HIV—Pol基因的套式PCR检测

根据ＨＩＶ—１ ＭＮ株Ｐｏｌ基因序列设计了套式聚合酶链反应（Ｎｅｓｔｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｎＰＣＲ）引物，将外周血单核细胞ＤＮＡ粗提物先以一对外侧引物扩增，其产物再以一对内侧引物扩增，两次扩增后的产物直接经电泳判定结果。ｎＰＣＲ在保持常规ＰＣＲ特异性的同时，其敏感性较单对引物ＰＣＲ高１００倍以上，可检出约１０个分子的目的基因片段。探讨了ＨＩＶ—１ Ｐｏｌ基因套式ＰＣＲ检测在ＨＩＶ—１感染的早期诊断、感染确认及病毒分离中的应用，表明本方法是一种敏感性及特异性俱佳，结果判断简单的基因检测技术，有应用前景。

靶向pol基因siRNA抑制J亚型禽白血病病毒复制的研究

为筛选能够有效抑制J亚型禽白血病病毒(ALV-J)复制的siRNA,本研究根据ALV的pol基因保守序列设计合成5对shRNA序列,并将其分别克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体中,构建siRNA表达重组质粒,分别为pcDNA-sh-pol711、pcDNA-sh-pol814、pcDNA-sh-pol1016、pcDNA-sh-pol1915和pcDNA-sh-pol2516。将重组质粒分别转染DF-1细胞6h后,以100TCID50的ALV-J感染细胞,并利用IFA、westernblot和real-timePCR方法评价其对ALV-J复制的抑制效果。IFA和westernblot检测结果表明:其中pcDNA-sh-pol711、pcDNA-sh-pol814和pcDNA-sh-pol2516可以有效抑制病毒囊膜蛋白的表达。Real-timePCR结果显示:与阴性对照和空载体对照相比,这3种siRNA在mRNA水平对ALV-J的抑制率达29%～86%。本研究在细胞水平上筛选的siRNAs可作为候选siRNAs,为抗鸡ALV-J的研究奠定基础。

内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株pol基因的克隆与序列分析

参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株pol基因序列设计了2对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的pol基因片段,将其克隆到PMD19-T载体后测序。应用计算机软件将测定序列与内源性南非代表毒株enJS56A1(AF153615)的pol基因序列比较,核苷酸同源性为99.3%,推导出的氨基酸同源性为95.0%。与外源性南非代表株JSRV-SA(M80216)的pol基因序列比较,核苷酸同源性为99.0%,氨基酸同源性为99.3%。这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒pol基因序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。

一株猴泡沫病毒野毒Pol基因的cDNA的直接测序

本研究对一株来源于医学灵长类中心 (CentreforMedicalPrimates)大笼饲养的恒河猴的原代猴肾细胞 (RhesusMonkeykidney ,RMK) ,377细胞株 ,经细胞培养三周后 ,具有典型泡沫样病变 ,即CPE( + )的细胞 ,进行Pol基因 ( 5898- 6362 )的cDNA的Nested -PCR扩增 ,对产物位置 5898- 6343区域进行直接测序。结果证明 :该株细胞所带的SFV与GENEBANK中的SFV - 1在该区域有 48个核苷酸存在差异 ( 1 0 .78% ) ,与SFVmac在该区域有 45个核苷酸存在差异 ( 1 0 .1 1 % )。VspⅠ酶切实验结果与之吻合 ,显示出该前病毒株的PCR产物与SFV - 1在该片段的第 69核苷酸有变异 ,碱基由T→A。

猴泡沫病毒SFV-1前病毒pol基因克隆及序列分析

采用nested-PCR从猕猴肾组织细胞中获得同源性较高、具有高度保守序列的、长度为465bp大小的猴泡沫病毒SFV-1的pol基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,并对其进行序列分析,分析结果表明所克隆的基因片断为猴泡沫病毒SFV-1pol基因片段,与文献中已发表的来源于灵长类动物SFV-1、SFV-1A、SFV-1B、SFV-2、SFV-mac、SFVkm的pol基因核苷酸序列进行比对,显示SFVkm1与上述病毒pol基因核苷酸同源性分别为91.06%、90.59%、90.82%、90.21%、89.41%、91.53%。对pol基因克隆和序列分析是了解和掌握SFV病毒分子流行病学及其变异趋势的重要手段,7种不同基因型的泡沫病毒的系统进化树分析显示了SFVkm1与它们之间的相互联系。

