POLH mRNA作为辐射损伤分子生物标志物的可行性研究

目的:研究受γ射线照射后人外周血中POLH mRNA的表达变化,为确立POLH mRNA作为新的辐射损伤分子生物标志物提供实验依据。方法:采取3名健康成人的外周血,利用^(60)Coγ放射源分别对其进行0.5、1、2、4、6、10 Gy照射,在照射后2、4、8、12和24 h收集各个剂量组受试者全血,提取总RNA,利用TaqMan探针实时定量PCR法,检测POLH mRNA的相对表达量。另收集30名不同年龄段(男女各占一半)的健康人外周血作为本底组,检测POLH mRNA在不同个体间的表达差异。结果:照射后2 h,仅10 Gy照射组POLH mRNA表达增加,其余各照射组无显著变化;照射后4、8、12和24 h,在0~2 Gy范围内,POLH mRNA表达量随照射剂量的增加而增加,呈现明显的剂量依赖效应,大于2 Gy照射后增加趋势接近饱和。照射后4~12 h随时间的增加表达量也不断增加,于12 h达到峰值。在对健康人群本底表达水平的分析中发现,POLH mRNA表达水平不受性别、年龄影响,在不同个体间相对均一,波动范围小。结论:POLH mRNA可由为辐射诱导表达,在一定时间和剂量范围内呈现明显的剂量依赖关系,且在不同个体之间本底表达水平相对均一,具备作为辐射损伤分子生物标志物的潜力。

氢醌对L-02肝细胞内POLH基因mRNA表达的影响

目的 观察不同浓度氢醌（HQ）对L-02肝细胞内POLH基因mRNA表达的影响，旨在探讨HQ对人体细胞毒性作用的分子机制。方法 应用四甲基偶氮唑盐比色法检测不同浓度（0、5、10、20、40、80、160和320μmol／L）HQ作用24h后对L-02肝细胞存活率的影响；应用带有SYBR GreenⅠ的实时荧光定量聚合酶链反应技术研究不同浓度（0、5、10、20、40、80和160μmol／L）HQ对L-02肝细胞内POLH基因mRNA表达的影响。结果 在0—80μmol/L的范围内。HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响（P〉0．05），当染毒剂量超过160μmol／L时，其存活率则明显地下降（P〈0．01）；在HQ染毒剂量低于80μmol／L的范围内，POLH基因mRNA表达有随着剂量的增加而增加的趋势，当HQ的剂量达到160μmol／L时，POLH基因mRNA的表达则有所降低，但仍高于对照组。结论 HQ可以诱导L-02肝细胞内POLH基因在mRNA水平上的表达改变。

AcMNPV polh启动子上游增强序列的部分缺失分析

本实验构建了2个用于杆状病毒AcMNPV(苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒)启动子及其调控序列研究的质粒载体:pF SBCAT和pF SBCATPpolh.以此为基础,结合目前对BmNPV(家蚕核多角体病毒)polh(多角体)基因和AcMNPVpolh基因上游增强序列的研究结果,构建了AcMNPVpolh基因上游增强序列部分缺失的瞬时表达载体;以cat为报告基因,利用瞬时转染和CATELISA的方法检测报告基因的表达活性,初步研究了对于polh启动子具有增强作用的AcMNPVpolh基因上游序列的结构.结果显示,与BmNPVpolh上游293bp序列同源性极高的AcMNPVpolh上游293bp片段对于polh启动子没有增强活性;CMVm启动子的AcMNPVpolh上游增强序列部分缺失之后不能够增强AcMNPVpolh启动子.因此,这一序列可能不再被缩短,也不大可能存在独立地起作用和更短的正、负调控元件.

