POLQ表达降低对SACC-83细胞DNA损伤敏感性的影响

目的:探讨DNA损伤环境中抑制POLQ对唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)细胞SACC-83增殖及克隆形成能力、细胞周期及DNA损伤修复通路的影响。方法:应用shRNA(short hairpin RNA)瞬时转染方法构建POLQ敲减的SACC-83细胞模型,利用qRT-PCR及Western免疫印迹实验检测POLQ干扰效率。应用不同浓度DNA损伤剂依托泊苷(etoposide,ETP/VP-16-213)诱导SACC-83细胞发生DNA损伤,利用Western免疫印迹实验检测γH2AX的表达水平,评价DNA双链断裂水平。在不同浓度依托泊苷诱导形成的DNA损伤环境中,通过CCK-8细胞增殖实验检测抑制POLQ对SACC-83细胞增殖能力的影响。采用平板克隆实验观察抑制POLQ对SACC-83细胞克隆形成能力的影响,应用流式细胞仪分析抑制POLQ对SACC-83细胞周期的影响,应用Western免疫印迹实验检测抑制POLQ对SACC-83细胞γH2AX、RAD51及PARP1表达水平的影响。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:应用shRNA瞬时转染方法抑制SACC-83细胞POLQ mRNA及蛋白的表达。依托泊苷以剂量依赖的方式促进SACC-83细胞γH2AX表达。POLQ表达降低可抑制SACC-83细胞增殖能力(P<0.001),且抑制作用随ETP浓度增加而减小。在依托泊苷诱导形成的DNA损伤环境中,POLQ表达降低可抑制SACC-83细胞克隆形成能力(P<0.001),诱导细胞发生S期阻滞(P<0.01)。POLQ通过促进γH2AX(P<0.05)及同源重组(homologous recombination,HR)通路相关蛋白RAD51(P<0.05)、抑制非同源末端连接(alternative non-homologous end joining,altNHEJ)通路相关蛋白PARP1(P<0.01),调节DNA损伤修复。结论:POLQ表达降低,会促进SACC-83细胞对DNA损伤的敏感性。

DNA polymerase θ (POLQ):A druggable DNA polymerase for homologous recombination-deficient cancer cells

Irregularities in the DNA repair pathways are frequently observed in cancer.Dysregulated DNA repair pathways support growth advantages to tumor cells.DNA polymerase-theta(POLQ)is an error-prone DNA polymerase involved in double-strand break repair through microhomology-mediated end joining(MMEJ).POLQ also mediates translesion DNA synthesis and it is largely not expressed in normal cells.POLQ is overexpressed in a range of cancer cells,including homologous recombination(HR)deficient cancer cells.In HR deficient cells,MMEJ is crucial as a backup DNA repair pathway,indicating the indispensable role of POLQ-mediated MMEJ in HR deficient cancer cells.In addition,POLQ is synthetic lethal with a number of oncogenes.This viewpoint highlights the potential role of POLQ as a new target in the treatment of HR-deficient tumors and aims to develop enthusiasm to introduce fundamental aspects of Molecular Biology and Biochemistry to basic research related to Molecular Life Sciences,Cell Biology and Genetics in Sri Lanka as Molecular Biology and Biochemistry fundamentals can still do wonders in modern research.

子宫内膜癌患者POLQ样蛋白解旋酶的表达及临床意义

目的探讨子宫内膜癌(EC)患者POLQ样蛋白解旋酶(HELQ)的表达及临床意义。方法选取EC患者、子宫内膜不典型增生患者及正常子宫内膜女性分别作为EC组(n=37)、增生组(n=43)及正常组(n=30),取3组研究对象的子宫内膜组织制成石蜡切片,采用苏木精-伊红染色法(HE)、免疫组织化学法(IHC)分别检测3组研究对象子宫内膜组织的病理学特征、HELQ蛋白表达,采用Envision法检测EC组患者子宫内膜组织的增殖抗原指数(Ki67)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的表达;比较HELQ阳性表达和HELQ阴性表达的EC患者肿瘤分化程度、国际妇产科协会(FIGP)分期、肌层浸润深度、淋巴结转移及脉管浸润差异;通过门诊复诊或电话随访EC组患者术后生存情况,采用Cox回归模型和受试者工作特征曲线分析HELQ表达对EC患者术后死亡的影响及预测效能,采用Kaplan-Meier法比较HELQ阳性和阴性的EC患者的生存曲线。结果EC组患者HELQ阳性率较正常组、增生组低(P<0.05);HELQ阴性组EC患者肌层浸润深度>1/2肌层、脉管侵袭比率、Ki67阳性率较HELQ阳性组高(P<0.05),PR阳性率较HELQ阳性组低(P<0.05);校正协变量后,HELQ表达不是EC患者死亡预后发生的独立影响因素(P>0.05);HELQ、HELQ×Ki67、HELQ×PR及HELQ×Ki67×PR预测EC患者死亡的曲线下面积(AUC)分别为0.642、0.711、0.676及0.725,但P>0.05。结论HELQ表达可能与EC的发生、发展及死亡有关。

