人热休克蛋白转录因子1 DNA结合结构域的表达、纯化和晶体生长

目的:获得大量热休克转录因子1(HSF1)DNA结合结构域(DBD)蛋白,用于晶体生长的三维结构解析。方法:将DBD基因片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中并获得高效表达,经过Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析、ResourceQ纯化后,蛋白纯度达到95%以上。结果:圆二色谱仪分析蛋白质的二级结构结果显示α螺旋占33%,β折叠占15%;采用悬滴气相扩散法得到了针状DBD晶体。结论:纯化的蛋白质与同源性达68%的Kluyveromyceslactis的DBD有相似的空间构象。获得的蛋白质晶体为进一步的三维结构解析奠定了基础。

转录因子E2F-1的DNA结合结构域与GST的融合表达和纯化

通过聚合酶链式反应方法扩增转录因子Ｅ２Ｆ－１中ＤＮＡ结合结构域的基因片段，并将其克隆到ｐＧＥＸ－２Ｔ表达载体中，转化ＢＬ２１菌株．经ＩＰＴＧ诱导，目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，其表达量达１５％．经ＧＳＴ－Ａｇａｒｏｓｅ亲合层析，目的蛋白得到了高度纯化．经胶迁移率改变实验（ｇｅｌｓｈｉｆｔｍｏｂｉｌｉｔｙａｓａｙ）证明目的蛋白具有与腺病毒Ｅ２启动子ＤＮＡ片段结合的能力．

盘状结构域受体1通过调控NF-κB/NLRP3信号通路介导的细胞焦亡对高糖诱导血管内皮功能障碍的影响

目的 探究盘状结构域受体1 (discoidin domain receptor 1,DDR1)对高糖诱导血管内皮细胞功能障碍的作用机制。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HU VECs),首先分为对照组(Control)、高糖诱导组(high glucose,HG),采用33 mmol·L^(-1) D-glucose处理48 h构建HUVECs功能障碍。碘化丙啶染色(PI)检测细胞焦亡情况;酶联免疫吸附法(ELISA)测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、IL-1β、IL-18水平;Western blot检测DDR1、NF-κB/NLRP3信号通路蛋白及细胞焦亡相关蛋白表达;随后,实验分为C ontrol组、HG组、HG+DDR1 NC组、HG+DDR1 siRNA组。转染DDR1 siRNA 24 h后观察HG对HUVECs增殖和迁移能力的影响;ELISA检测内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)及LDH、IL-1β、IL-18水平;PI检测细胞焦亡情况;Western blot检测DDR1、NF-κB/NLRP3信号通路蛋白及细胞焦亡相关蛋白表达。结果 与Control组相比,HG组细胞eNOS含量降低,VCAM-1、ICAM-1含量升高,细胞活力及迁移能力降低,DDR1、p-NF-κB、NLRP3及细胞焦亡相关蛋白表达均明显升高,且LDH、IL-1β、IL-18水平及细胞焦亡率均增加(P<0.05)。与HG组相比,DDR1siRNA能够促进eNOS分泌,降低VCAM-1、ICAM-1、LDH、IL-1β、IL-18水平,增加细胞活力和迁移能力,降低p-NF-κB、NLRP3及细胞焦亡相关蛋白表达,抑制高糖诱导的HU VECs焦亡(P<0.05)。结论基因沉默DDR1能够改善高糖诱导的血管内皮细胞功能障碍,其机制与抑制NF-κB/NLRP3信号通路介导的细胞焦亡相关。