哺乳动物细胞POLK、POLH、POLI基因对甲基硝基亚硝基胍的应答反应及其启动子区转录因子结合部位的生物信息学分析

目的:观察甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对培养细胞DNA聚合酶κ、η、ι编码基因表达的影响并用生物信息学方法预测它们的启动子区和启动子区中的转录因子结合部位。方法:利用半定量RT-PCR观察POLK、POLH、POLI基因表达改变。利用在线生物信息学软件,确定它们的启动子区,然后,用转录因子预测软件并结合进化足迹法检出包括启动子区在内的3000bp碱基上游序列中的转录因子结合部位。结果:0.2μmol·L-1MNNG导致细胞POLH和POLI表达水平在处理后6-24h间逐渐上升,升高约1倍;而POLK则呈下降;通过转录因子预测软件分析,在POLK、H和I启动子区分别检出了384个、413个和689个推断的转录因子结合部位;通过进化足迹法分析有效地降低了假阳性率,推断的转录因子结合部位分别下降到158个、80个和40个。结论:低浓度MNNG导致POLH、POLI表达水平升高,而POLK表达水平降低;通过在线软件,我们成功地在POLK,POLH,POLI启动子区分别检出。158、80和40个推断的转录因子结合部位;进化足迹法分析能够有效降低预测软件的假阳性率。

家蚕核型多角体病毒基因polh的诱变分析

曾报道经化学诱变剂ＭＭＣ、９－ＡＡ和ＥＭＳ诱变的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）多角体 形态出现异常，继代分离的诱变 ＢｍＮＰＶ基因组对 ＥｃｏＲＩ、 ＢｇｌⅡ和 ＢａｍＨＩ的酶切谱发生变 化。研究进一步揭示，诱变ＢｍＮＰＶ的多角体外层蛋白晶格排列呈现紊乱；多角体蛋白的 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳港与对照组比较有显著差异；对多角体蛋白基因ｐｏｌｈ的测序结果显示，３组诱 变ＢｍＮＰＶ的ｐｏｌｈ基因发生了多处碱基（氨基酸）替代的点突变，进而从分子水平上证实了诱 变剂对ＢｍＮＰＶ的致突变作用。诱变的ＢｍＮＰＶ ｐｏｌｈ基因点突变是否与多角体形态异常有 关，尚无法确认。

中国首个着色性干皮病变异型家系的POLH突变研究

目的检测一个着色性干皮病(xeroderma pigmentosum,XP)家系的基因突变。方法在2019年1—12月间,收集XP家系的临床资料和外周血标本,先证者采用新一代测序(next generation sequencing,NGS)进行测序,其余亲属采用Sanger测序验证。结果在一个中国家系中发现了POLH外显子9的无义突变(NM_006502.2,c.1066 C>T,p.Arg356Ter)和与XP相关的大片段缺失(外显子5-8)。结论中国XP家系,为XP的基因诊断和遗传咨询提供了重要信息。

重组AcNPV载体携带的外源基因在家蚕中的动态表达

重组AcNPV作为用于昆虫培养细胞的真核表达载体,感染部分家蚕品种,感染症状较BmNPV轻,可以存活较长时间,且不会经口传染,因此将它用作一种瞬时表达载体来研究基因的功能及其表达调控具有一定的优越性。该实验构建了分别由A3和Polh启动子控制的分泌型萤火虫荧光素酶为报告基因的供体质粒,通过"Bac-to-Bac"原理得到重组杆状病毒的bacmid,转染Sf9细胞获得具有感染性的病毒。用Real-time PCR方法测定其拷贝数后,注射五龄起蚕和蛹。通过测定血液中荧光素酶活性,比较了由A3和Polh启动子分别控制的外源蛋白在家蚕中的动态表达。结果表明A3启动子控制的外源基因进入家蚕体内后在前24 h表达高于Polh启动子,Polh启动子控制的外源基因则在病毒注射48 h后逐渐高于A3启动子。蛹血中的动态表达情况与蚕血中情况基本一致。文章还应用Real-time定量RT-PCR对于A3和Polh启动子的不同表达动态进行了分析。

