乳腺癌细胞中PNRC基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的研究乳腺癌细胞中富含脯氨酸核受体辅活化子(proline-rich nuclear receptor coactivator protein,PNRC)基因启动子CpG岛的甲基化状态及在PNRC转录调节中的作用。方法应用PT-PCR检测PNRC基因在正常乳腺细胞与乳腺癌细胞中的表达情况,并运用"MethPrimer"软件对PNRC启动子区进行分析,预测CpG岛,通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测PNRC启动子区CpG岛的甲基化状况;PT-PCR及Northern杂交检测乳腺癌细胞经甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dc)作用后,PNRC基因mRNA的表达情况;Westernblot检测5-Aza-dc干预对PNRC蛋白表达的影响;将含PNRC启动子序列的报告质粒转染乳腺癌细胞,再经5-Aza-dc处理后,检测PNRC基因启动子的活性。结果PNRC基因在乳腺癌细胞中的表达较正常乳腺细胞明显降低;乳腺癌细胞PNRC基因启动子区存在CpG岛甲基化;乳腺癌细胞经5-Aza-dc处理后,PNRC基因mRNA及蛋白表达水平显著增加,其PNRC基因启动子的活性也明显增强。结论PNRC基因启动子区的高甲基化导致PNRC在乳腺癌细胞中表达降低。

核受体辅活化子PNRC与孤儿核受体SF1相互作用位点的鉴定

为了阐明核受体辅活化子 (proline richnuclearreceptorcoactivatorprotein ,PNRC)在孤儿核受体类固醇生成因子 1(steroidogenicfactor1,SF1)基因表达调控中的作用 ,采用酵母双杂合分析、缺失突变技术和瞬时转染等研究方法鉴定了PNRC与SF1的相互作用位点 .结果显示 ,PNRC中氨基酸 2 78～ 30 0区域是与SF1相互作用的位点 .该区域富含脯氨酸 ,其中有 1个SH3结合模体 (motif) ,单独的SH3模体不足以与SF1产生有效的相互作用 .瞬时转染分析表明 ,PNRC 2 70 32 7对野生型PNRC的辅激活功能具有负显性抑制效应 .研究结果表明 ,含SH3结合模体的PNRC 2 78 30

人PNRC基因启动子的初步鉴定

PNRC(proline-rich nuclear receptor coactivator)是最近发现的一种新的核受体辅活化子,它是以牛类固醇生成因子-1(SF1)作诱饵,利用酵母双杂系统从人乳腺cDNA表达文库中筛选得到的.为了研究人PNRC基因的表达调控机制,在对人PNRC基因的生物信息分析的基础上,采用5′RACE法确定了PNRC基因的转录起始位点,克隆了人PNRC基因的5′侧翼区,并对该区进行功能分析.分别构建了11种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒,将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果发现,PNRC的5′侧翼区的-323^+27、-323^+57、-123^+57、-123^+27区域的启动子活性显著升高,其中-323^+27区域的启动子活性最高.研究表明,人PNRC基因启动子的最小区域位于PNRC的5′侧翼区的-123^+27区域.

过表达PNRC对MCF-7乳腺癌细胞生长的影响

目的:探讨核受体辅活化子(coactivator)PNRC(proline-rich nuclear receptor coregulatory protein)对乳腺癌细胞生长的影响。方法:以pACT2/PNRC为模板,采用PCR扩增全长PNRC编码序列,将BclI和XhoI消化的PCR产物插入pCMVtaq2c,构建pCMVtaq2c/PNRC真核表达质粒。酶切和测序鉴定后,采用脂质体转染法,分别将pCMVtaq2c/PNRC表达质粒和pCMVtaq2c空质粒转染MCF-7细胞,经G418筛选4周后,分别采用RT-PCR、Northernblot和WesternBlot鉴定稳定表达PNRC的MCF-7细胞株。最后,采用MTT法和3H-胸腺嘧啶掺入法观察了过表达PNRC的MCF-7乳腺癌细胞和pCMVtaq2c空质粒转染的MCF-7乳腺癌细胞生长速率和增殖的差异。结果:成功构建了PNRC的真核表达质粒pCMVtaq2c/PNRC,并筛选到稳定表达PNRC的MCF-7乳腺癌细胞株,转染PNRC的MCF-7细胞的生长速率和增殖明显慢于对照组细胞。结论:过表达的PNRC对MCF-7乳腺癌细胞的生长具有抑制作用。