转录因子POU5F1在结直肠癌组织中的表达及临床意义

目的探讨转录因子POU5F1在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系。方法收集2011年1月至2013年7月142例手术切除的结直肠癌组织及86例癌旁黏膜组织存档蜡块。采用免疫组化SP法检测以上组织中POU5F1的表达情况,并分析其与临床病理特征的关系;根据随访资料分析POU5F1表达与预后的关系,采用Cox比例风险模型分析影响预后的因素。结果 POU5F1阳性表达定位于细胞核和胞质。其在结直肠癌中的高表达率为47.2%(67/142),高于癌旁黏膜组织的23.3%(20/86),差异有统计学意义(P<0.05);POU5F1表达与性别、年龄、肿瘤部位、远处转移、CEA、CA50及CA199均无关,与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及分化程度有关(P<0.05);结直肠癌患者中POU5F1高表达者的中位总生存时间(OS)为26.4个月,低于低表达者的33.6个月,差异有统计学意义(P<0.05)。Cox比例风险模型分析显示,浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期和POU5F1表达为影响OS的独立因素。结论 POU5F1在结直肠癌组织中表达增高,且与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、分化程度及OS有关,在结直肠癌诊断及预后预测中有一定价值。

POU结构域家族在耳科学中的研究进展

本文归纳整理了近年来三种与耳科学有关的POU结构域家族成员 (POU3F4、POU4F3和POU4F1)的研究状况 ,分别从基因结构、表达方式、作用机制及功能等方面进行综述。

FOXM1_(688-748)结构域相互作用蛋白的鉴定

为了鉴定转录因子FOXM1转录激活结构域(C-端第688位到748位氨基酸序列)的互作蛋白,以FOXM1的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法扩增获得其转录激活结构域序列,克隆进入原核表达载体pGEX-4T2;利用大肠杆菌原核表达获得融合谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)标签的重组蛋白GST-FOXM1_(688-748);通过GST-pulldown结合质谱方法鉴定FOXM1_(688-748)的互作蛋白,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T2-FOXM1_(688-748),获得了原核表达的重组蛋白GST-FOXM1_(688-748).将质谱鉴定获得的互作蛋白进行分析和归类,预示一些互作蛋白可以参与激活FOXM1的转录活性,如RPN2、MISP、MCM7蛋白,一些互作蛋白可以参与调控FOXM1蛋白的稳定性,如USP9Y、CUL4A、HSPB1、BAG2蛋白.FOXM1蛋白的转录激活结构域与许多不同功能的蛋白发生相互作用,暗示该结构域具有重要的分子生物学作用,期望为以FOXM1为靶点的临床药物研发提供实验依据.

棉花中一个新型转录因子GhWRI1的表达特征与功能分析

AP2(APETALA2)/EREBP(ethylene-responsive element binding protein)是一类特异性存在于植物中的转录因子,在植物中的许多代谢过程都起着十分重要的作用。从棉花中分离并获得了一个新的AP2基因GhWRI1,该基因长1 314 bp,所编码的蛋白含有437个氨基酸,分子量约为48 kD,pI为5.77。序列分析结果显示,GhWRI1蛋白含有2个AP2结构域,该蛋白属于AP2家族;与GFP蛋白的融合表达试验结果显示,在洋葱表皮细胞中,GhWRI1是特异性在细胞核中表达的。Real-time RT-PCR数据显示GhWRI1主要在真叶、根、纤维以及种子中表达,而且其在纤维和种子中的表达量是随着发育时间的推移而不断升高的。同时构建了GhWRI1与LUC共表达的载体,通过检测LUC的活性来反映GhWRI1的表达量,试验数据显示,当GhWRI1与LUC共表达后,LUC的活性提高了约20倍。试验结果都显示GhWRI1是一个很强的转录激活子。

