心脏转录因子Nkx2-5、GATA-4真核表达质粒的构建

目的:构建人类心脏特异性转录因子Nkx2-5、GATA-4的真核表达质粒,探讨Nkx2-5、GATA-4在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法:以质粒人脑c DNA为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2-5、GATA-4编码区序列。将真核表达载体pCDNA 3.1-HA、pCDNA 3.1-flag分别和Nkx2-5、GATA-4的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCDNA 3.1-HA-Nkx2-5、pCDNA 3.1-flag-GATA-4,转化至大肠杆菌,质粒抽提后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果:成功设计引物扩增出Nkx2-5、GATA-4基因编码区约1 kbp及1.3 kbp的目的片段,PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2-5、GATA-4基因序列。结论:成功构建了含有Nkx2.5、GATA4的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。

干扰miR-483-5p对骨关节炎软骨细胞增殖及炎症因子的影响

目的探讨miR-483-5p对骨关节炎软骨细胞增殖及炎症因子的影响及机制。方法分离培养骨关节炎软骨细胞,将其分为Con组、miR-483-5p inhibitor组、miR-483-5p inhibitor+LPS组;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞周期;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6水平;Western印迹检测蛋白表达。结果与Con组相比,miR-483-5p inhibitor组软骨细胞存活率明显升高,G0-G1期细胞所占比例明显降低,S期细胞所占比例明显升高,TNF-α、IL-6水平明显降低,TLR4、NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与miR-483-5p inhibitor组相比,miR-483-5p inhibitor+LPS组软骨细胞存活率明显降低,G0-G1期细胞所占比例明显升高,S期细胞所占比例明显降低,TNF-α、IL-6水平明显升高(P<0.05)。结论干扰miR-483-5p可抑制骨关节炎软骨细胞的增殖及炎症因子的释放,其机制可能与Toll样受体(TLR)4/核转录因子(NF)-κB信号通路有关。

miR-9-5p通过靶向UBE4B调节缺氧诱导转录因子1α泛素化介导瓦博格效应在胶质瘤细胞中的应用

目的探讨miR-9-5p在胶质瘤中对瓦博格效应的调控作用及机制情况。方法选择新疆医科大学第二附属医院2018年5月至2020年10月确诊的30例神经胶质瘤和癌旁组织样品。设立对照组、miR-9-5p过表达组及miR-9-5p抑制剂组,采用实时荧光定量PCR分别检测miR-9-5p的表达情况及其与糖酵解相关基因表达的相关性。构建异位肿瘤模型及体外细胞实验,采用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法、葡萄糖摄取分析、乳酸产生量检测及细胞活力检测判断miR-9-5p对胶质瘤及瓦博格效应的影响情况,采用双荧光素酶报告基因检测miR-9-5p与UBE4B的靶向性关系。结果miR-9-5p过表达组缺氧诱导转录因子1α(HIF1α)蛋白,葡萄糖转运蛋白同工型1(Glut1)、己糖激酶(HK2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而HIF1αmRNA水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。miR-9-5p抑制剂组HIF1α蛋白,Glut1、HK2、LDHA和VEGF mRNA表达显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而HIF1αmRNA水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,miR-9-5p过表达组显著增强了代谢及转移(P<0.05),而miR-9-5p抑制剂组显著降低了U251细胞中的葡萄糖摄取和乳酸生成(P<0.05)。miR-9-5p过表达组在处理24 h和48 h后的细胞活力显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而miR-9-5p抑制剂组与对照组比较,细胞活力在24 h和48 h出现明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-9-5p过表达组的肿瘤体积和湿重显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-9-5p过表达组的UBE4B的蛋白质水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而HIF1α及糖酵解相关基因(Glut1、HK2和LDHA)的表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-9-5p能够通过UBE4B/HIF1α途径调节胶质瘤的Warburg效应并促进胶质瘤的发生发展。