POLΗ基因反义阻断细胞系的建立及POLΗ在MNNG引起的非定标性突变中的作用

目的 :通过建立 POLΗ反义阻断细胞系 FL - POLΗ-,研究 POLΗ的功能。方法 :将 POLΗ基因的 14 73～ 2 131片段反向克隆到哺乳动物细胞表达载体 p MAMneo- amp-中 ,将重组表达质粒转染 FL细胞 ,G4 18筛选 ,获得 POLΗ基因被表达阻断的哺乳动物细胞系 FL - POLΗ-。采用穿梭质粒 p Z189介导的突变实验 ,观察在 POLΗ基因表达被阻断细胞系中进行复制时的自发突变频率和 MNNG引起的诱发突变频率。结果 :成功建立细胞系 FL -POLΗ-。穿梭质粒 p Z189在 FL- POLΗ-细胞中复制后 ,其 Sup F t RNA基因的自发突变频率为 13.5× 10 -4,而对照细胞 FL和 FL- M分别为 4 .9× 10 -4和 3.7× 10 -4。同时 ,质粒在接触过 MNNG的 FL- POLΗ-细胞中复制 ,其 Sup Ft RNA基因的非定标性突变频率不发生。结论 :POLΗ在维持哺乳类细胞的遗传稳定性中起重要作用 ,且参与哺乳动物细胞中 MNNG引起的非定标性突变。

从云南蚕区分离BmCPV病毒株的全基因组克隆与系统发育分析

家蚕质型多角体病毒（BmCPV）是家蚕中肠型脓病的病原物。从云南蚕区的病蚕样品中分离到一株BmCPV病毒分离株,提取纯化该病毒粒子的总RNA并合成cDNA,克隆病毒全基因组序列,研究该病毒分离株的基因组结构与系统进化。克隆得到该病毒10条dsRNA序列（S1~S10）并提交至NCBI数据库中。序列分析表明该病毒基因组序列全长24810bp,S1~S10片段序列都具有完整的ORF。BLAST比对发现克隆的该病毒基因组各片段编码区序列与已报道的1型BmCPV片段的相似度达88%以上,氨基酸序列相似度达90%以上;10条dsRNA基因组片段末端均有保守帽子结构5＇-AGUAA……GUUAGCC-3＇。基于S2片段RdRp基因的系统进化分析发现,该病毒与其他3个1型BmCPV分离株BmCPV1-Suzhou、BmCPV1-China、BmCPV1-Ⅰ聚为一支,基于S10片段polh基因的系统进化分析也表明该病毒为1型BmCPV新的分离株系。根据上述研究结果将该病毒定名为BmCPV1-Yunnan。

应用二温式PCR检测家蚕核型多角体病毒的方法

为了简便、快速、准确地检测家蚕核型多角体病毒(Bm NPV),以Bm NPV广西分离株的多角体蛋白基因(polh)序列(Gen Bank登录号:JQ991011.1)设计引物,以感染Bm NPV(广西宜州分离株)2 h的5龄家蚕幼虫中肠组织提取的DNA为模板,建立二温式PCR检测Bm NPV的方法,最终确定的最佳反应体系为:10×PCR buffer 1.5μL,5 mmol/L Mg Cl22μL,2.5mmol/L d NTP 0.5μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1μL,18 ng/μL模板DNA 1μL,加水至总体积15μL。确定的最佳反应条件为:94℃预变性3 min;95℃15 s,延伸和退火温度合并为62℃30 s,共25个循环。按上述条件PCR扩增得到大小约309 bp的特异性片段,测序结果与已知polh基因序列的相似度为100%。与普通PCR检测方法比较,采用二温式PCR方法对样本的检测时间节省1.5 h,反应特异性强,灵敏度高(能被检测的最小感病组织基因组DNA的质量浓度为1.8 pg/μL),并且选择最初2 h感病的幼虫中肠组织为检测材料,因而可用于家蚕血液型脓病的早期诊断。

对再造秀美山川的经济学思考

再造秀美山川是造福子孙后代的伟大工程 ,当前在通过退耕还林、还草实现这一千秋伟业中应正确处理生态、社会效益与经济效益、政府行为与农民行为、再造秀美山川与创新土地制度、再造秀美山川与保证粮食需求、再造秀美山川与调整经济结构、再造秀美山川与人口六大关系 ,为此 ,政府应采取必要的政策措施以协调它们的关系 ,从而实现人口、资源、环境。