PNRC多肽通过影响Ras信号途径抑制BT-474细胞的增殖

背景与目的:根据富含脯氨酸的核受体辅调节蛋白(proline-rich nuclear receptor coregulatory protein,PNRC)与Grb2相互作用位点资料和其他基于干扰Grb2/SH3与SOS的相互作用的富含脯氨酸短肽的设计原则,我们设计、合成了基于PNRC的抗Ras、PTD融合多肽(PTD-PARP),研究该多肽在BT474乳腺癌细胞中对Ras信号途径的影响及其抗肿瘤增殖活性。方法:用多肽合成仪合成PNRC的抗Ras PTD融合多肽PTD-PARP和其单独的PTD多肽。以PTD多肽为对照,将增加浓度的PTD-PARP与分离的、EGF刺激的BT474细胞裂解物共温育,采用免疫共沉淀结合Western blot检测Grb2免疫共沉淀复合物中SOS和PNRC的含量情况。用PTD-PARP-琼脂糖凝胶4B活化偶联磁珠免疫共沉淀BT474细胞裂解物,采用PI3K,Nck和Grb2的抗体检测沉淀复合物中这些含SH3结构域的蛋白与PTD-PARP的结合能力。Western blot检测PTD-PARP对EGF刺激的BT474细胞内Ras和MAPK活化的影响。采用软琼脂克隆形成实验考察PTD-PARP对BT474细胞体外增殖的影响。结果:PTD-PARP能以剂量依赖方式抑制SOS、PNRC与Grb2的结合,它与Grb2的结合具有特异性,PTD-PARP能降低BT474细胞中EGF刺激的Ras和MAKP活化,并能显著抑制BT474细胞的体外软琼脂克隆形成。结论:PNRC抗Ras PTD融合多肽可通过影响Ras信号途径抑制乳腺癌细胞的增殖。

核受体辅活化子PNRC与孤儿核受体SF1的相互作用有赖于SF1的AF-2功能结构域

核受体辅活化子PNRC(proline richnuclearreceptorcoregulatoryprotein ,富含脯氨酸的核受体辅调节蛋白 )可通过含SH3结合模体的PNRC2 78 30 0区域与孤儿核受体类固醇生成因子 1(steroido genicfactor 1,SF1)相互作用 .激活功能 2 (activationfunction 2 ,AF 2 )结构域在核受体配体依赖性转录激活中发挥了重要作用 ,为探讨AF 2结构域在SF1转录激活中的作用机制 ,采用酵母双杂合分析、缺失突变技术和瞬时转染等研究方法考察了AF 2结构域对SF1反式激活功能及SF1与PNRC相互作用的影响 .SF1的反式激活功能有赖于AF 2结构域 ,其机制是SF1AF 2结构域的突变严重影响了SF1与PNRC的有效相互作用 ,并消除了PNRC对SF1反式激活功能的辅激活作用 .结果表明 ,SF1与PNRC的相互作用有赖于AF

PNRC在不同发育时期大鼠组织中的表达及其在人乳腺癌和相应癌旁组织中的表达差异

目的:探索核受体辅活化子(coactivator)PNRC(proline-rich Nuclear receptor coregulatory protein)在不同发育时期正常大鼠各种组织中的表达与其生理作用的关系;PNRC在人乳腺癌和相应癌旁组织中的表达与乳腺癌的关系。方法:以β-actin基因为参照,应用半定量RT-PCR和southern印迹技术,检测不同发育时期正常大鼠各种组织中PNRC的表达水平及其在人乳腺癌和癌旁组织中的表达。结果:PNRC在正常大鼠和胎鼠相应组织中广泛表达且无组织差异性(P>0.05);在成年大鼠各种组织中的表达明显高于胎鼠相应组织(P<0.01)。PNRC在人乳腺癌中的表达水平明显低于相应癌旁组织(P<0.01)。结论:PNRC是一种必需的、广泛表达的转录调节因子,它可能参与了机体多种正常组织的发育过程;在人乳腺癌和癌旁组织中的表达差异与它在乳腺癌发生中的潜在作用密切相关。