GATA-4、NKx2-5转录因子的研究进展

转录因子GATA家族是能与核酸共同序列（A/T）GATA（A／G）结合的细胞核转录因子。包括6个成员，即GATA-1、-2、-3、-4、-5和-6。1995年Huang等通过筛查人类心脏cDNA文库首次克隆出人类GATA-4cDNA，以后相继在人类肺、肝脏和小肠等器官中检测到GATA-4 mRNA和蛋白的表达。人们应用果蝇同源结构域（homeodomain，HD）寡核苷酸探针筛查果蝇cDNA文库，克隆出NK型同源盒基因。随后分离出一种与果蝇背侧血管，心脏发育密切相关的果蝇NK-2型基因tinman基因。GATA-4和NKx2-5是目前研究较多的与心脏发育密切相关的转录因子。

微小RNA-7-5p靶向调节锌指蛋白核转录因子4基因抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

目的探讨微小RNA(miR)-7-5p对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及锌指蛋白核转录因子4(KLF4)基因表达调控的影响。方法研究起止时间为2018年3-10月。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-7-5p在人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF及口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量。将miR-7-5p模拟物(miR-7-5p mimics)及阴性对照序列(mimics Control)分别转染至SCC25细胞,分为三组:Control组(未转染的SCC25细胞)、NC组(转染mimics Con-trol的SCC25细胞)、miR-7-5p组(转染miR-7-5p mimics的SCC25细胞)。以qRT-PCR检测miR-7-5p在SCC25细胞中的转染效果;MTT法检测miR-7-5p对SCC25细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-7-5p对SCC25细胞凋亡的影响;通过双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blotting)检测miR-7-5p对KLF4的靶向关系。结果miR-7-5p在3种口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量[(0.21±0.02)、(0.43±0.04)、(0.48±0.05)]明显低于人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF(1.00±0.09)(P<0.05);转染miR-7-5p mimics能够上调SCC25细胞中miR-7-5p的表达(P<0.05);miR-7-5p过表达能够明显抑制SCC25细胞增殖能力[Control组、NC组72 h吸光度(1.43±0.13)、(1.46±0.15)比miR-7-5p组(0.81±0.09)](P<0.05),并诱导细胞凋亡[Control组、NC组凋亡率(9.48±2.65)%、(10.21±3.02)%比miR-7-5p组(24.41±8.15)%](P<0.05);双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-7-5p过表达可抑制KLF4-Wt报告基因载体细胞相对荧光活性;qRT-PCR和Western blotting进一步证实了miR-7-5p能够靶向调节KLF4 mRNA和蛋白表达。结论miR-7-5p直接靶向调控KLF4基因的表达来抑制口腔鳞状细胞癌SCC25细胞增殖,诱导细胞凋亡。

肺癌组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白水平检测及其临床价值探讨

背景与目的:肺癌发病机制具有多样性,但一经确认,往往已错过最佳治疗时机,本文通过探讨肺癌组织和外周血中抑癌基因(p53)、蛋白基因产物(PGP9.5)、转录因子(SOX2)、肿瘤相关基因编码蛋白(GAGE7)、解旋酶(GBU4-5)和黑色素瘤抗原(MAGE A1)蛋白水平的相关性,同时分析其在肺癌诊疗中的应用价值。方法:回顾并分析2018年5月—2020年5月在复旦大学附属肿瘤医院确诊的100例肺癌患者的病历资料,临床TNM分期Ⅰ期25例,Ⅱ期45例,Ⅲa期30例;非小细胞肺癌80例,小细胞肺癌20例;取手术切除的肿瘤组织和癌旁组织,采用免疫组织化学染色法检测上述6种蛋白的水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)法检测其基因表达,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测外周血中6种蛋白的抗体阳性情况。结果:肿瘤组织中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05);将其与肿瘤的临床病理学特征进行相关分析发现,肿瘤组织和外周血中的p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平与肿瘤TNM分期和分化级别有关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤直径、病理学类型无关(P>0.05)。肿瘤组织中6种蛋白的表达水平与外周血清表达具有较好的一致性(P>0.05)。结论:肺癌肿瘤组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表达阳性与肿瘤TNM分期及分化级别密切相关。