甘薯SPF1转录因子的生物信息学分析

WRKY蛋白是一类植物特有的转录因子超家族,SPF1是第一个从植物(高系14)中克隆的WRKY家族基因。借助生物信息学手段,对甘薯SPF1蛋白组成、结构和功能进行分析预测。结果表明,SPF1编码蛋白含有丰富的丝氨酸位点,并含有2个WRKY保守结构域,分别带有CX_4CX_(22)HXH和CX_4CX_(23)HXH锌指结构,分别形成4个和5个β-折叠片。SPF1和甘薯祖先种Ipomoea trifida WRKY结构域均具有非常保守的WRKYG(Q/K)K氨基酸序列,并且C端WRKY结构域的保守性比N端WRKY结构域的低。系统进化树分析结果显示,蛋白N端和C端的WRKY结构域分属2个不同的分支。蛋白结构预测结果显示,SPF1 WRKY结构区(204~445 aa)处于蛋白三维结构的内侧,形成非亲水性靶标DNA结合区。SPF1作为转录因子,在调控细胞核基因表达的同时,其蛋白N端序列具有叶绿体定位功能。推测SPF1可能参与细胞核和叶绿体的基因表达调控。

转录因子TEAD4调控WNK1表达介导Wnt/β-catenin信号通路促进结肠癌增殖和迁移

目的探究转录因子TEA结构域转录因子(TEAD)4通过调控赖氨酸缺乏激酶(WNK)1表达介导Wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路促进结肠癌的增殖和迁移。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测TEAD4在正常人结肠上皮细胞NCM-460和人结肠癌细胞系SW620、SW480、LOVO、HCT 116中的表达情况。构建低表达TEAD4和WNK1的SW620和LOVO细胞,并通过平板克隆实验和细胞划痕实验评估TEAD4和WNK1对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响。通过生物分析找到TEAD4与WNK1启动子之间的结合位点序列,运用染色质免疫沉淀技术(ChIP)-qPCR验证TEAD4与WNK1启动子的结合情况。在沉默TEAD4的细胞中进一步过表达WNK1检测细胞增殖、迁移和Wnt/β-catenin信号通路的变化。结果TEAD4在结肠癌细胞中显著高表达(P<0.05)。敲低TEAD4显著抑制结肠癌细胞的增殖和迁移(P<0.01)。沉默TEAD4能显著抑制WNK1的表达(P<0.01)。通过抑制Wnt/β-catenin信号通路显著减弱结肠癌细胞的增殖和迁移(P<0.01)。在沉默TEAD4的细胞中进一步过表达WNK1,部分回调细胞的增殖、迁移能力,显著激活Wnt/β-catenin信号通路(P<0.05)。结论转录因子TEAD4促进WNK1表达,激活Wnt/β-catenin信号通路促进结肠癌的增殖和迁移。

内皮高表达脂多糖相关因子1的结构和功能研究进展

内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)编码的蛋白质主要定位于胞质,其具有向胞核移位的能力,可参与多种重要的生物学过程,如细胞周期调控和细胞内炎症信号通路转导。此外,EOLA1作为激活信号辅整合素1同源结构域超家族成员之一,可与金属硫蛋白2A相互作用介导核因子κB通路下游炎症细胞因子的表达。EOLA1作为负调控因子,可调节炎症反应细胞内的炎症反应程度,促进细胞增殖、分化及细胞自我保护等,并在局部炎症免疫反应发展中发挥作用。

POU1F1基因变异导致联合垂体激素缺乏症Ⅰ型1例的临床和遗传学特点

该文报道一例Ⅰ级POU结构域转录因子1(POU1F1)基因变异导致的联合垂体激素缺乏症Ⅰ型(CPHD1)的临床及遗传学特征.患儿女,2岁3个月,主要表现为身材矮小、前额突出、眼球内陷、下颌短小、皮肤松弛、中枢性甲状腺功能减退、完全性生长激素缺乏、垂体前叶发育不良.经基因分析发现POU1F1基因存在新杂合变异c.889C>T(p.R297W),父母该位点为野生型,根据美国医学遗传学与基因组学学会指南分析该变异为可能致病性变异,既往未见文献报道,符合常染色体显性遗传.该患儿确诊为CPHD1.经生长激素及左甲状腺素钠片联合治疗1年后,身高增长19.8 cm,呈追赶性生长趋势.该研究丰富了POU1F1基因的突变谱,对联合垂体激素缺乏的诊断与分型有重要意义.