鸡网状内皮细胞增生症病毒分离株的鉴定及pol基因序列分析

为了鉴定一株从疑似鸡网状内皮细胞增生症病毒(REV)感染发病鸡的腺胃乳头、肝脏、脾脏等病料组织中培养分离获得的病毒(GR01),试验采用PCR、REV地高辛核酸标记探针等技术对该病毒及其pol基因核苷酸序列与NCBI登录的参考毒株的相似性进行了研究。结果表明:GR01分离株基因序列长度为723 bp,与HA1101、ZD0708、MD-2、HLJR0901、1105、HA9901、GD1210和SNV毒株的核苷酸序列相似性为97.0%~100%;推导氨基酸序列相似性为98.7%~100%。说明GR01与HA1101、ZD0708、MD-2、HLJR0901和1105参考株在进化树上属于同一类群。

东北虎源猫免疫缺陷病毒pol基因遗传进化分析

为了解中国东北虎源猫免疫缺陷病毒(FIV)的感染情况,采集海林市横道河子东北虎林园东北虎全血样本50份,通过套式PCR对样本进行FIV pol基因扩增,并对阳性样本进行测序,再运用生物信息学软件进行遗传进化分析。结果检测出1只虎为FIV阳性,其pol基因与参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为70.0%~99.8%和75.0%~99.4%,且存在39个氨基酸突变位点,系统发育树显示其与A亚型猫源FIV CHN17毒株亲缘关系最近。这是中国首次从东北虎体内检测到FIV,表明对中国大型猫科动物进行FIV的监测的必要性,同时应该注意对圈养老虎栖息地周围流浪猫的管理。

克拉玛依市HIV-1 env gag pol基因特征变异研究

目的研究克拉玛依市HIV-1 env、gag、pol基因特征及不同亚型混合感染情况。方法巢氏PCR方法扩增2017年克拉玛依市HIV新发现病例env、gag、pol基因,结合已知亚型利用Mega软件分析测序结果。结果48份样本env、gag、pol三种基因分别获得合格序列36份、35份和41份,CRF07_BC是三种基因分型的主要亚型,CRF01_AE排第二位。除此外还发现克拉玛依市存在其他亚型和重组型,HIV-1 pol基因有新型变异亚型CRF79-0107、URF-01B、URF-02B。有6份样本存在三种基因分型不完全一致情况,即不同亚型混合感染。结论克拉玛依市HIV-1防控形势相对于新疆其他地市更加严峻,预防和控制艾滋病在不同人群间相互传播、防止混合感染为目前首要任务。

慢性粒细胞白血病患者血清中内源性逆转录病毒pol基因检测与分析

目的以慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病患者及健康人为对象,研究逆转录病毒感染与慢性粒细胞白血病的相关性。方法提取慢性粒细胞白血病、急性白血病患者以及健康人血清RNA,采用半巢式RT-PCR法检测逆转录病毒pol基因,进行对比分析。结果 RT-PCR检测10份慢性粒细胞白血病患者血清有8份逆转录病毒pol基因阳性,目的基因片段大小约为135bp,健康血清逆转录病毒pol基因检测10份血清1份阳性,阳性标本扩增片段与慢性粒细胞白血病患者扩增片段大小相近（约为135bp）;11份急性白血病患者血清PCR扩增阴性。结论慢性粒细胞白血病的发生可能与逆转录病毒中pol基因的表达相关,相关病因学关系及其致病机制尚需进一步研究。

HIV-1 pol基因人工miRNA的构建和功能分析

以miR-155为基础骨架,根据HIV-1 pol基因序列设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,构建4个人工miR-pol,并对其进行功能分析.qPCR结果显示,4个人工miR-pol对pol基因都具有一定的沉默效果,其中miR-pol-4的沉默效率最高,达76%.进一步的实验证实miR-pol-4不会影响被转染细胞的活性,也不会对细胞干扰素的表达产生影响.此外,HIV-1假病毒实验显示,miR-pol-4对HIV-1的复制具有良好的抑制作用.因此,所获得的miR-pol-4将可为进一步的抗HIV-1感染研究提供基础.