转录因子OCT4、SOX2在胃癌中的表达及临床意义

目的观察POU5fl转录因子-4(OCT4)及性别决定基因相关转录因子-2(SOX2)在胃癌组织表达的变化及其与胃癌病理特征的相关性。方法 48例胃癌组织作为研究对象,48例胃正常组织作为对照(距离肿瘤病灶>10 cm)。利用免疫组化检测手段比较OCT4及SOX2在胃癌组织及胃正常组织的变化,分析其与胃癌各病理指标的相关性。结果 OCT4及SOX2在胃癌组织阳性表达率分别为75.0%及25.0%,胃正常组织分别为27.1%及64.6%,癌组织与正常组织比较差异均有统计学意义(P<0.005);OCT4与SOX2蛋白在癌组织表达呈负相关性(r=-3.29,P=0.002<0.05)。经过分析后发现OCT4在胃癌组织的表达与淋巴结转移和TNM分期及分化程度有关(P<0.05),SOX2在胃癌组织的表达与胃癌的TNM分期和淋巴结转移及分化程度有关(P<0.05)。结论胃癌的发生可能与OCT4升高、SOX2的下调有关,OCT4及SOX2的联合检测可作为预测胃癌发展的靶指标。

miR-139-5p在老年胃癌中的表达及其与患者临床病理特征和预后关系

目的:探讨miR-139-5p在老年胃癌中的表达及其与患者临床病理特征和预后关系。方法:选取我院收治的38例老年胃癌患者(年龄>65岁)为研究对象,采用Real-time PCR法检测患者癌组织、淋巴结和癌旁正常胃组织中miR-139-5p、转录因子4(TCF4)表达水平。应用免疫组织化学法检测胃癌组织和癌旁正常胃组织中TCF4蛋白表达水平。分析比较miR-139-5p、TCF4表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系。同时采用生物信息法分析TCGA数据库中胃癌患者的预后数据,比较TCF4高低表达组患者总生存(OS)和无疾病进展生存(DFS)是否存在差异。结果:正常胃组织和胃癌组织中miR-139-5p相对表达量分别为-3.06±1.43和-4.09±2.13,差异有统计学意义(P=0.016)。未转移淋巴结和转移淋巴结中miR-139-5p相对表达量分别为0.25±1.64和-1.59±1.67,差异有统计学意义(P=0.001)。转录因子4(TCF4)基因3’-UTR区域ACUGUAC序列与miR-139-5p 5’-UTR区域UGACAUC结合紧密。提示TCF4可能为miR-139-5p的靶基因。Real-time PCR结果显示,TCF4基因在胃癌组织和转移淋巴结组织中的表达水平显著高于对应的癌旁组织(P=0.036)和未转移淋巴结组织(P=0.027)。且癌组织中TCF4的表达水平与miR-139-5p呈负相关(r_(pearson)=-0.42,P=0.03)。免疫组化显示TCF4蛋白主要表达于细胞核和细胞浆,38例患者癌组织中TCF4蛋白阳性26例(68.4%),阴性12例(31.6%)。miR-139-5p表达水平与胃癌患者淋巴结转移(P<0.05)和肿瘤病理分级(P<0.05)有关。TCF4表达水平与胃癌患者淋巴结转移(P<0.05)和肿瘤浸润深度(P<0.05)有关。Log-rank检验显示,TCF4高表达组患者总生存(OS)显著低于TCF4低表达患者(HR=1.4,P=0.032),而高低表达组患者无疾病进展生存(DFS)差异无统计学意义(HR=1.4,P=0.094)。结论:miR-139-5p在老年胃癌患者中低表达,并可能通过靶向调控TCF4抑制肿瘤的进展。TCF4高表达与胃癌患者总生存期减低有关,并有望成为胃癌预后不良的分子标志物。