猪POU1F1基因第三内含子Msp Ⅰ酶切片段多态特征的研究

采用PCR-RFLPs技术,以Msp I为内切酶,检测猪POU1F1基因中片段为2.1 kb的第三内含子中的多态位点:1.68 kb(C等位基因)和0.85/0.83 kb(D等位基因),分析各多态位点在长白猪、杜洛克猪、小梅山猪、香猪、姜曲海猪5个品种群中的分布,并通过X2检验比较这5个猪种间的基因型差异。X2适合性检验结果表明:Msp I酶切突变位点的3种基因型在5个品种中分布差异均极显著(P<0.01)。中国地方品种小梅山猪、姜曲海猪等位基因C的比例很高,中国地方品种香猪等位基因C的比例则比较高,国外品种长白猪、杜洛克猪等位基因C的比例很低。

哺乳动物POU1F1基因对其生长发育的作用

POU1F1基因是POU基因家族的成员之一,它以GH、PRL和TSHβ起着重要的调控作用,对哺乳动物的垂体发育和激素表达有着重要的调节功能。POU1F1基因的突变可以导致垂体的发育不全,并阻碍GH、PRL、TSHβ基因的正常表达。笔者对POU1F1基因的结构及其功能特别是对鼠、猪和人类的生长发育所产生的影响进行了综述。

死亡结构域沉默子和p65在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达及与化疗的关系

目的探讨凋亡调控基因死亡结构域沉默子(SODD)在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中的表达、临床意义及与磷酸化-NF-κB-p65表达的相关性,研究ALL2种常用化疗药物对SODD表达的影响,试图寻找化疗新靶点。方法免疫组织化学SABC法检测25例儿童ALL骨髓细胞SODD、p65蛋白表达水平;长春新碱(VCR)处理Jurkat细胞后,Annexin-V-Fluorescence/PI双标记的流式细胞术检测细胞凋亡发生率,免疫印迹法检测SODD及p65在化疗药物作用下的表达变化。结果25例ALL中,SODD和p65表达的阳性率较健康对照组高,其中高危病例组SODD阳性表达率较标危病例组阳性表达率高,有显著性差异(Pa<0.05),且骨髓细胞中SODD与p65表达呈正相关(r=0.69P<0.01);VCR能有效诱导Jurkat细胞凋亡,在该凋亡过程中,SODD及p65表达下调,并呈时间依赖性,但柔红霉素(DNR)不能有效下调SODD的表达。结论SODD和p65均参与了ALL的发生发展,且存在一定的协同关系,SODD与ALL临床分型及预后有密切关系;VCR特异下调白血病细胞中SODD的表达及抑制NF-κB的活化,恢复白血病细胞的凋亡敏感性。

抗病毒限制因子SAMHD1的研究进展

“限制因子”这一概念最早出现于上世纪七十年代[1],虽然到目前为止也尚未对其给出明确的定义,但可以确定它们是一类细胞内可限制病毒复制并保护宿主抵御病毒感染的蛋白。近些年,在对HIV-1的研究中发现,在病毒感染的细胞内存在一些具有抑制病毒复制的蛋白,而这些蛋白被认为是可以保护宿主免受病毒感染的宿主抗病毒限制因子。