NFY和RFX1对人PNRC启动子的调控作用

探讨核因子Y(nuclear factor Y,NFY)和调节因子X1(regulatory factors that bind to the X box,RFX1)对人PNRC(proline-rich nuclear receptor coactivator)基因的调控作用及机制.根据凝胶电泳迁移率变化实验,分析NFY和RFX1与PNRC启动子区域的结合.将含有NFY和RFX1的真核表达质粒(pCMV-NFY,pCMV-RFX1)和含有PNRC启动子的荧光素酶报告基因质粒共转染HepG2细胞,检测转染细胞的荧光素酶活性,并用RT-PCR和Western印迹检测PNRC的表达情况.Quick-Change法对PNRC启动子区NFY和RFX1结合位点进行突变,将包含突变点的重组荧光素酶报告质粒与含有NFY和RFX1的真核表达质粒共同转染HepG2细胞,检测各组荧光素酶活性.结果发现,NFY和RFX1能与PNRC启动子区域特异性结合;转染pCMV-NFY和pCMV-RFX1可抑制PNRC启动子活性并下调PNRC在HepG2细胞中的表达;包含NFY和RFX1结合位点的突变质粒与pCMV-NFY和pCMV-RFX1共转染后,NFY和RFX1对PNRC启动子活性的抑制作用消失.以上结果提示,NFY和RFX1能调控PNRC基因的表达,其机制是与PNRC启动子区域的特异性结合位点相结合,发挥其反式抑制作用.

PNRC多肽通过干扰核受体途径抑制BT474细胞的增殖

目的:运用核受体辅活化子PNRC的抗RasPTD融合多肽(PTD-PARP)研究其在乳腺癌细胞BT474中的分布、对核受体信号传导途径的影响及其抗肿瘤细胞增殖活性。方法:用多肽合成仪合成PTD-PARP、单独的PARP和PTD多肽以及FITC标记的PTD-PARP、PARP。HPLC分析和纯化后,荧光显微镜结合流式细胞仪检测PTD-PARP、PARP在BT474细胞中的分布。虫荧光素酶报告基因检测PTD-PARP对野生型PNRC辅活化ER反式激活功能的影响。MTS、软琼脂克隆形成实验检测PTD-PARP对BT474细胞的抗增殖活性。结果:PTD-PARP能进入BT474细胞,抑制野生型PNRC辅活化ER的反式激活功能并抑制BT474细胞的增殖。结论:PNRC抗RasP DT融合多肽可通过干扰核受体途径抑制乳腺癌细胞的增殖。

PNRC1剪接变异体的鉴定及其在辅激活核受体介导基因转录功能上的比较

为分析富含脯氨酸核受体辅调节蛋白1(PNRC1)选择性剪接,及比较PNRC1剪接变异体在辅激活核受体介导基因转录功能上的差异,在生物信息学方法分析PNRC1剪接变异体的基础上,设计一定的特异性引物,采用RT-PCR结合克隆测序的方法对这些剪接变异体进行验证.利用酵母双杂交和荧光素酶报告系统实验,分析它们与核受体的相互作用及比较它们在辅激活核受体介导基因转录功能上的差异.结果显示,生物信息学预测的几个剪接变异体真实存在于人的组织和细胞系中,这些剪接变异体在与雌激素受体α(ERα)、类固醇衍生因子1(SF1)等核受体的相互作用的强度及辅激活核受体介导基因转录功能上存在较大的差异.研究提示,PNRC1这些剪接变异体在体内可能发挥不同的功能.

猪PNRC2基因的电子克隆和验证

为了研究猪PNRC2基因的电子克隆,试验通过抑制差减杂交获得了猪PNRC2基因的EST序列,利用生物信息学方法进行电子克隆,并设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪PNRC2基因cDNA序列,将其连接到pMD-19T载体上并转化DH5α后测序,得到猪PNRC2基因序列(GenBank登录号为GQ913658)。结果表明:PNRC2基因cDNA大小为750 bp,最大开放式阅读框(ORF)位于68～487位,编码139个氨基酸,其中脯氨酸占8.6%;猪PNRC2基因的氨基酸序列与牛、人、小鼠和大鼠的相似性分别为97%、94%、82%、82%,其中重要的SH3结合域和NR盒状序列与四者完全一致,其蛋白质预测分子式为C687H1081N207O207S4,属于不稳定蛋白。