miR-138-5p靶向TCF4调节眼葡萄膜黑色素瘤细胞的恶性生物学行为

目的探讨miR-138-5p与转录因子4(TCF4)对眼葡萄膜黑色素瘤MuM-2B细胞恶性生物学行为的影响。方法miR-138-5p mimic和pcDNA-TCF4分别或共转染MuM-2B细胞,构建小鼠体内移植瘤模型。RT-qPCR检测细胞转染效率;生物信息学软件预测miR-138-3p和TCF4靶向位点;双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系;克隆形成实验检测细胞增殖;Transwell实验检测细胞侵袭能力;Western blot检测TCF4及上皮-间质转化(EMT)相关蛋白表达;免疫组化检测Ki67、VEGF、Vimentin在肿瘤组织中的表达。结果与对照组相比,转染组miR-138-5p和TCF4均升高(P<0.05),且miR-138-5p和TCF4是靶向关系。miR-138-5p过表达通过靶向TCF4抑制MuM-2B细胞增殖和侵袭力并下调E-cadherin和Vimentin蛋白表达量,上调N-cadherin蛋白表达量(P<0.05)。在体内移植瘤中,miR-138-5p过表达减轻肿瘤重量(P<0.05),miR-138-5p过表达下调Ki67、VEGF、Vimentin在肿瘤组织中阳性细胞率(P<0.05)。结论miR-138-5p过表达可下调TCF4水平,进而抑制葡萄膜黑色素瘤MuM-2B细胞增殖、侵袭及EMT。

同型半胱氨酸对核因子-κB活性及白三烯E_4和前列腺素E_2合成水平的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人结肠腺癌(Caco-2)细胞中白三烯E_4(LTE_4)、前列素E_2(PGE_2)合成水平和核转录因子-κB(NF-κB)活性的影响。方法在Caco-2细胞中加入不同浓度(0、10、20、50μmol/L)Hcy作用不同时间(1、3、6 h),采用MTT法和检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,观察Hcy对Caco-2细胞生长活性的影响;通过检测Caco-2细胞跨膜电阻(TEER)和样品中荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)浓度,观察Hcy对Caco-2细胞通透性的影响;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定Caco-2细胞上清液中LTE_4和PGE_2合成水平;采用凝胶迁移实验(EMSA)测定Caco-2细胞中NF-κB活性变化。结果随Hcy作用时间延长及作用浓度增加,Caco-2细胞活性明显受到抑制;随Hcy作用浓度增加,Caco-2细胞TEER明显降低,FITC跨膜转运量明显增加,细胞上清液中LTE_4和PGE_2水平明显升高(P<0.05);Hcy(50μmol/L)处理组细胞中NF-κB活性增强,且呈时间依赖性(1、3、6 h)。结论 Hcy通过激活NF-κB信号通路,促进Caco-2细胞肠黏膜LTE_4和PGE_2合成,引起肠黏膜炎症损伤。

棉花抗枯萎病相关基因GhERF5-4D的克隆及功能分析

研究陆地棉ERF(ethylene-responsive factor)转录因子基因GhERF5-4D在棉花抗枯萎病中的作用,为棉花抗病分子机制及棉花抗病育种研究奠定基础。以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中的差异表达基因为探针,结合棉花全基因组数据库获得1个ERF转录因子基因GhERF5-4D,并进一步利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术和病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术研究枯萎病菌胁迫和激素处理后基因GhERF5-4D的表达特征及其在棉花抗病过程中的作用。结果表明,GhERF5-4D(GenBank:MF093148)位于陆地棉D07染色体上,开放阅读框(open reading frame,ORF)为663 bp,编码220个氨基酸,仅含1个AP2结构域且无内含子,属于ERF亚族。该基因的表达特征在棉花抗感枯萎病品种及不同激素胁迫处理中存在显著差异,其在抗病品种中为上调表达,在感病品种中为下调表达;乙烯、茉莉酸甲酯处理后,该基因上调表达,而水杨酸处理后则下调表达。GhERF5-4D基因沉默后并进行枯萎病菌接种实验,结果表明,与对照相比,沉默株系更感病。对下游抗病相关防卫基因表达特征进行分析,发现PR2、PR4、PR5、NPR1、ERF1相对表达量均低于对照,而WRKY70相对表达量高于对照。GhERF5-4D能够响应枯萎病菌胁迫,并通过参与乙烯、茉莉酸途径调控下游相关抗病防卫基因提高棉花对枯萎病抗性。

