新型纳米转染试剂转染PNP自杀基因体外杀伤实验

将壳聚糖纳米粒包裹的报告基因pEGFP-N1质粒转染至HEK293细胞,并在HEK293细胞中成功表达荧光蛋白的基础上,进一步将本室自行构建的PNP基因的真核高效表达载体质粒pcDNA3-PNP转染至HEK293细胞。转染72h后,对转染的HEK293细胞给予前体药6-MPDR至终浓度40μg/ml,一天后,采用MTT比色法测定药物对细胞增值的影响,并进行统计学处理。实验结果表明采用壳聚糖纳米粒转染试剂转染并给予前体药6-MPDR的实验组活细胞数,与用壳聚糖转染但不给前体药6-MPDR的对照组活细胞数相比,有显著差异(P<0.05),说明新筛选出的壳聚糖纳米粒转染试剂可以将PNP自杀基因递送至靶细胞中,并在细胞中进行表达,从而使PNP/6-MPDR自杀基因系统发挥杀伤细胞的作用。分别采用相同工作浓度的脂质体与壳聚糖纳米粒转染试剂转染相同浓度的基因质粒,壳聚糖纳米粒对靶细胞生长数量影响很小,说明的壳聚糖纳米粒细胞毒性大大低于阳离子脂质体的细胞毒性。

AF0.3启动子调控的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异杀伤作用

背景与目的:甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)启动子调控下的目的基因能在AFP阳性肝癌组织中特异性表达;嘌呤核苷磷酸化酶(Escherichiacolipurinenucleosidephosphorylase,PNP)/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷(6-methylpurine-2-deoxyriboside,MeP-dR)自杀基因系统具有强杀瘤效应。本研究旨在探讨AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法:构建甲胎蛋白启动子AF0.3调控下PNP基因表达载体pAF0.3/PNP,导入AFP阳性肝癌细胞HepG2和阴性的肝癌细胞株SMMC7721,利用G418筛选获得稳定转染PNP基因的HepG2/0.3-PNP及SMMC7721/0.3-PNP细胞。RT-PCR检测二者在细胞中的表达。台盼蓝拒染法检测细胞增殖效应,MTT法和流式细胞仪检测两株细胞对MeP-dR的敏感性及旁观者效应,高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)检测PNP基因产物活性。结果:不论有氧还是缺氧条件,HepG2/0.3-PNP对MeP-dR均较为敏感,SMMC7721/0.3-PNP则对MeP-dR完全不敏感。在任何一种条件下,HepG2/AF0.3-PNP在混合细胞中比例达25%后,就可致明显旁观者效应;而在同样条件下,SMMC7721/0.3-PNP不导致明显的旁观者效应。HPLC结果显示,pAF0.3/PNP在HepG2细胞中可以将MeP-dR转化为6-MP,但其在SMMC7721中则不具有转化活性。结论:AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性HepG2细胞有较好的杀伤作用。

PNP/MeP-dR系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的探讨新型嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷(PNP/MeP-dR)自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用。方法构建PNP基因真核表达载体pcDNA3.0/PNP,脂质体介导法将其导入HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定转染PNP基因的细胞株HepG2/PNP。采用台盼蓝拒染法测绘细胞生长曲线,MTT法和FCM检测细胞对MeP-dR的敏感性及旁观者效应,HPLC检测PNP酶活性。结果HepG2/PNP细胞对MeP-dR十分敏感,作用4d后MeP-dR对HepG2/PNP的IC50为4.5μmol/L,而100μmol/L的MeP-dR即可最大限度地杀死HepG2/PNP细胞。100μmol/L MeP-dR作用8d后,混合细胞中HepG2/PNP比例仅占5%即可导致所有细胞死亡。HPLC结果显示,PNP基因产物能够将MeP-dR转化为6-MP。结论PNP/MeP-dR系统对肝癌细胞的杀瘤效果明显优于传统的自杀基因系统。本研究为该系统应用于肝癌体内治疗打下基础。

热诱导肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定

目的检测已构建热反应元件修饰的端粒酶逆转录酶hTERT基因启动子(8HSEs-hTERTp)调控的基因表达载体肿瘤特异性和热诱导特性。方法①RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测细胞内hTERT mRNA和蛋白表达水平,选择hTERT高表达和低表达的细胞株作为该研究阳性细胞株和阴性细胞株;②收集前期已包装成功的热反应元件8HSEs和人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp联合调控自杀基因PNP表达的慢病毒表达载体8HhP病毒液,感染hTERT+SW480细胞及hTERT-MKN28细胞、hTERT-MRC-5细胞,细胞免疫荧光技术检测该治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性;并用Western blot和RT-PCR分别检测热刺激条件下目的基因PNP在不同hTERT水平细胞株中的表达水平。结果 hTERT mRNA及蛋白在SW480细胞中高表达,在MKN28细胞和MRC-5细胞中低表达甚至阴性表达;免疫荧光、RT-PCR和Western blot结果显示,8HSEs-hTERTp调控的目的基因PNP只有在43℃处理下的SW480细胞中呈现高表达,而在阴性细胞株MKN28和MRC-5中PNP表达较少,而常温下SW480细胞中PNP的表达水平明显低于热处理组。结论 8HSEs修饰的hTERT启动子可以明显提高治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性。