗结核药物,与异烟肼、利福平和乙胺丁醇构成治疗方案的核心。因其疗效较好,被广泛应用于结核病的治疗过程。然而,近年来随着耐多药结核病的出现,PZA耐药导致部分患者治疗失败,因此常规开展PZA药物敏感性试验对于减少耐药性的发生显得极为重要。由于PZA在酸性条件下才能发挥作用,而结核分枝杆菌在酸性环境下生长不良,故PZA耐药性检测一直是临床中的难题。本文结合国内外最新研究进展,就结核分枝杆菌PZA耐药性检测方法的研究进行阐述,期望能为更有效地诊治结核病提供新思路。