miR-21-5p靶向JAK/STAT信号通路抑制Th1细胞极化

目的探讨miR-21-5p对1型辅助性T细胞(Th1细胞)极化相关信号通路的调控作用。方法提取小鼠脾单个核细胞,用免疫磁珠阴性分选试剂盒分离初始(naive)CD4^(+)T细胞,用抗小鼠CD3ε,CD28和白细胞介素4(IL-4)单克隆抗体及小鼠IL-12和IL-2混合因子诱导体系诱导初始CD4^(+)T细胞向Th1细胞极化,同时转染miR-21-5p模拟物或模拟物对照,分别命名为Th1诱导组、诱导+模拟物对照组和诱导^(+)miR-21-5p模拟物组,72 h后用流式细胞术检测CD4和干扰素γ(IFN-γ)双阳性(CD4^(+)IFN-γ^(+))细胞百分比;用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Th1细胞极化相关关键转录因子和细胞因子mRNA表达水平;Western印迹法检测Th1细胞极化相关通路关键蛋白及其磷酸化水平。结合双荧光素酶报告系统验证miR-21-5p作用靶标关键细胞因子IFN-γ、信号通路受体IL-12受体β_(1)(IL-12Rβ_(1))和信号转录与转录激活因子1(STAT1)的表达。结果经免疫磁珠分选获得高表达CD62L的初始CD4^(+)T细胞。与Th1诱导组和诱导+模拟物对照组相比,诱导+miR-21-5p模拟物组CD4^(+)IFN-γ^(+)细胞百分比显著降低(P<0.01);Th1细胞极化相关Janus激酶(JAK)/STAT信号通路关键转录因子STAT1(P<0.01)、STAT4(P<0.05)和T盒21转录因子(T-bet)(P<0.01)mRNA表达显著下调,IFN-γ(P<0.01)和IL-12Rβ_(1)(P<0.05)mRNA表达水平亦显著下调,同时STAT1和STAT4蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01)。结合双荧光素酶报告系统结果表明,miR-21-5p模拟物可分别特异性靶向结合IFN-γ(P<0.01),IL-12Rβ_(1)(P<0.01)和STAT1(P<0.05)基因的3′-非翻译区,而对应靶向位点突变后miR-21-5p模拟物不影响其表达。结论miR-21-5p可靶向下调IFN-γ,IL-12Rβ_(1)和STAT1表达,抑制IL-12和IFN-γ介导的JAK/STAT信号通路活化,从而抑制Th1细胞极化。

喉癌组织中miR-340-5p、c-Myc、TCF-4的表达及临床意义

目的研究喉癌组织中微RNA(miR)-340-5p、原癌基因c-Myc及转录因子4(TCF-4)的表达,分析三者表达的相关性及与喉癌患者临床病理特征的关系。方法选取2015年2月至2020年11月在盘锦辽油宝石花医院诊治的102例喉癌患者为研究对象。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法检测102例喉癌患者癌组织及癌旁组织中miR-340-5p、c-Myc、TCF-4的表达,统计分析三者表达与临床病理特征关系,Pearson线性相关分析三者表达的相关性。结果与癌旁组织比较,癌组织中miR-340-5p的相对表达量均明显较低,而c-Myc、TCF-4的相对表达量明显较高(P<0.05)。不同肿瘤分期的喉癌组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05),不同性别、年龄、分型、肿瘤分化程度及是否伴有淋巴结转移比较,差异无统计学意义(P<0.05)。miR-340-5p和c-Myc、TCF-4的表达呈负相关(r=-0.549、-0.452,P<0.05)。结论喉癌癌组织中miR-340-5p表达降低,而c-Myc、TCF-4表达上调,miR-340-5p、c-Myc及TCF-4均与喉癌肿瘤分期有关,参与喉癌的发生发展。