德宏傣族景颇族自治州2017—2019年新报告HIV感染者治疗前HIV pol基因耐药突变位点及耐药相关因素分析

目的 了解德宏傣族景颇族自治州(德宏州)2017—2019年新报告人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染者治疗前HIV耐药突变位点情况及影响耐药发生的相关社会因素,为减少HIV感染者耐药发生,合理抗病毒治疗提供科学依据。方法 采用横断面研究方法,对德宏州2017—2019年新报告HIV感染者血浆样本提取核酸并扩增pol基因片段,确定耐药突变位点。收集HIV感染者的疫情卡片及社会人口学特征,运用构成比、均数和标准差或中位数和四分位间距(interquartile, IQR)等描述研究对象社会人口学特征及实验室指标情况,采用多因素logistic回归分析耐药发生的影响因素。结果 2017—2019年德宏州新报告HIV感染者共3 278例,对首次确证阳性患者样本剩余血浆量≥200μl的2 346例进行耐药检测,有1 796例感染者的样本获得pol基因序列,其中,男性感染者1 216例(67.7%)、异性传播1 414例(78.7%)、中国籍感染者674例(37.5%)。2017—2019年新报告HIV感染者治疗前总体耐药率达7.1%(127/1 796)。多因素logistic回归分析结果显示,在中国籍和缅甸籍HIV感染者中,发生耐药的影响因素有CRF01_AE亚型(OR=0.28,95%CI:0.08~0.99)、景颇族(OR=8.67,95%CI:1.13~66.39)、傣族(OR=11.99,95%CI:1.56~92.22)以及自愿咨询检测发现的感染者(OR=3.49,95%CI:1.21~10.08)。结论 德宏州2017—2019年新报告HIV感染者治疗前耐药发生率处于中度流行。中国籍感染者CRF01_AE亚型的发生耐药风险较低,而境内缅甸籍感染者中景颇族和傣族以及自愿咨询检测发现者发生耐药风险较高。

首发精神分裂症患者血液中HERV pol基因的检测

为了检测首发精神分裂症患者体内，人内源性逆转录病毒（HERV）的激活状况，分析比较HERV pol基因阳性和阴性首发精神分裂症患者的临床表现，我们用RT-PCR技术检测首发精神分裂症患者血液中HERV pol基因序列的表达状况。

polι基因对结肠癌细胞铂类药物敏感性的影响

目的研究DNA聚合酶ι(DNA polymerase iota,polι)基因对人类结肠癌化疗药物奥沙利铂敏感性的影响。方法采用RNAi技术使SW480细胞中polι基因的表达降低,通过Real time PCR实验检测基因polι低表达水平;运用MTT实验确定SW480细胞对药物奥沙利铂的敏感性确定给药剂量,并设立实验分组(空白组、对照组、实验组、空白加药组、对照加药组和实验加药组);分别使用流式细胞术和CCK-8实验分别检测不同组细胞的凋亡与增殖情况,通过集落形成实验检测细胞的存活数。结果RNA干扰技术成功降低了SW480细胞中polι基因的表达量(P<0.05),低表达polι基因并同时给予奥沙利铂药物的SW480细胞与只加药的对照组和空白组细胞相比,细胞凋亡实验显示细胞的凋亡率升高(P<0.01),CCK-8实验显示细胞的增殖率降低(P<0.05),集落形成实验显示细胞的存活分数降低(P<0.05)。结论下调SW480 polι基因表达水平,可提高人类结肠癌细胞对药物奥沙利铂的敏感性,并且可以抑制结肠癌细胞的增殖,促进其凋亡。

Polι基因在人肺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

目的:检测DNA聚合酶ι(polymerase iota,Polι)基因在人肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中的表达,结合肺癌临床病理特征及预后分析Polι在肺癌发生、发展中的意义。方法:选取2001年1月至2003年8月在山东大学齐鲁医院胸外科行手术治疗的明确诊断为原发性肺癌的患者,应用免疫组化和RT-PCR方法检测62例肺癌组织、30例癌旁组织和30例正常肺组织标本中Polι的表达水平,采用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析。结果:人肺癌组织、癌旁组织和正常肺组织中Polι表达率分别为54.8%、33.3%和10.0%,不同类型肺癌组织中Polι表达无显著性差异(P>0.05),随着肺癌分化程度升高,Polι表达下降(P<0.05),Ⅲ期和Ⅳ期肺癌组织中Polι表达明显高于Ⅰ期和Ⅱ期(P<0.05),生存3年以下肺癌Polι表达明显高于3年以上者(P<0.05),吸烟者Polι表达高于非吸烟者(P<0.05)。结论:Polι高表达在肺癌发生、发展中起到重要作用,可能作为肺癌生物学特征和预后判断的参考指标。

EIAV基因转移载体包装盒表达质粒的构建

在马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体成功构建并优化的基础上,构建了EIAV基因转移载体包装盒表达重组质粒。分别根据EIAV驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆(pLGFD3-8)和驴白细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆pOK8266T序列,设计并合成引物,扩增EIAVgag/pol全基因和rev基因的第2个外显子,分别插入真核表达载体pCDNA3.1(+),获得表达载体pCDFGP和pCDREV,与亲本株的核苷酸同源性分别是99.6%和99.8%,编码蛋白Gag、Pol及Rev蛋白的推测氨基酸同源性分别为99.2%、98.3%和100%。利用脂质体法,分别将pCDFGP和pCDREV单独及共转染HEK293细胞,利用EIAV阳性血清分别进行间接免疫荧光抗体试验(IFA)和蛋白免疫印迹试验(westernblot),检测外源蛋白的表达情况。结果表明,双质粒共转染的细胞中转染后48h可检测到特异性荧光,转染后60h的细胞裂解产物中可以检测到55ku的Gag蛋白及26ku的p26蛋白,而单独转染pCDFGP和pCDREV的细胞,IFA和western blot试验结果均为阴性。结果表明同时存在gag/pol和rev基因第4外显子的情况下,EIAV包装盒才能表达。