灵长类动物限制性因子SAMHD1的生物学功能分析

目的:探讨不同灵长类动物限制因子不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素(IFN)产生信号通路等作用,为灵长类动物SAMHD1的研究提供依据。方法:构建稳定表达不同灵长类动物SAMHD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为阴性对照组,以稳定表达不同灵长类动物SAMHD1蛋白的U937细胞系为实验组。经佛波酯(PMA)刺激分化成巨噬样细胞后,流式细胞术分析各组HIV-1病毒感染率。以单独转染SAMHD1表达质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染SAMHD1与HIV-2/SIV Vpx表达质粒的细胞为实验组,转染后48h收获细胞,采用Western blotting法检测SAMHD1蛋白表达水平,免疫荧光检测法观察不同SAMHD1蛋白的细胞内定位。以单独转染LINE-1-GFP报告质粒的HEK293T细胞作为对照组,以共同转染LINE-1-GFP与SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用流式细胞术检测GFP阳性细胞率,代表SAMHD1对LINE-1转座子的活性。以单独转染IFN-luc报告质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染IFN-luc和SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用化学发光仪检测HEK293T细胞中荧光素酶的表达水平。结果:与阴性对照组比较,灵长类动物SAMHD1稳定表达的实验组HIV-1病毒感染率明显降低(P<0.01)。与对照组比较,实验组灵长类动物SAMHD1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。免疫荧光检测,灵长类动物SAMHD1蛋白均定位于细胞核中。与对照组比较,实验组GFP阳性细胞率明显降低,即SAMHD1对LINE-1转座子活性降低(P<0.05或P<0.01)。与对照组比较,实验组灵长类动物HEK293T细胞中荧光素酶表达水平明显降低(P<0.05)。结论:不同灵长类动物SAMHD1蛋白具有抵抗HIV-1病毒感染、抑制逆转录转座子LINE-1以及拮抗天然免疫系统产生IFN的作用。

BMAL1减轻H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞损伤机制研究

目的探讨脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1(BMAL1)通过核因子E2相关因子2(NRF2)调节活性氧(ROS)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体通路对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的心肌细胞损伤的影响。方法体外培养H9c2细胞和BMAL1稳定过表达的H9c2细胞,建立H_(2)O_(2)诱导的H9c2细胞损伤模型,并将细胞分为对照(Control)组、H_(2)O_(2)组、BMAL1过表达(BMAL1-OE)组、BMAL1过表达+H_(2)O_(2)(BMAL1-OE+H_(2)O_(2))组、BMAL1过表达+NRF2抑制剂(BMAL1-OE+ML385)组、BMAL1过表达+NRF2抑制剂+H_(2)O_(2)(BMAL1-OE+ML385+H_(2)O_(2))组。采用CCK-8法检测细胞活力,荧光探针2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯检测ROS生成,Western blot检测BMAL1、NRF2和NLRP3蛋白表达,酶联免疫吸附试验法检测白细胞介素(IL)-1β释放。结果与Control组相比,H_(2)O_(2)组H9c2心肌细胞活力减弱,ROS生成增多,BMAL1和NRF2蛋白表达水平降低,NLRP3蛋白表达水平升高,IL-1β释放增多(P<0.05);与H_(2)O_(2)组相比,BMAL1-OE+H_(2)O_(2)组H9c2心肌细胞活力升高,ROS生成减少,BMAL1和NRF2蛋白表达水平升高,NLRP3蛋白表达水平降低,IL-1β释放减少(P<0.05)。与BMAL1-OE+H_(2)O_(2)组相比,BMAL1-OE+ML385+H_(2)O_(2)组H9c2心肌细胞活力减弱,ROS生成增多,NLRP3蛋白表达水平升高,IL-1β释放增多(P<0.05)。结论BMAL1可减轻H_(2)O_(2)诱导的H9c2心肌细胞损伤,其机制可能与NRF2调节ROS/NLRP3炎症小体通路有关。