OCT4及其假基因POU5F1B在子宫内膜腺癌中的表达及临床意义

目的分析八聚体结合转录因子4(OCT4)及其假基因POU结构域5类转录因子1B(POU5F1B)在子宫内膜腺癌中的表达情况,并探讨两者在子宫内膜腺癌中的临床意义。方法纳入60例子宫内膜腺癌患者,并收集其子宫内膜腺癌组织,同时纳入50例子宫内膜良性病变患者,并收集其增生期子宫内膜组织。采用实时荧光定量PCR检测组织中的OCT4 mRNA、POU5F1B mRNA的表达水平。用免疫组织化学法检测组织中OCT4蛋白的阳性表达情况。分析OCT4蛋白阳性表达率与子宫内膜腺癌患者临床病理参数的关系。结果子宫内膜腺癌组织中POU5F1B mRNA、OCT4 mRNA的表达水平均高于增生期子宫内膜组织(均P<0.05)。子宫内膜腺癌组织中的OCT4蛋白高表达率高于增生期子宫内膜组织(P<0.05)。临床分期为Ⅱ~Ⅳ期、肌层浸润深度>1/2、有淋巴结转移的子宫内膜腺癌患者的OCT4蛋白高表达率分别高于临床分期为Ⅰ期、肌层浸润深度≤1/2、无淋巴结转移的患者(均P<0.05)。结论OCT4及其假基因POU5F1B在子宫内膜腺癌中的表达上调,并且OCT4蛋白的表达情况与患者的临床分期、浸润深度、淋巴结转移有关。假基因POU5F1B可能通过调控OCT4来影响子宫内膜腺癌的发生和发展。

人重组C5a对微血管内皮细胞表达组织因子的影响

目的研究人重组C5a（human—recombinant C5a，rh—C5a）对人肺微血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs）表达组织因子（tissue factor，TF）的影响。方法用不同浓度（100、200、300μg／L）的rh—C5a刺激HPMECs 8h和同一浓度（200μg／L）的rh—C5a刺激HPMECs 4、8、12h。采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测TF基因和蛋白表达情况。选取刺激浓度为200μg／L，作用时间为8h组进行C5a反义肽R4干预，相同的方法检测TF基因和蛋白表达并用免疫组织化学方法定性检测NF—κB p65变化。结果正常的HPMECs基本不表达TF，rh—C5a刺激后，TF mRNA和蛋白开始表达，刺激的12h内呈现出时效和量效关系（P〈0．05）。用C5a反义肽R4干预后，TF mRNA水平降至未干预组的68％（P〈0．05），蛋白表达也有下降。免疫组织化学示p65在胞浆内明显增加并有部分人核。结论在刺激的12h内，C5a对HPMECs表达TF存在时间-浓度的依赖关系，机制可能是C5a与其受体结合后，通过细胞信号转导途径活化NF—κB，从而调节基因和蛋白的表达。

4′,5-二羟基-7-哌嗪甲氧基-8-甲氧基黄酮通过Bclaf1诱导肝癌细胞线粒体凋亡的作用机制研究

目的探讨4′,5-二羟基-7-哌嗪甲氧基-8-甲氧基黄酮(4′,5-dihydroxy-7-piperazine methoxy-8-methoxy flavone,DMF)通过Bclaf1诱导肝癌细胞线粒体凋亡的作用机制。方法利用CCK-8法检测DMF对人肝癌细胞增殖的影响;Annexin-V/FITC双染流式细胞仪检测DMF作用后人肝癌细胞凋亡率的变化;JC-1荧光探针探究DMF对肝癌细胞线粒体膜电位的作用;免疫荧光检测DMF对人肝癌细胞中Bclaf1表达情况和定位;CRISPR-Cas9技术敲除Bclaf1基因;Western blot检测DMF作用后人肝癌细胞线粒体凋亡相关蛋白的表达以及Bclaf1表达情况。结果DMF对人肝癌细胞的增殖有抑制作用,并具有浓度-时间依赖性,DMF作用后肝癌细胞凋亡率增加,线粒体膜电位下降,线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值降低,Cleaved caspase 3、Cyt-c表达量增多。Bclaf1主要定位于细胞核内,在细胞质中有少量分布;DMF作用后Bclaf1的表达量降低,将Bclaf1敲除后,与空白对照组比较,DMF+sgRNA组线粒体凋亡现象明显,Bcl-2/Bax比值更低。结论DMF抑制Bclaf1的表达,诱导肝癌细胞线粒体凋亡。