POLQ对SACC-83细胞的影响及POLQ基因表达调控因子预测

目的:研究POLQ在肿瘤中的表达及对唾液腺腺样囊性癌细胞SACC-83增殖及克隆形成能力的影响,预测POLQ的表达调控因子。方法:应用数据库分析POLQ在肿瘤中的表达,并预测与POLQ启动子结合的FOXM1及二者的表达相关性。将体外培养的SACC-83细胞分为2组,用基因沉默技术(siRNA)抑制实验组细胞中POLQ的表达,未处理的细胞作为对照组。CCK-8实验检测增殖能力,平板克隆实验检测克隆形成能力,应用qRT-PCR检测基因表达水平。结果:数据库分析显示,多种肿瘤中POLQ表达高于正常组织。实验组细胞增殖能力及克隆形成能力均低于对照组(P<0.001,P<0.05)。FOXM1与POLQ启动子有5个结合位点,并与POLQ表达正相关(P<0.05)。PTEN下调促进SACC-83 POLQ与FOXM1表达(P<0.001,P<0.05)。结论:POLQ促进肿瘤的发生发展;促进SACC-83增殖及克隆形成能力;FOXM1可能正调控POLQ表达;PTEN负调控SACC-83 POLQ与FOXM1表达。

POLQ基因敲除293T细胞系的构建及其在外源基因定点整合中的应用

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用。方法:构建靶向POLQ基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、稳定单细胞克隆培养、TA克隆测序及蛋白质印迹等方法验证POLQ敲除情况;利用靶向AAVS1和FBL位点的含GFP/mCherry报告基因同源打靶载体,评估敲除的293T POLQ-/-细胞系在外源基因定点整合效率的变化,并通过测序方式验证供体报告载体是否定点整合到基因组中;最后分析POLQ敲除对293T细胞增殖和存活率的影响。结果:成功在293T细胞中稳定敲除POLQ基因;通过报告基因实验验证,敲除细胞系中外源基因定点整合效率平均提高2~7倍,且敲除POLQ基因对293T细胞系增殖和存活率没有明显影响。结论:成功利用CRISPR/Cas9技术构建具有高效定点整合能力的POLQ基因稳定敲除293T细胞系,为进一步利用该细胞系高效制备稳定整合外源基因(包括抗体基因)工程化细胞系奠定基础。

HELQ对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响及机制

目的探讨POLQ样蛋白解旋酶(HELQ)对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响及作用机制。方法将体外培养的人源骨肉瘤细胞系U2-OS、143B随机分为Lv-HELQ组、NC组、Lv-sh HELQ组,分别转染Lv-HELQ、Lv-Negative、Lv-sh HELQ慢病毒载体。转染48 h时,采用Western blotting法检测HELQ蛋白表达,结果显示两种细胞Lv-HELQ组HELQ蛋白相对表达量均高于NC组,Lv-sh HELQ组均低于NC组,组间比较P均<0.05,提示HELQ转染成功。三组(两种细胞)转染48 h时,采用CCK8法检测细胞增殖情况(光密度值),采用Wound healing法检测细胞迁移率,采用Transwell invasion法检测细胞穿膜细胞数(侵袭能力),采用彗星实验检测彗星尾部DNA百分比。结果两种细胞Lv-HELQ组光密度值均高于NC组,Lv-sh HELQ组光密度值均低于NC组,组间比较P<0.05或<0.01。两种细胞Lv-HELQ组细胞迁移率、穿膜细胞数及均彗星尾部DNA百分比均低于NC组,Lv-sh HELQ组均高于NC组,组间比较P均<0.05。结论 HELQ可抑制人骨肉瘤细胞增殖、侵袭、转移,修复DNA损伤可能是其作用机制。

DNA聚合酶θ在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的·探究和验证DNA聚合酶θ(DNA polymeraseθ,POLQ)在子宫内膜癌和正常子宫内膜组织中的差异表达,分析其与子宫内膜癌患者临床特征的关系及对预后判断的价值。方法·应用基因表达数据动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)网站检索POLQ基因在人体各部位癌组织和正常组织的表达情况。从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中下载POLQ基因表达谱及临床数据,经Strawberry Perl软件整理后获得基因表达矩阵,使用R软件比较癌和癌旁组织POLQ表达差异及其表达与临床特征的关系,利用基因探针富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)揭示POLQ在子宫内膜癌中参与的信号通路。收集127例2011年3月—2014年12月在重庆医科大学第一附属医院接受手术且组织病理学诊断为子宫内膜癌的患者的临床信息,分析不同临床特征患者间POLQ表达的差异;取这些患者的肿瘤组织石蜡切片行免疫组织化学染色,判断肿瘤组织中POLQ表达情况,并以22例子宫肌瘤患者的正常子宫内膜组织作为对照。利用Kaplan-Meier法及多因素Cox回归模型分析POLQ表达与子宫内膜癌患者预后的相关性。结果·通过GEPIA网站检索到POLQ除了在睾丸癌中相对低表达,在多数癌症中表达均升高。TCGA数据库中POLQ在子宫内膜癌组织的表达水平显著高于癌旁组织(P=0.000);POLQ在60岁及以上和高分级患者中的表达水平更高(均P<0.05),且POLQ高表达患者总生存期较短(P=0.000)。GSEA结果显示,POLQ基因主要富集在碱基切除修复通路、同源重组通路、P53通路等。POLQ在正常子宫内膜石蜡切片免疫组织化学染色评分≥1分与≥5分的比例均显著低于子宫内膜癌组织(均P<0.05);≥5分的比例在不同肿瘤分期、淋巴结转移情况的患者间差异有统计学意义(均P=0.038);且POLQ高表达患者无病生存期和总生存期均显著短于POLQ低表达组(均P<0.05)。多因素Cox分析提示POLQ评分可作为子宫内膜癌的独立预后因素。结论·相较于正常子宫内膜,POLQ在子宫内膜癌组织中表达显著升高,尤其在晚期、有淋巴结转移的患者中表达水平更高,且POLQ高表达是子宫内膜癌患者预后差的独立预测因素。