基于PNRC的抗Ras PDT融合多肽通过影响核受体途径抑制MCF-7细胞的增殖

目的研究设计、合成的基于富含脯氨酸核受体辅活化子(proline-rich nuclear receptor coactivator protein,PNRC)的抗RasPDT融合多肽(PDT-PARP)在MCF-7乳腺癌细胞中的定位、对核受体信号传导途径的影响及其抗肿瘤细胞增殖活性。方法用多肽合成仪合成PNRC的抗RasPDT融合多肽PDT-PARP、不含PDT的PARP、单独的PDT多肽以及FITC标记的PDT-PARP、PARP,HPLC分析和纯化后,荧光显微镜下观察PDT-PARP、PARP在MCF-7细胞中的分布情况,流式细胞仪做定量分析。虫荧光素酶报告基因检测PDT-PARP对野生型PNRC辅活化ER反式激活功能的影响。MTS检测PDT-PARP对MCF-7细胞的抗增殖活性。结果PDT-PARP能进入MCF-7细胞;该多肽能抑制野生型PNRC对ER反式激活功能的辅活化作用,并对MCF-7细胞的增殖具有一定的抑制作用。结论PNRC抗RasPDT融合多肽可通过影响核受体途径抑制乳腺癌细胞的增殖。

核受体辅活化子的家族新成员——PNRC

富含脯氨酸的核受体辅调节蛋白(proline-rich nuclear receptor coregulatory protein,PNRC)是一种普遍存在的核受体辅活化子,它能以配体依赖和非依赖方式与多种核受体相互作用并增强它们介导的转录激活。此外,它还能与Grb2和RNApol Ⅲ的RPC39亚基相互作用,参与生长因子/Ras信号通路和RNApol Ⅲ转录的调节。其在乳腺癌和癌旁正常组织中的表达差异使其有望成为治疗乳腺癌的新靶点。

核受体及核受体辅活化子对芳香族化酶基因转录调控的研究

目的 研究核受体及核受体辅活化子对芳香族化酶基因转录的调控。方法 酵母单、双杂合筛选、蛋白质 蛋白质相互作用分析、DNA突变、报告基因转染功能分析、迁移率改变及足迹分析等技术。结果 ①鉴定了主导芳香族化酶基因在乳腺癌细胞中表达的启动子I.3和启动子Ⅱ的确切位置以及对这两个启动子起调节作用的沉默子 (Silencer)S1和cAMP效应要素 (CREaro)等顺式作用元件。②分离鉴定了能与类固醇衍生因子 1 (SterodogenicFactor1 ,SF1 )相互作用并参与芳香族化酶基因转录调控的转录因子 ,其中近 5 0 %的克隆编码两种新的富含脯氨酸的核受体辅调节蛋白质 ,命名为PNRC(Proline richNuclearReceptorCoactivators)。功能分析显示PNRC通过与SF1或ERR1相互作用 ,进一步增强SF1或ERR1对芳香族化酶基因启动子 1 .3的转录激活作用。③缺失突变及定点突变分析证明含SH3结合模体的 2 3个氨基酸残基区域是PNRC分子与核受体的相互作用位点。结论 我们鉴定了主导芳香族化酶基因在乳腺癌细胞中表达的启动子及调控序列 ,克隆了与DNA调控序列结合的蛋白质和通过蛋白质相互作用参与芳香族化酶基因转录调控的转录因子———一种新型的核受体辅活化子PNRC。

ERR1与核受体辅活化子相互作用位点研究

目的 分析ERR1与核受体辅活化子相互作用的位点。方法 用常规PCR方法和重叠延伸PCR构建ERR1的各种突变体到表达质粒pGBT9上 ,通过酵母双杂交实验分析其与已知核受体辅活化子PNRC的相互作用。结果 成功构建了ERR1的缺失突变体pGBT9 ERR11 412、pGBT9 ERR11 14 4、pGBT9 ERR1190 412、pGBT9 ERR114 5 42 3、pGBT9 ERR1190 42 3、pGBT9 ERR1190 42 3F2 3 2A、pGBT9 ERR1190 42 3K2 44A。酵母双杂交实验显示ERR1的氨基酸 14 5 42 3和 190 42 3可分别与PNRC相互作用 ;ERR1190 42 3K2 44A与PNRC的相互作用明显低于ERR1190 42 3 ;其它突变体与PNRC的相互作用未检测到。结论 ERR1与核受体辅活化子相互作用的位点位于ERR1的配体结合结构域 (LBD ,aa190 42 3 ) ,ERR1与核受体辅活化子相互作用依赖于其LBD的AF2结构域 ,AF2结构域外的其它氨基酸F2 3 2、K2 44也对ERR1与核受体辅活化子相互作用起关键作用。