假基因POU5F1B对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨POU结构域5类转录因子1B基因(POU5F1B)对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其可能的机制。方法采用定时荧光定量PCR(QPCR)检测正常宫颈上皮End1/e6e7细胞株和宫颈癌细胞株(SiHa、HeLa和C33A)中POU5F1B的表达水平,选取POU5F1B表达量最高的细胞株分别转染POU5F1B特异性小干扰RNA(si-POU5F1B组)和阴性对照序列(si-NC组)。分别采用CCK-8实验、平板克隆形成实验和EdU实验观察细胞增殖情况,细胞划痕实验和侵袭实验观察两组细胞的迁移和侵袭情况,Western blotting实验检测OCT4蛋白的相对表达量,通过动物实验观察下调假基因POU5F1B对裸鼠体内移植瘤质量的影响。结果与End1/e6e7细胞株比较,假基因POU5F1B在宫颈癌SiHa、C33A、HeLa细胞株中的相对表达量分别为3.34±0.23、2.03±0.15和1.13±0.06,选取POU5F1B表达量最高的SiHa细胞进行后续实验。si-POU5F1B组假基因POU5F1B的相对表达量为0.2±0.012,明显低于si-NC组(P<0.01)。CCK-8实验显示,与si-NC组相比,si-POU5F1B组吸光值明显降低(P<0.05);平板克隆形成实验显示,si-POU5F1B组的克隆形成数为(173±15.27)个,低于si-NC组的(318±8.41)个(P<0.01)。EdU检测显示,si-POU5F1B组阳性细胞比例为(18±1.36)%,低于si-NC组的(34±2.63)%(P<0.01)。划痕实验显示,48 h后si-POU5F1B组的划痕愈合率为(45.60±2.27)%,低于si-NC组的(87.15±3.32)%(P<0.01);侵袭实验显示,si-POU5F1B组穿过侵袭下室的细胞数为(303±10.29)个,低于si-NC组的(933±11.88)个(P<0.01);Western blotting检测显示,下调POU5F1B表达后,其亲本基因OCT4的表达水平下降(P<0.05);在动物实验中,si-POU5F1B组裸鼠移植瘤质量为(203.50±54.83)mg,低于si-NC组的(578.06±84.66)mg(P<0.01)。结论下调假基因POU5F1B可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并抑制体内宫颈癌细胞生长,其机制可能与下调其功能基因OCT4的表达有关。

转录因子GATA-4，-5，-6在中国人群先天性心脏病患儿中的突变筛查

目的了解GATA-4，-5，-6基因突变与先天性心脏病（CHD）的关系，为CHD患儿的早期预防及遗传咨询提供支持。方法收集室间隔缺损患儿66例、房间隔缺损患儿84例及单纯性心脏圆锥动脉干畸形患儿48例的临床资料和外周静脉血样本，共198例CHD患儿；并以300例健康者为健康对照。应用聚合酶链反应（PCR）扩增GATA-4，-5，-6基因的全部外显子和两侧部分内含子，PCR产物纯化后以自动测序仪正反向测序。应用BLAST程序将所测GATA-4，-5，-6基因序列与GenBank中已知的序列进行比对，检测基因突变。结果在1例室间隔缺损患儿和1例单纯性心脏圆锥动脉干畸形即永存动脉干畸形患儿中发现转录因子GA弼4相同的杂合子突变，第4外显子区O．799G〉A，突变使转录因子蛋白第267位的缬氨酸被蛋氨酸取代即P．V267M，多物种氨基酸序列比对结果显示该突变氨基酸在进化上高度保守。转录因子GATA-5，-6在本组CHD患儿中筛查未发现突变。结论CHD发生机制复杂，转录因子甜拟4突变与人类CHD的发生相关，转录因子GATA-4可能是人类CHD的易感基因。

Nkx2-5、GATA-4转录因子在心脏发育中的作用

心脏是胚胎发育过程中最先形成的器官。导致心脏形成和发育的确切机制目前还不清楚。转录因子以组织特异性和定量的方式调节其它器官形成和发育 ,从而在胚胎发育过程中起主要的调节作用。转录因子在心脏发育过程中可以调节心肌特异性基因的表达。