盐胁迫下盐穗木DNA聚合酶λ基因的克隆和表达分析

【目的】开展盐胁迫下DNA损伤修复基因的表达研究,有助于揭示DNA损伤修复与盐生植物耐盐的相关性。【方法】根据盐胁迫下盐穗木转录组测序结果,利用RACE技术克隆获得了盐穗木DNA损伤修复基因HcDNA聚合酶λ(HcDNA polλ)基因,开放阅读框1 335 bp,编码444个氨基酸。【结果】保守结构域分析显示,HcDNA polλ基因属于DNA聚合酶X家族成员,系统进化分析显示HcDNA polλ为独立的分支,亚细胞定位于细胞核,无信号肽且不含跨膜区域的亲水蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,随着NaCl胁迫浓度的增加,同化枝的HcDNA polλ基因的表达逐渐上调,在300 mmol/L NaCl处理7和14 d时,HcDNA polλ的表达分别增加3和5倍。最后在700 mmol/L NaCl处理14 d时,HcDNA polλ的表达增加20倍,达到峰值。【结论】HcDNA polλ基因的表达受盐胁迫的诱导。

表达HIV-1 Gag-Pol抗原的重组痘病毒的构建及免疫原性

目的构建稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体疫苗,并检测其体液免疫效果。方法将修饰型HIV-1Gag-Pol基因插入到痘病毒表达载体pSC11m2启动子P7·5下游,经与野生型痘病毒同源重组后,进行蓝白斑筛选。用筛选得到的重组病毒rM-GP转染HEK293细胞,经SDS-PAGE和Westernblot检测表达蛋白。用该重组病毒免疫BALB/c小鼠,并检测体液免疫应答。结果已筛选到稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体rM-GP,经Westernblot,在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1p24蛋白的特异性抗体。结论重组痘病毒载体rM-GP能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白,并能引起有效的体液免疫应答。

Construction of retrovirus vector with HBV Pol gene and its expression in vitro

Objective: To construct retroviral vector with HBV Pol gene and study its expression in vitro. Methods:The recombinant plasmid HBV2/pBR322 containing 2 copies of HBV full-length gene was provided as the amplification template. The PCR product was cloned into pMD 18-T and subcloned into pMSCVneo and pLNCX2 to construct the recombinant retroviral vectors with HBV Pol gene named by HBV P/pMSCVneo and HBV P/pLNCX2. HBV Pol gene was detected by RTPCR after transfecting the recombinant plasmids into SMMC7721 cells with liposome and G418 selection. Results: The retroviral vector with HBV Pol gene was successfully constructed and the expression of HBV Pol gene in vitro was detected by RTPCR. Conclusion: The retroviral vector with HBV Pol gene can be obtained, which will provide a new insight on the function of HBV Pol gene.

中国HIV-1B/C重组病毒的gag-pol区基因序列特征分析

目的 对 6株中国人类免疫缺陷病毒 1型 (HIV 1)B/C重组病毒的完整 gag基因和部分pol基因进行序列分析 ,从基因水平上分析是否存在新模式的B/C重组病毒并与其母本毒株进行比较研究 ,尝试对其不同的生物学表型进行解释。方法 从确诊的HIV感染者的全血样本中 ,提取样本基因组DNA ,经套式聚合酶链反应 (PCR)扩增后 ,将扩增产物进行纯化和测序。然后将所得序列进行系统进化树和氨基酸变异分析。用Simplot软件进行序列重组分析并确定重组断点区域 ;用MEGA软件按断点分段做基因进化树分析以验证该断点的正确性 ;用GCG软件包的Distance程序计算基因距离。并分析所研究的HIV 1B/C重组毒株长 2 5 5 0bp基因区段的分区段的基因离散率及基因重组对其功能可能造成的影响。结果 新疆 5份样本均未发现重组断点的变化 ,而重庆 1份样本的逆转录酶区内的B/C断点发生了 16 0个核苷酸的移动。氨基酸序列分析显示 ,我国流行的B/C重组株与其母本B、C毒株之间发生第 2 86位 (R→K/N)和第 799位 (A→T)的变化。结论 我国现在流行的HIV 1B/C重组病毒仍以CRF0 7 BC和CRF0 8 BC两种模式为主 ,在本研究涉及的基因区内尚未发现新模式重组毒株的流行。初步分析表明我国B/C重组毒株 2 86位和 799位氨基酸的变异可能为B/C重组株在我?