假基因POU5F1B对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨POU结构域5类转录因子1B基因(POU5F1B)对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其可能的机制。方法采用定时荧光定量PCR(QPCR)检测正常宫颈上皮End1/e6e7细胞株和宫颈癌细胞株(SiHa、HeLa和C33A)中POU5F1B的表达水平,选取POU5F1B表达量最高的细胞株分别转染POU5F1B特异性小干扰RNA(si-POU5F1B组)和阴性对照序列(si-NC组)。分别采用CCK-8实验、平板克隆形成实验和EdU实验观察细胞增殖情况,细胞划痕实验和侵袭实验观察两组细胞的迁移和侵袭情况,Western blotting实验检测OCT4蛋白的相对表达量,通过动物实验观察下调假基因POU5F1B对裸鼠体内移植瘤质量的影响。结果与End1/e6e7细胞株比较,假基因POU5F1B在宫颈癌SiHa、C33A、HeLa细胞株中的相对表达量分别为3.34±0.23、2.03±0.15和1.13±0.06,选取POU5F1B表达量最高的SiHa细胞进行后续实验。si-POU5F1B组假基因POU5F1B的相对表达量为0.2±0.012,明显低于si-NC组(P<0.01)。CCK-8实验显示,与si-NC组相比,si-POU5F1B组吸光值明显降低(P<0.05);平板克隆形成实验显示,si-POU5F1B组的克隆形成数为(173±15.27)个,低于si-NC组的(318±8.41)个(P<0.01)。EdU检测显示,si-POU5F1B组阳性细胞比例为(18±1.36)%,低于si-NC组的(34±2.63)%(P<0.01)。划痕实验显示,48 h后si-POU5F1B组的划痕愈合率为(45.60±2.27)%,低于si-NC组的(87.15±3.32)%(P<0.01);侵袭实验显示,si-POU5F1B组穿过侵袭下室的细胞数为(303±10.29)个,低于si-NC组的(933±11.88)个(P<0.01);Western blotting检测显示,下调POU5F1B表达后,其亲本基因OCT4的表达水平下降(P<0.05);在动物实验中,si-POU5F1B组裸鼠移植瘤质量为(203.50±54.83)mg,低于si-NC组的(578.06±84.66)mg(P<0.01)。结论下调假基因POU5F1B可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并抑制体内宫颈癌细胞生长,其机制可能与下调其功能基因OCT4的表达有关。

血清FOXO3a、NLRP3、sICAM-1水平在冠心病合并高尿酸血症患者中的意义

目的探讨冠心病合并高尿酸血症(HUA)患者叉头转录因子O亚家族成员3a(FOXO3a)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)水平变化的意义。方法选取河南科技大学第一附属医院2021年1月至2022年8月收治的156例冠心病患者为研究对象,根据尿酸水平分为HUA组(62例)和UA正常组(94例)。比较两组一般临床资料及FOXO3a、NLRP3、sICAM-1水平,分析FOXO3a、NLRP3、sICAM-1水平与临床资料中有统计学差异指标及UA水平相关性,采用logistic回归分析影响冠心病合并HUA的危险因素,以受试者工作特征(ROC)曲线分析FOXO3a、NLRP3、sICAM-1水平联合检测对冠心病合并HUA的诊断价值。结果HUA组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平高于UA正常组(P<0.05);HUA组FOXO3a、NLRP3、sICAM-1水平高于UA正常组(P<0.05);相关性分析发现,FOXO3a、NLRP3、sICAM-1水平与TC、TG、LDL-C、UA水平均呈正相关(P<0.05);logistic回归分析发现,TC(>5.04 mmol·L^(-1))、TG(>1.88 mmol·L^(-1))、LDL-C(>2.53 mmol·L^(-1))、FOXO3a(>4.65μg·L^(-1))、sICAM-1(>195.73μg·L^(-1))、NLRP3(>1322.12 ng·L^(-1))水平是冠心病患者合并HUA的危险因素(P<0.05);ROC分析发现,FOXO3a、sICAM-1、NLRP3水平联合诊断冠心病合并HUA的曲线下面积(AUC)为0.811,敏感度、特异度分别为95.16%、67.02%,优于各指标单一指标诊断,具有较高诊断效能(P<0.05)。结论FOXO3a、NLRP3、sICAM-1参与冠心病合并HUA发生过程,且在临床诊断冠心病合并HUA方面具有较高效能。